JP2016528893A - 糖の取り込みのための促進拡散を用いるコハク酸および他の化合物の生産方法 - Google Patents
糖の取り込みのための促進拡散を用いるコハク酸および他の化合物の生産方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2013年7月23日に出願した米国仮特許出願第61/857,300号に基づく優先権を主張する。
本発明は、糖含有原料の使用においてそれらの効率を高めるように修飾され得る生体触媒(細菌および他の微生物)を用いて、特定のおよび汎用性の有機化合物を生産する技術分野に属する。より具体的には、本発明は、コハク酸および他の化合物の生物学的生産のための糖類の輸送および代謝を含む機能をコード化する遺伝子の遺伝子修飾に関する。
多くの有機化合物が、現在、石油化学原料から製造されている。再生可能な原料を用いて生物学的発酵プロセスを介して、これらの石油化学を利用している有機化合物の多くを生産することへの関心が高まっている。再生可能な原料から誘導することができる有機化合物のリストには、α, ω−二酸(コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、グルカル酸、マロン酸、およびマレイン酸)、2,5−フランジカルボン酸、プロピオン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、3−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ならびに1,4−ブタンジオール(米国特許出願公開第20090047719号)、1,3−ブタンジオール(米国特許出願公開第20090253192号)、および2,3−ブタンジオールのようなブタンジオール類が含まれる。アミノ酸、ビタミン類、アルコール類(例えば、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、イソブタノール、および高級アルコール)、脂肪酸類、脂肪酸のエステル類、炭化水素類、イソプレノイド類、テルペン類、カロテノイド類、アミン類を含むが、これらに限定されない多くの他のタイプの有機化合物もまた、再生可能な原料を用いて生産可能である。任意のこれらの化合物を、本明細書中“所望の化合物”と言う。多くのこれらの所望の化合物のための発酵プロセスが開発されているが、石油化学プロセスに対抗するために、例えば、生成物の力価(1リットル当たりの生成物のグラム数での終濃度)および生成物の収量(グルコースなどの炭素源1グラム当たりの生成物のグラム数)を改善するため、および酢酸などの望ましくない副生成物の力価を減少させるための、発酵の全体的な経済性を改善するための一定の必要性がある。
全ての文献は、この明細書を読む者の便宜のために列記される。それぞれの文献は、引用によりその全体を本明細書に包含される。
本発明は、商業的に重要な製品、例えば、それに限定されないが、特定の化合物および汎用性の化合物の発酵生産を改善するためのグルコースの促進拡散を用いるための生体触媒(例えば、遺伝子的に操作された微生物)および方法を提供する。具体的には、本発明は、糖を含む再生可能な原料を用いる、有機酸、アミノ酸および他の生化学物質の生合成経路において生化学的中間体としてPEPを有する、該化合物の発酵生産に有用である。具体的な例として、本発明は、糖の促進拡散を使用するように構成されている生体触媒を用いる、グルコース、フルクトース、またはスクロースを含む再生可能な原料からのコハク酸の発酵生産に有用である。本発明の原理は、発酵により生産することができる多くの他の所望の化合物、特に、フマル酸、リンゴ酸、グルタミン酸、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸、アスパラギン酸誘導体、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)、ならびにビタミン類およびcis, cis−ムコン酸などの中心的芳香族経路における中間体から誘導される化合物のような、TCAの中間体化合物またはその誘導体にも適用することができる。
表2は、500mlの微好気性発酵槽内でのAC15株の赤色変異体によるコハク酸の生産を示す。
表3は、500mlの微好気性発酵槽内でのSS8の2つの単離株によるコハク酸の生産を示す。
表4は、20リットルの微好気性発酵槽内でのYSS41によるコハク酸の生産を示す。
表5は、500ミリリットル微好気性発酵槽でのMH141によるコハク酸の生産を示す。
表6は、大腸菌株KJ122およびYSS41の両方に最適化された通気条件下での、20リットルの発酵槽中での両大腸菌によるコハク酸の生産を示す。
定義。用語“例えば”または“のような(などの)”が用いられるとき、次に記載される用語は、開示されるアイデアや概念のための例示であることを意味する。その後に記載される項目は、アイデアや概念の一般化に該当し得る任意の他の特定のアイテムまたは例示が包含されることを意味するため、所定の例に限定されることを意味しない。任意の所定の化合物について、該化合物の塩を生産するのがより適当であってよく、例えば、コハク酸は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムなど塩としてpH7付近で生産され得るが、リシンは、塩酸塩、硫酸塩、重炭酸塩などとして生産され得る。このように、本明細書中、化合物が命名されたとき、該化合物の任意の塩が包含されることを意味し、塩が命名されるとき、その遊離酸または遊離塩基も包含されることを意味する。従って、例えば、“コハク酸塩”は、“コハク酸”およびコハク酸塩を包含することを意味し、そして“酢酸塩”は、“酢酸”および酢酸塩を包含することを意味する。
ザイモモナス・モビリスCP4由来の遺伝子群からのglfおよびglk遺伝子を含むKJ122の誘導体であるAC15のコンストラクション
DNAおよびプラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、形質転換、ならびに染色体挿入の全ての操作を、当技術分野で周知の標準的方法により実行した。DNA配列をクローニングし、天然で容易に見出されない新しい組み合わせを形成するために、それらの配列を相互に連結し得ることがよく知られている。制限酵素およびDNAリガーゼを用いる従来法に加えて、酵母リコンビニアリング技術を用いる新規方法、所謂、インビトロでのDNAスプライシング法である“ギブソン法”または他の任意の適当な方法が、かかる新規のDNA配列を構築するために使用可能である。必要とされるDNA断片は、クローンのライブラリーから、または適当なテンプレートDNAからのPCRにより入手可能である。多くの所望のDNA配列を設計することができ、化学前駆体から合成可能であることもまた理解される。このようなサービスは、多くの企業、例えば、DNA2.0およびGeneArt(Invitrogen)により、供給されている。
AC15株ならびに親株KJ122は、コハク酸を生産する
KJ122株およびAC15株を、グルコース供給バッチシステムを含む最少培地を用いて、39℃にて、7リットルの発酵槽中、微好気性条件下で増殖させた。3リットルの開始容量は、第一リン酸カリウム(18mM)、硫酸マグネシウム(2mM)、ベタイン(1.33mM)、微量必須元素、消泡剤204(8ppm)および25g/lのグルコースを含んだ。pHを最初にpH7.0に調整し、その後、pH6.5で維持して、下記の水酸化アンモニウム/重炭酸アンモニウム溶液の添加により酸が生じた。150mlの接種材料(inocula)を、グルコースが20g/lであり、塩化カルシウムが0.1mMの終濃度で添加されること以外、好気的に、かつ上記の培地と同様の最少培地を含んで増殖させた。撹拌を750RPM(毎分当たりの回転数)に設定した。グルコースを5g/lに低減したとき、650g/lのグルコース供給を開始し、グルコース濃度を約5g/l以下に維持することを目的とした速度で維持した。中和に使用されるストック溶液は、水酸化アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムの両方を含んでいた(7N NH4OHおよび3M NH4HCO3)。AC15を35ml/分で通気し、一方、KJ122は、通気性の滅菌膜フィルターを通して周囲空気で平衡化されたヘッドスペースに存在した空気以外の空気を提供されなかった。これらは、それぞれの株にうまく機能することが示されていた条件であった。48時間のサンプルからの糖、コハク酸および副生成物を、HPLCによりアッセイした。平均化複製の結果を表1に示す。AC15は、親株KJ122とほぼ同じ力価で生産するが、酢酸副生成物は顕著に低く、グルコース収量はAC15より高かった。
AC15由来の自発的な“赤色変異体”
KJ122は、MacConkey ラクトースプレート(Beckton−Dickinson, Franklin Lakes, NJ)上の赤色コロニーの形成により証明される通り、ラクトースを発酵することができる。しかしながら、AC15は、MacConkey ラクトースプレート上で“白色”(ベージュ)コロニーを生じることにより証明されるとおり、ラクトースを発酵しない。AC15のこの白色コロニー表現型は、非リン酸化型EIIAGlcタンパク質の結合およびそれによるラクトースパーミアーゼ(LacY)の阻害の結果である。この白色コロニー表現型は、EIIAGlcをリン酸化するのに必要な酵素が存在しないため、ptsHIを欠く全ての株に存在し、その結果として、細胞内に存在する全てのEIIAGlcは、非リン酸化型のままである。従って、意外にも、大腸菌ptsHI変異体は、ラクトースが大腸菌におけるPTSシステムにより取り込まれていなくても、表現型Lac−である。
ザイモモナス・モビリスglk遺伝子は、大腸菌におけるglf遺伝子の機能に必須ではない
プラスミドpSS2を、pAC19について上記の方法と同様の方法を用いて構築した。pSS2とpAC19との違いは、Z.モビリスglk遺伝子が人工オペロンから欠失されていることだけである。他の面において、例えばベクター骨格、glfのプロモーター駆動発現、人工オペロンのtdc隣接配列への組み込み、および種々の構成要素の配向において、pSS2はpAC19と同様である。pSS2のDNA配列を配列番号5として示す。
AC15株の代謝的進化
実施例3に上記の通り、AC15株は、7リットルの発酵槽中、親KJ122よりも高い通気性レベルを確保することが好ましかった。より少ない空気で増殖できるAC15の誘導体を得るために、AC15を、500mlの発酵槽中、開始容量200mlで、意図的に通気することなく、代謝的進化を行った。条件は、酸素を除去しなかったため、微好気性であった。少量の空気が進化の過程で発酵容器に漏れると仮定した。増殖条件は実施例3に記載のとおりである。増殖の48時間後、培養物を、200mlの新鮮な培地を含む新鮮な発酵槽中で1:100に希釈し、その後、この工程を40回繰り返した。これらの新鮮な培地への接種のそれぞれを、“転移(transfer)”と呼ぶことにする。従って、株を、新鮮な培地に計41回移した。各転移は、細胞分裂の約7世代に相当する。最後の転移からの培養液のサンプルをMacConkeyラクトース寒天ペトリ皿に植菌し、単一の白色コロニーを選択し、YSS41と命名した。
crr遺伝子における変異に対するYSS41の安定化
MacConkeyラクトースプレートに植菌したとき、YSS41は、未だ、solid redタイプおよびfried egg redタイプの両方の赤色変異体を生じた。crr遺伝子を、各タイプの1つの分離株について配列決定した。fried eggタイプの株MYR222は、野生型crr遺伝子配列を有していた。solid redタイプのMYR223は、crrオープンリーディングフレーム内に挿入された挿入要素を有していた。挿入要素のDNA配列は、IS186のそれと一致した。従って、AC15赤色変異体について確立されたパターンは、YSS41赤色変異体にも適用されることが明らかになった。500mlの微好気性発酵槽において、実施例4の通りに増殖させたところ、MYR222は、YSS41と同様の性能を示すが、MYR223は、性能が悪かった(表5参照)。従って、集団内のsolid red変異体の蓄積による性能の低下の可能性が、株YSS41を用いるときの可能性として残った。
YSS41は、代謝的進化中に、glf、glkカセットにおける変異を獲得した
AC15およびYSS41におけるglf、glk発現カセットのDNA配列を決定した。該領域をPCRにより増幅させ、得られたフラグメントを、ジデオキシ鎖終結法によって、glfおよびglk遺伝子ならびに200塩基以上の上流および下流の配列を含んで配列決定した。pAC19の塩基4976から7920に対応する配列決定された領域を配列番号1に示す。YSS41の進化中に獲得された2つの変異が見出された。第一の変異は、配列番号1の7742番目の塩基のGからAへの変化であった。この塩基は、glfオープンリーディングフレームのすぐ上流の、glf、glk mRNA転写物の5’非翻訳領域にあり、glf mRNA(メッセンジャーRNA)における、ATG開始コドンの22塩基上流、または転写の開始部位の15塩基下流でのCからUへの変化をもたらす。この変異は、glfオープンリーディングフレームの翻訳速度を増減すると予期される。第二の変異は、配列番号1の6173番目の塩基のGからAへの変化である。この塩基は、glkオープンリーディングフレームのすぐ上流の5’非翻訳領域にあり、glk mRNAにおけるATG開始コドンの15塩基下流でのCからUへの変化をもたらす。この変異は、glkオープンリーディングフレームの翻訳速度を増減すると予期される。従って、YSS41の進化は、glfオープンリーディングフレームとglkオープンリーディングフレームのより最適な発現バランスをもたらし、結果として、親株AC15を上回る増殖および性能の株をもたらした。
YSS41についての空気流量の最適化後の、KJ122およびYSS41の発酵
親株KJ122に最適な空気流量は、20リットルの発酵槽において、25ml/分であると決定されている。25ml/分の空気流量では、YSS41株は、KJ122と比較したとき、より良好なコハク酸力価および収量を示した。YSS41株のコハク酸収量および力価のさらなる改善が、空気流量を50ml/分に増加することにより得られた。従って、コハク酸収量および力価を参照してYSS41株について最適な空気流量は、KJ122のそれとは異なると考えられる。表6は、各株について最適化された空気流条件下での、20リットルの発酵槽での発酵の結果を示す。YSS41は、力価、収量および副産物である酢酸の形成において親KJ122を上回った。該発酵の開始容量は9500mlであった。グルコースを供給し、塩基で中和後、最終容量は12500mlであった。
Claims (33)
- 1リットル当たり30グラム以上の所望の化合物を生産する細菌であって、該所望の化合物の生合成中間体の1つがホスホエノールピルビン酸であり、該細菌が、糖の促進拡散において機能するタンパク質をコード化する少なくとも1つの外来遺伝子を含む、細菌。
- 細菌が、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・アサイ、アクロモバクター・デルマーベ、アクロモバクター・ビスコーサス、アクロモバクター・ラクティカム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アルカリゲネス・フェカリス、アースロバクター・シトレウス、アースロバクター・ツメセンス、アースロバクター・パラフィネウス、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス、アースロバクター・オキシダンス、オーレオバクテリウム・サペルダエ、アゾトバクター・インディカス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム(divaricatum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・グロボサム、ブレビバクテリウム・フスカム、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム・ヘルコルム、ブレビバクテリウム・プシルム、ブレビバクテリウム・テスタソイム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、ブレビバクテリウム・リネン、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ、コリネバクテリウム・アセトフィラム、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、エンテロバクター・アエロゲネス、エルウィニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラ、エルビニア・ヘルビコーラ、エルウィニア・クリサンテミ、フラボバクテリウム・ペレグリナム、フラボバクテリウム・フカタム、フラボバクテリウム・アウランティナム、フラボバクテリウム・レナヌム、フラボバクテリウム・スワネンセ、フラボバクテリウム・ブレーベ、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム、ミクロコッカス種CCM825、モルガネラ・モルガニ、ノカルジア・オパカ、ノカルジア・ルゴサ、プラノコッカス・ユーシナタス、プロテウス・レッゲリ、プロピオニバクテリウム・シェルマニ、シュードモナス・シンキサンサ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オヴァリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレン(mucidolens)、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ロドコッカス・エリスポリ、ロドコッカス・ロドクラウス、ロドコッカス種ATCC 15592、ロドコッカス種ATCC 19070、スポロサルシナ・ウレアエ、黄色ブドウ球菌、ビブリオ・メチニコフィイ、ビブリオ・チロゲネス、アクチノマヅラ・マヅレ、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス、キタサトスポリア・パルロサ、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニアエ、ストレプトマイセス・アンチビオチクス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・ラベンジュレ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、アエロモナス・サルモニシダ、バチルス・プミルス、バチルス・サーキュランス、バチルス・チアミノリチカス、エシェリヒア・フロインディ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム、セラチア・マルセッセンス、サルモネア・チフィムリウム、サルモネラ・ショットムレリ、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンスおよびキサントモナス・シトリからなる群より選択される、請求項1に記載の細菌。
- 細菌が、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス(Mannhemia succiniproducens)およびアネロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンスからなる分より選択される、請求項1に記載の細菌。
- 該所望の化合物が、コハク酸、フマル酸、グルカル酸、マロン酸、マレイン酸、2,5−フランジカルボン酸、プロピオン酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、3−ヒドロキシブチロラクトン、ならびに1,4−ブタンジオール、1,3−ブタンジオールおよび2,3−ブタンジオールなどのブタンジオール類からなる群より選択される、請求項1に記載の細菌。
- 該所望の化合物がコハク酸である、請求項1に記載の細菌。
- 該所望の化合物が、cis,cis−ムコン酸である、請求項1に記載の細菌。
- 該所望の化合物が芳香族化合物である、請求項1に記載の細菌。
- 細菌がPTS−細菌株である、請求項1に記載の細菌。
- 細菌が、野生型株と比較してホスホトランスフェラーゼ活性レベルを低下されている、請求項1に記載の細菌。
- 糖取り込みのためのホスホトランスフェラーゼシステムにおいて機能するタンパク質をコード化する1つまたはそれ以上の遺伝子における変異または欠失をさらに含み、該変異または欠失遺伝子がcrr遺伝子以外である、請求項1に記載の細菌。
- プロトン共輸送体を用いて機能する糖取り込み体をコード化する遺伝子における欠失をさらに含む、請求項10に記載の細菌。
- 該変異または欠失遺伝子が、ptsH遺伝子またはその相同体である、請求項10に記載の細菌。
- 該変異または欠失遺伝子が、ptsI遺伝子またはその相同体である、請求項10に記載の細菌。
- 該変異または欠失遺伝子が、ptsH、ptsI、ptsHの相同体およびptsIの相同体からなる群より選択される、請求項10に記載の細菌。
- 細菌が、galP−細菌株である、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子が複製プラスミド上に含まれる、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子が宿主染色体中に組み込まれる、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子がglf遺伝子である、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子がglf遺伝子およびglk遺伝子である、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子がglf遺伝子およびfrk遺伝子である、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子が酵母に由来する、請求項1に記載の細菌。
- 該外来遺伝子または複数の遺伝子が、ザイモモナス・モビリス株に由来する、請求項1に記載の細菌。
- 該細菌が最少培地中で増殖する、請求項1に記載の細菌。
- 該細菌が、1リットル当たり所望の化合物を64グラム以上生産する、請求項1に記載の細菌。
- 該細菌が、1リットル当たり所望の化合物を83グラム以上生産する、請求項1に記載の細菌。
- 機能的crr遺伝子またはcrr遺伝子の機能的相同体の2以上のコピーを含む、細菌。
- 最少発酵培地中で請求項1から26のいずれか一項に記載の細菌を増殖させる工程、および要すれば、該発酵培地から該化合物を精製する工程を含む、所望の化合物を生産するための方法。
- 糖の促進拡散において機能するタンパク質をコード化する少なくとも1個の外来遺伝子を含む細菌を増殖させる工程、
最少発酵培地中、1リットル当たり少なくとも60グラムのコハク酸および4.2グラム未満の酢酸を生産する工程、および
要すれば、該発酵培地からコハク酸を精製する工程
を含む、コハク酸の生産方法。 - 糖の取り込みのために促進拡散を用いるように操作された細菌株から生産される所望の化合物の力価および収量を改善するための方法であって、
親株を新鮮な液体培地中に連続的に移す工程、
得られた培養液をペトリプレート上の単一コロニーのために播種する工程、および
単一コロニーを選択する工程
を含む、方法。 - glf−glkオペロンを含む、糖の取り込みのために促進拡散を用いるように操作された細菌株であって、該細菌株が、コハク酸生産のための改善された力価および収量のために進化し、glf−glkオペロンに1つまたはそれ以上の変異をさらに含む、細菌株。
- 該1つまたはそれ以上の変異が、該glfまたはglk遺伝子のいずれかをコード化するmRNAの5’非翻訳リーダー領域に対応するDNA配列中の塩基を改変する、請求項30に記載の細菌株。
- glf遺伝子を含む、糖の取り込みのために促進拡散を用いるように操作された細菌株であって、該細菌株が、コハク酸生産のための改善された力価および収量のために進化し、該glf遺伝子が1つまたはそれ以上の変異を含む、細菌株。
- glk遺伝子を含む、糖の取り込みのために促進拡散を用いるように操作された細菌株であって、該細菌株が、コハク酸生産のための改善された力価および収量のために進化し、該glk遺伝子が1つまたはそれ以上の変異を含む、細菌株。
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