JP5597554B2 - Ｌ−アミノ酸生産用微生物およびこれを用いてｌ−アミノ酸を生産する方法 - Google Patents

Description

本発明は、スクロースを主炭素源として用いて高収率のＬ−アミノ酸を生産する、形質転換された微生物およびこれを用いたＬ−アミノ酸生産方法に関する。

発酵産業に主に用いられる澱粉糖は、最近、バイオ燃料の開発が加速化されるにつれて需要が急増し、異常気候による作物の凶作により価格が急上昇している。このような澱粉糖に比べて安いスクロース、またはスクロースを多量含む糖蜜を発酵産業の炭素源として用いる場合、より高い原価競争力を確保することができるという長所がある。自然界に存在する大腸菌の約５０％程度はスクロースを代謝することが可能な能力を持っているが、発酵産業に主に用いられている大腸菌Ｋ１２菌株、Ｂ菌株およびＣ菌株などはスクロースの同化能がない(Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8, Can. J. Microbiol. (1999) 45:418-422)。よって、スクロースの同化能に関連した遺伝子を究明し、これを改良して強化されたスクロース同化能関連遺伝子を確保すること、およびこれらをスクロース非同化性の産業用大腸菌に導入して目的の代謝産物を生産することは発酵産業の最も重要な研究主題の一つである。

産業用大腸菌にスクロースの同化能(Sucrose-assimilating ability)を与えることが可能な方法として、スクロースの同化能がある微生物由来のスクロース利用性遺伝子または遺伝子群を導入する方法が主に用いられている。例えば、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属するサルモネラ(Salmonella)種(J. Bacteriol. (1982) 151:68-76, Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8, J. Bacteriol. (1991) 173:7464-7470, 米国特許第７，１７９，６２３号) 、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)(J. Gen. Microbiol. (1988) 134:1635-1644)、エルウィニアアミロボーラ(Erwinia amylovora)(J. Bacteriol. (2000) 182:5351-5358)に存在するｓｃｒレギュロンを大腸菌Ｋ１２に形質転換してスクロースの同化能を与えたことは、既に当業界によく知られている。また、スクロースの同化能を有するｎｏｎ−Ｋ１２大腸菌または病原性大腸菌(Appl. Environ. Microbiol. (1992) 58:2081-2088, 米国特許第６，９６０，４５５号)由来のｃｓｃレギュロンを導入した場合、大腸菌ＡＢ１２８１（米国特許第４，８０６，４８０号）の接合性プラスミド(conjugative plasmid)ｓｃｒ５３に存在するスクロース利用性遺伝子群を導入した場合、並びにグラム陽性微生物としてのストレプトコッカスミュータンス(Streptococcus mutans)(J. Bacteriol. (1989) 171:263-271)およびバチルスサブティリス(Bacillus subtilis)(J. Bactreriol.(1989) 171:1519-1523)由来のｓｃｒレギュロン、ｓａｃオペロン(operon)を導入した場合も知られている。

従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界から収得された微生物菌株またはＬ−アミノ酸生産性が増強されるように変形されたこれら菌株の変異株を用いた発酵方法に従って工業的に生産されてきた。Ｌ−アミノ酸の生産能を増強させるための多くの技術が開発されており、例えば、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させ或いはＬ−アミノ酸の生産によるフィードバック作用を抑制する技術などが主を成している。一方、Ｌ−アミノ酸生産株のアミノ酸生産能の増加は、アミノ酸排出活性の増強に応じて改良することができる。例えば、Ｌ−リシン排出遺伝子の発現が増強されたコリネバクテリウム属細菌のリシン生産株、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリンまたはチアゾリジン誘導体の分泌に適した流出タンパク質を暗号化する遺伝子の発現を調節することによりＬ−アミノ酸の生産能を増加させる方法も用いられている。

Ｌ−アミノ酸スクロースを利用することが可能なシステムは、Ｓｃｒ−ＰＴＳシステムとＳｃｒ−ｎｏｎ ＰＴＳシステムに大別される。大部分のスクロースを利用することが可能な微生物はＳｃｒ−ＰＴＳ(phosphoenolpyruvate dependent sucrose phosphotransferase)システムを有する。Ｓｃｒ−ＰＴＳシステムは、低濃度のスクロースまで効率よく流入させることができるという長所はあるが、ＰＥＰ(Phosphoenolpyruvate)を消耗してスクロースを流入させるので、細胞内のＰＥＰプール(pool)を減少させるという短所がある。Ｓｃｒ−ｎｏｎ ＰＴＳシステムは、プロトン共輸送タイプのスクロースパーミアーゼ(proton symport-type sucrose permease)を用いるシステムであって、このスクロースパーミアーゼをコードするｃｓｃＢを含むｃｓｃ遺伝子菌がよく知られている。ｃｓｃレギュロンは、ｃｓｃＢ(sucrose permease or proton symport-type sucrose permease)、ｃｓｃＫ(fuctokinase)、ｃｓｃＡ(sucrose hydrolase)、およびｃｓｃＲ(sucrose transcriptional regulator)から構成されており、２つのオペロン、すなわちｃｓｃＫＢとｃｓｃＲによって陰性的に調節される(Jahreis K et al., J. Bacteriol. (2002) 184:5307-5316)。

ＰＥＰは、中央代謝経路で重要な中間体あって、糖ＰＴＳシステムのリン酸供与体の役割だけでなく、ピルビン酸キーナーゼによって触媒されるＡＴＰ生成反応に関与するうえ、幾つかのアミノ酸またはオキサロ酢酸（oxaloacetate、ＯＡＡ）の直接前駆体としても作用する(Metab. Eng. (2002) 4:124-137, Microb. Cell Fact. (2005) 4:14)。特に、ＯＡＡはトレオニン、イソロイシンメチオニン、リシン、アスパラギンおよびアスパラギン酸などのアミノ酸の炭素骨格(carbon skeleton)として用いられる（米国特許第６，９６０，４５５号）。ＰＥＰの大部分は糖ＰＴＳシステムによって最も多く消耗されるものと知られている。炭素源としてグルコースが含有された最小培地でグルコースＰＴＳシステムに消耗されるＰＥＰの量は、全体ＰＥＰの５０％に達すると報告されている(Microb. Cell Fact. (2005) 4:14)。よって、糖ＰＴＳシステムに代えて糖ｎｏｎ−ＰＴＳシステムを用いる場合、細胞内のＰＥＰプールを増加させることができ、増加したＰＥＰを発酵産物の生合成に用いることにより生産性および収率を向上させることができる。

したがって、スクロースの利用においても、Ｓｃｒ−ＰＴＳシステムよりはスクロース流入の際にＰＥＰを消耗しないＳｃｒ−ｎｏｎ ＰＴＳシステムを用いることがさらに好ましいだろう。実際に、味の素社の場合、ＥＣ３１３２由来のｃｓｃＢＫＡを大腸菌に導入してトレオニン、イソロイシンおよびトリプトファンなどの生産に用いた（米国特許第６，９６０，４５５号）。また、ＤｕＰｏｎｔ社は、大腸菌ＡＴＣＣ１３２８１由来のｃｓｃＢＫＡＲを大腸菌Ｋ１２に導入し、スクロースを用いてチロシンを生産したこともあった(Appl. Microbiol. Biotechol. (2007) 74:1031-1040)。
一方、マンノキナーゼ(Mannokinase、Ｍａｋ)は、ＡＴＰを消耗し、マンノース、フルクトースを含むヘキソースを６−ホスホ−エステル(6-phospho-ester)形態に転換するキナーセ活性を有する。特に、腸内細菌(enteric bacteria)の野生型Ｍａｋ（Ｍａｋ−ｏ）をコードする遺伝子（ｍａｋまたはｙａｊＦ）は、潜在(cryptic)遺伝子として知られており、ｍａｋのプロモーター−３５部位の塩基配列変異によるＭａｋ（Ｍａｋ＋）は活性が大きく増加すると知られている(Kornberg HL, J.Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3:355-359; Miller BG & Raines RT, Biochemistry (2005) 44:10776-10783)。Ｍａｋは、マンノース、フルクトース以外にも、別の基質のグルコース、ソルボースおよびグルコサミンをリン酸化させることができる。ところが、前記Ｍａｋがスクロース代謝に影響するとう事実は、未だ解明されていない。

米国特許第７，１７９，６２３号 米国特許第６，９６０，４５５号 米国特許第４，８０６，４８０号

Mol. Microbiol. (1998) 2:1-8 Can. J. Microbiol.(1999) 45:418-422 J. Bacteriol. (1982) 151:68-76 J. Bacteriol. (1991) 173:7464-7470 J. Gen. Microbiol. (1988) 134:1635-1644 J. Bacteriol. (2000) 182:5351-5358 Appl. Environ. Microbiol. (1992) 58:2081-2088 J. Bacteriol.(1989) 171:263-271 J. Bactreriol. (1989) 171:1519-1523 Jahreis K et al., J. Bacteriol. (2002) 184:5307-5316 Metab. Eng.(2002) 4:124-137, Microb. Cell Fact.(2005) 4:14 Appl. Microbiol. Biotechol.(2007) 74:1031-1040 Kornberg HL, J.Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3:355-359 Miller BG & Raines RT, Biochemistry (2005) 44:10776-10783

上述した背景の下で、本発明者は、スクロースを高効率的に利用する微生物を開発するための一環として、スクロース代謝に関与するものと予想される遺伝子を探索する研究を行ったところ、スクロース代謝においてマンノキナーゼが重要な役割をするという事実を発見した。すなわち、マンノキナーゼが不活性化されている大腸菌に完全なｃｓｃレギュロンを導入しても、マンノキナーゼが不活性化されていない野生型大腸菌に比べてスクロース利用速度が減少するという事実を見出し、これに基づいて、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、スクロースを主炭素源として用いるＬ−アミノ酸生産能が向上したエシェリキア属微生物を提供することにある。より具体的に、スクロース非同化性微生物にスクロースパーミアーゼ(sucrose permease)、スクロースヒドロラーゼ(sucrose hydrolase)およびスクロース転写調節制御因子(sucrose transcriptional regulator)の活性を付与し、マンノキナーゼ(mannokinase)の活性が強化されたことを特徴とする、増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記エシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することにある。

本発明に係る向上したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する場合、発酵産業に主に使用された澱粉糖以外にスクロースを主炭素源として用いることにより急変する世界の穀物価額に柔軟に対処することができるうえ、高収率のＬ−アミノ酸を生産することができる。

図１はｓｃｒレギュロンの概要を示す図である。ｐはプロモーター(promoters)、Ｋｏ１およびＹｏ２ｏ３はオペーレーター(operators)、ｔはターミネータ(terminators)をそれぞれ意味する。 図２はｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含む組み換えプラスミドｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋの作製図である。

上記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、スクロース非同化性微生物にスクロースパーミアーゼ（sucrose permease：ｃｓｃＢ）、スクロースヒドロラーゼ（sucrose hydrolase：ｃｓｃＡ）、およびスクロース転写制御因子（sucrose transcriptional regulator：ｃｓｃＲ）の活性を付与し、マンノキナーゼ(mannokinase)の活性が強化されたことを特徴とする、増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物に関する。
本発明において、スクロースパーミアーゼは外部のスクロースを細胞内に流入させる活性を有するペプチドであり、スクロースヒドロラーゼはスクロースをグルコースとフルクトースに加水分解する活性を有し、スクロース転写制御因子はスクロースパーミアーゼおよびスクロースヒドロラーゼをコードする遺伝子の転写を調節する活性を有する。前記スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子の活性は、スクロース同化能のある微生物に存在するが、エシェリキア属微生物、特に産業的に利用される産業用大腸菌Ｋ１２菌株、Ｂ菌株およびＣ菌株には存在しない。

前記スクロース非同化性エシェリキア属微生物にスクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子の活性を与えるようにする方法は、当該分野でよく知られている多様な方法の適用が可能である。好ましい活性付与方法は、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子を暗号化する遺伝子をベクターに導入し、その組み換えベクターによって、スクロース非同化性Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物を形質転換させることである。前記スクロースパーミアーゼをコードする遺伝子、スクロースヒドロラーゼをコードする遺伝子、スクロース転写制御因子をコードする遺伝子は、スクロース同化能のある微生物、好ましくはスクロース同化能のあるエシェリキア属微生物、より好ましくはスクロース同化能のある大腸菌に由来することができる。スクロース同化能のある大腸菌としては、例えば大腸菌ＡＴＣＣ９６３７(Alterthum F & Ingram LO, Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55:1943-1948)などがある。前記大腸菌ＡＴＣＣ９６３７から得られるスクロースパーミアーゼをコードする遺伝子（ｃｓｃＢ）を配列番号４、スクロースヒドロラーゼをコードする遺伝子（ｃｓｃＡ）配列番号６、スクロース転写制御因子をコードする遺伝子（ｃｓｃＲ）を配列番号７にそれぞれ示した。

一つの具体的な実施において、本発明者は、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子を暗号化する遺伝子であって、ｃｓｃレギュロンに由来した配列番号４、６および７のｃｓｃＢ、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＲ遺伝子を含むｃｓｃＢＡＲ遺伝子をベクターに導入し、その組み換えベクターによって、スクロース非同化性Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物を形質転換させて製造することができる。
本発明において、マンノキナーゼは、ＡＴＰを用いてマンノースなどのヘキソースを６−ホスホ−エステル形態に転換する活性を有するペプチドを意味する。本発明は、スクロース非同化性エシェリキア属微生物においてマンノキナーゼの活性が本来の活性より強化（または増加）されたことを特徴とする。前記「本来の活性」とは、何らの遺伝子操作または変形もないスクロース非同化性エシェリキア属微生物が持っている活性を意味する。また、前記「強化」または「増加」は、スクロース非同化性エシェリキア属微生物の本来の活性より向上したことを意味する。

本発明のマンノキナーゼ活性を強化（または増加）させる方法は、当該分野における公知の多様な方法の適用が可能である。その方法の例は、これに限定されないが、マンノキナーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに染色体に挿入する方法、または前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入する方法などによって、マンノキナーゼをコードする塩基配列のコピー数を増加させる方法、強いプロモーターで取り替える方法、プロモーターに変異を導入する方法、および遺伝子変異による方法などがある。一つの具体的な実施において、アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物のマンノキナーゼの活性を強化させるために、マンノキナーゼを暗号化する遺伝子をベクターに導入し、エシェリキア属微生物を形質転換させることにより、前記遺伝子のコピー数を増加させる方法を使用することができる。

マンノキナーゼを暗号化する遺伝子は、スクロース非同化性エシェリキア属微生物に作動可能な塩基配列を有する遺伝子であればいずれでもよく、好ましくは腸内細菌(enteric bacteria)の野生型Ｍａｋ（Ｍａｋ−ｏ）をコードするｍａｋ遺伝子である。具体的な一実施例では、大腸菌に由来し、好ましくは配列番号１５の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＣ００００９１）を有するポリヌクレオチドを使用した。一方、前記マンノキナーゼをコードする塩基配列は、その活性を維持する限りはある程度変形が可能であるのは、当業者にとっては自明なことである。当業者であれば、このような人為的変形によって７０％以上の相同性が維持される塩基配列が、本発明で目的とする遺伝子の活性を保有する限りは、本発明の前記塩基配列に由来したものと均等であることを容易に理解するであろう。

本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能をさらに向上させるために、前記マンノキナーゼ、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子の活性を保有したペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させる方法、プロモーターを改良する方法、ランダム変異導入法(random mutagenesis)、または部位特異的突然変異誘発法(site-directed mutagenesis)などを用いる方法などを使用することができる。本発明の具体的実施では、マンノキナーゼ、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子をコードする塩基配列を含む遺伝子群にヒドロキシルアミンを処理してランダム変異を誘発する方法(Sikorski RS & Boeke JD, Methods Enzymol. (1991) 194:302-318)を用いた。

したがって、好適な一様態として、本発明は、前記変異誘発方法による塩基配列またはアミノ酸配列に変異がある、向上したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物に関するものである。好ましくは、前記変異体は、マンノキナーゼ、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子のうちの塩基配列に一つまたはそれ以上の変異が存在する変異体である。より好ましくは、マンノキナーゼ、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子のうちのアミノ酸配列に一つまたはそれ以上の変異が存在する変異体である。最も好ましくは、スクロース転写制御因子の１３０番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンへ置換された変異体であり、好ましくは、このような変異体は配列番号１７に示される塩基配列で暗号化される、変異されたスクロース転写制御因子を有する。

このような変異体をベクターに導入し、その組み換えベクターを、スクロース非同化性Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物に導入して形質転換させる方法によって、本発明に係る向上したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物を提供することができる。具体的な一実施において、本発明者は、配列番号１８に示される塩基配列を含むｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋプラスミドを用いて、スクロース非同化性エシェリキア属微生物を、向上したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物に形質転換させることができる。

本発明において、「ベクター」とは、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼ、スクロース転写制御因子およびマンノキナーゼを暗号化する遺伝子を宿主細胞としてのスクロース非同化性エシェリキア属微生物に導入し、本発明に係るエシェリキア属微生物を提供するのに用いられるヘキサン化合物であって、目的のタンパク質を発現するための通常の必須的な発現要素を含む。具体的に、プロモーターやオペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化配列などの調節配列を有し、その多様な変形が可能である。また、エンハンサー配列または分泌配列を含むことができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。使用可能なベクターは、特に制限されず、公知の発現ベクターを使用することができる。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＭＷ１１８ベクターなどを使用することができる。

本発明において、用語「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現し得るようにすることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できるさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するものであれ、染色体外に位置するものであれ全てを含む。また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチドであって、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いずれの形態で導入されるものでも構わない。例えば、前記遺伝子は、自体的な発現に必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形態で宿主細胞に導入できる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記遺伝子は、その自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。

本発明の微生物は、スクロース非同化性を有するＬ−アミノ酸生産可能微生物にスクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子の活性が与えられ、マンノキナーゼの活性が強化されてＬ−アミノ酸生産能が向上すると同時にスクロース同化能を有する微生物を意味する。したがって、本発明の微生物は、前記特性を保有する限りは、原核微生物および真核微生物のいずれも含み、その例としては、エシェリキア属(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)属、セラシア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属およびブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物菌株がある。本発明の微生物は、好ましくはシェリキア属に属する微生物であり、より好ましくは大腸菌である。
本発明において、「Ｌ−アミノ酸」は、Ｌ−トレオニン、Ｏ−スクシニル−ホモセリン、Ｏ−アセチル−ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−トリプトファンなどである。好ましくは、前記Ｌ−アミノ酸はＬ−トレオニン、Ｏ−スクシニル−ホモセリン、Ｏ−アセチル−ホモセリンおよびＬ−トリプトファンである。

具体的な一実施において、本発明者は、特にＬ−トレオニン生産能を有する大腸菌がｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋ遺伝子群を含む配列番号１８の塩基配列を有するベクターによって、Ｌ−トレオニン生産能を有する大腸菌ＡＢＡ５Ｇ菌株を形質転換し、製作された菌株を大腸菌ＣＡ０３−０３０８と命名し、２００８年１２月２３日付で、韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設の韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０９７８Ｐで寄託した。
別の様態として、本発明は、前記向上したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物を、スクロースが主炭素源として含まれている培地に培養することにより、アミノ酸を生産する方法に関する。
具体的に、本発明は、炭素源としてスクロースが全体または一部含まれた培養培地に、前記スクロース同化能を有し且つＬ−アミノ酸を生産する微生物を接種して培養する段階と、前記培養物からＬ−アミノ酸を分離する段階とを含む、スクロースを含む炭素源から前記エシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。

本発明の前記培養過程は、当業界における公知の適切な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例にはバッチ式培養、連続式培養および流加式培養が含まれるが、これに限定されない。培養に使用される培地は、特定な菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。
本発明で使用される培地は、スクロースを主炭素源として使用する。主炭素源として使用されるスクロースはスクロースを多量含む糖蜜などの形態で炭素源として提供できる。スクロースまたは糖蜜の他にも、適量の炭素源を制限なく様々に含むことができる。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用することができる。前記培地に含まれるリン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムおよび対応するナトリウム含有塩を含むことができる。また、硫酸マグネシウムや硫酸鉄などの金属塩を含むことができる。その他に、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などを含むことができる。これらの培地または前駆体は培養物にバッチ式または連続式で添加できる。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えることができる。また、培養物の好気状態を保つためには培養物内に酸素または酸素含有気体を注入し、嫌気および未好気状態を維持するためには、気体を注入せず、或いは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入する。培養物の温度は通常２７℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養期間は所望の物質の生成量が得られるまで続けられてもよいが、好ましくは１０〜１００時間である。
本発明の前記培養段階で生産されたアミノ酸を収集および回収する方法は、培養方法、例えばバッチ式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野における公知の適切な方法を用いて培養液から目的のアミノ酸を収集することができる。

以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：スクロース同化性遺伝子ｃｓｃレギュロンの獲得およびクローニング
スクロール流入の際にＰＥＰ(phosphoenolpyruvate)を所望しないＳｃｒ−ｎｏｎ ＰＴＳシステムを暗号化する、ｃｓｃＢＫＡＲ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｉｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ８１４６１）を含むレギュロンは、大腸菌Ｗ菌株（ＡＴＣＣ９６３７、ＵＳＡ）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅した。制限酵素ＥａｇＩ部位を有する配列番号１のプライマー、およびＸｂａＩ部位を有する配列番号２のプライマーを用いて、ゲノム上に連続的に存在する４種の遺伝子を全て単一ポリヌクレオチドに増幅した。
配列番号１：５’−ＣＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＴ−３’
配列番号２：５’−ＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＧＧ−３’

ＰＣＲ条件は、９４℃で３分間の変性後、９４℃の変性３０秒間、５６℃のアニーリング３０秒間、７２℃の重合５分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返し行い、最後に７２℃の重合反応を７分間行った。その結果、５１９９ｂｐのポリヌクレオチドを獲得することができた。収得したポリヌクレオチドにＥａｇＩおよびＸｂａＩの制限酵素処理を施した後、ｐＡＣＹＣ１８４ベクターにクローニングした。その後、前記ベクターを大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換体を得た後、これを１％スクロースの含まれているＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ ｐｌａｔｅに塗抹した。コロニーの中でも濃い紫色のコロニーを選別した後、前記コロニーからプラスミドを収得した。

実施例２：獲得されたｃｓｃＢＫＡＲ遺伝子の塩基配列の決定
収得したプラスミドをｐＡｃｓｃＢＫＡＲと命名し、ＥａｇＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングされたｃｓｃＢＫＡＲのＤＮＡ塩基配列（配列番号３）を決定したとき、１４１番目〜１３８８番目の塩基配列はｃｓｃＢ（配列番号４）、１４６０番目〜２３７４番目の塩基配列はｃｓｃＫ（配列番号５）、２５９０番目〜４０２３番目の塩基配列はｃｓｃＡ（配列番号６）、４０３１番目〜５０２６番目の塩基配列はｃｓｃＲ（配列番号７）と明らかになった。

実施例３：ＭＧ１６５５ ｍａｋ遺伝子欠損菌株の製作
スクロース代謝に主要な影響を及ぼす遺伝子を探索するために、スクロース代謝に関与するものと予想される幾つかの遺伝子を選別し、その遺伝子がそれぞれ欠損している変異大腸菌Ｋ１２を製作した。各遺伝子が欠損している変異体大腸菌Ｋ１２は、ワンステップ不活性化方法(Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97:6640-6645)によって製作し、抗生剤耐性付与標識遺伝子を除去した。特に、ｍａｋ欠損菌株を製作するために、配列番号８と配列番号９のプライマー対と、ｐＫＤ４プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ０４８７４３）を用いてＰＣＲ反応を行い、その結果獲得したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ０４８７４６）を含有する野生型大腸菌Ｋ１２のコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。その後、カナマイシン(kanamycine)耐性を示す細胞株を対象としてＰＣＲ反応を行い、ｍａｋ遺伝子の欠失有無を確認し、ｐＣＰ２０プラスミドを導入して抗生剤耐性標識遺伝子を除去した。
配列番号８：５’−ＧＴＧＣＧＴＡＴＡＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴＡＣＡＣＧＴＣＴＴＧ−３’
配列番号９：５’−ＴＴＡＣＴＣＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡ−３’

実施例４：ＭＧ１６５５ ｍａｋ遺伝子欠損菌株へのｐＡｃｓｃＢＫＡＲの導入およびスクロース同化性の確認
スクロース代謝に主要な影響を及ぼすものと予想されるｍａｋ遺伝子が欠失している変異大腸菌Ｋ１２を実施例３の方法で製作した後、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲプラスミドを導入して形質転換体を得た。得られた形質転換体を３３℃の培養器でＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を、スクロースが含有された表１の２５ｍＬ力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で３６時間培養した。その後、前記培養液のＯＤ値および糖消耗量を測定した。その結果を表２に示す。

その結果、表２に示すように、ｍａｋが欠損し且つｃｓｃレギュロンが形質導入された菌株は３６時間スクロースを２４．９ｇ／Ｌ用い、ｍａｋが欠損せず且つｃｓｃレギュロンが形質導入された野生型菌株は３３．１ｇ／Ｌのスクロースを用いることにより、ｍａｋが欠損した菌株はｍａｋ非欠損菌株に比べてスクロース利用速度が約１．３倍減少することを確認することができた。これはｍａｋがスクロース代謝において重要な遺伝子であることを示唆する。

実施例５：ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの製作
効率的なスクロース利用性菌株を開発するために、ｍａｋとｃｓｃレギュロンを同時に過発現させるためのベクターを製作した。この際、ｃｓｃレギュロンのうち、ｃｓｋＫは除外させた。まず、ｐＡｃｓｃＢＡＲを製作した後、ｐＡｃｓｃＢＡＲにｍａｋ遺伝子をクローニングする方法を使用した。
具体的に、配列番号１０と１１のプライマーを用いて実施例１と同一条件のＰＣＲ方法によって、ｃｓｃＫ部位の除去されたｃｓｃＢ部位のポリヌクレオチドを増幅した。その結果、１５２１ｂｐのポリヌクレオチドを収得した。
配列番号１０：５’−ＣＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＧＡＧＴＡＡＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴ−３’
配列番号１１：５’−ＡＴＴＣＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＴ−３’
前記収得したポリヌクレオチドとｐＡｃｓｃＢＫＡＲをそれぞれＥｃｏＲＶとＥａｇＩで制限酵素処理した後、連結してｐＡｃｓｃＢＡＲプラスミドを製作した。前記プラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換した後、ＬＢ培地で成長したコロニーを用いたＰＣＲ法によって、ｐＡｃｓｃＢＡＲの含まれたコロニーを選別し、このコロニーからｐＡｃｓｃＢＡＲプラスミドを獲得した。獲得されたｐＡｃｓｃＢＡＲプラスミドのＸｂａIとＥａｇI部位に連結されたｃｓｃＢＡＲの塩基配列（配列番号１２）分析によって、変異がないことを確認した。

その後、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１３と１４のプライマー対を用いて実施例１と同一の方法でＰＣＲを行うことにより、ｍａｋの含まれたポリヌクレオチドを増幅した結果、１３８８ｂｐのポリヌクレオチド（配列番号１５）を収得した。前記ＰＣＲ産物をｐＡｃｓｃＢＡＲのＰｓｔＩとＥａｇＩの制限酵素部位にクローニングすることにより、ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋを製作した。
配列番号１３：５’−ＣＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＧ−３’
配列番号１４：５’−ＡＡＣＧＧＣＣＧＴＣＴＣＧＧＴＧＣＴＣＡＴＴＡＣＴ−３’
前記ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋを大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換した後、ＬＢ培地で成長したコロニーを用いたＰＣＲ法によって、ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの含まれたコロニーを選別し、選別されたコロニーをｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋプラスミドを獲得した。獲得されたｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋプラスミドのＸｂａＩとＥａｇＩ部位に連結されたｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの塩基配列（配列番号１６）分析によって、変異がないことを確認した。

実施例６：トレオニン生産株へのｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの導入
ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋを、トレオニンを生産する大腸菌に導入したとき、スクロースを用いて成長するうえ、実際効率的なトレオニン生産が可能なのかを確認するために、通常の形質転換法によってトレオニン生産菌株、ＡＢＡ５Ｇ（ＫＦＣＣ １０７１８）に導入した。獲得されたコロニーに対してＰＣＲクローニング法によって、スクロース利用関連遺伝子の含まれたプラスミドを持っているコロニーを獲得した。獲得したコロニーを３３℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養した後、表１の２５ｍＬ力価培地に１白金耳ずつ接種し、しかる後に、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で３０時間培養した。その後、前記培養液のＯＤ値および糖消耗量を測定した。その結果は表３に示した。

その結果、表３に示すように、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＡＢＡ５Ｇ菌株は、３０時間培養した場合、１８．７ｇ／Ｌのスクロースを用い、６．０ｇ／ＬのＬ−トレオニンを生産したが、ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋを含むＡＢＡ５Ｇ菌株は、２７．７ｇ／Ｌのスクロースを用い、９．７ｇ／ＬのＬ−トレオニンを生産した。すなわち、ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋが含まれたＡＢＡ５Ｇは、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＡＢＡ５Ｇ菌株に比べてスクロース利用速度が約１．５倍増加し、トレオニン生産性も３．７ｇ／Ｌ上昇した。

実施例７：ｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの導入によるＭａｋ活性強化の確認
親菌株ＡＢＡ５Ｇと比較してｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの含まれたＡＢＡ５Ｇ菌株でマンノキナーゼの活性の増大または強化を確認するための一つの方法として、フルクトキナーゼ活性測定(Copeland L et al., Plant Physiol. (1978) 62:291-294)を行った。この酵素活性測定法は、フルクトースを最初基質とし、マンノキナーゼとホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたカップリング反応(coupling reaction)によってマンノキナーゼのフルクトキナーゼ活性を測定することが可能な方法である。酵素液は、ＬＢで２４時間培養したｐＡｃｓｃＢＡＲとｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋがそれぞれ含まれたＡＢＡ５Ｇ菌株をソニゲーターを用いて破砕した後、遠心分離した上澄み液を使用した。タンパク質濃度測定はブラドフォード分析法(Bradford assay)を用いた。酵素反応は３０分間維持しながらＯＤ３４０ｍｍで吸光度の変化量を測定した。これにより、カップリング反応によって生成されたＮＡＤＰＨの量を測定したと共に、ＮＡＤＰＨの吸光係数６．２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１を用いて活性を計算した。マンノキナーゼの１ｕｎｉｔは、前記酵素活性測定法によって、１分当り全体タンパク質１ｍｇを用いて１ｎＭのＮＡＤＰＨを生成させる酵素量と定義し、その結果は表４に示した。

表４に示すように、ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋが含まれたＡＢＡ５Ｇのマンノキナーゼの活性は、ｐＡｃｓｃＢＡＲのみ含まれたＡＢＡ５Ｇに比べて酵素活性が約１２倍増加または強化されたことを確認することができた。

実施例８：ｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの突然変異導入
スクロース利用性を向上させ且つトレオニン生産性を向上させるために、ヒドロキシルアミンを処理することにより変異されたスクロース利用性遺伝子を得る化学的ランダム変異導入法(chemical random mutagenesis)を行った(Sikorski RS & Boeke JD, Methods Enzymol. (1991) 194:302-318)。まず、１Ｍヒドロキシルアミン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭピロリン酸ナトリウムを添加して変異誘発液を製造した後、１ｍＬの変異誘発液に目的のＤＮＡを０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で２５μＬ入れた。ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋプラスミドからＥａｇＩとＸｂａＩの制限酵素を用いて収得した、５８８７ｂｐのｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋが含まれたＤＮＡ断片を目的のＤＮＡとして使用した。変異誘発液を添加したＤＮＡ断片を７５℃で３０分、１時間、２時間、４時間毎に５００μＬずつ精製カラムを用いて精製した。ヒドロキシルアミンの処理されたＤＮＡと、ＥａｇＩおよびＸｂａＩの制限酵素が処理されたｐＡＣＹＣ１８４ベクターとをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、トレオニン生産株ＡＢＡ５Ｇに形質転換した。形質転換された菌株を０．１％の低濃度スクロースが含まれたＭａｃＣｏｎｋｅｙ固体培地に塗抹して３７℃で一日培養した後、濃い紫色のコロニーを選別した。
選別されたコロニーを表１の力価培地で培養しながらトレオニン生産性とスクロース利用速度を評価し、最終的にトレオニン生産性とスクロース利用性に最も優れた菌株を選別した。選別された菌株からプラスミドを得た後、塩基配列分析を行った。その結果、前記菌株のｃｓｃＲの３８８番目の塩基がＣからＴに置換された。それにより、１３０番目のアミノ酸がヒスチジンからチロシンに変異された。この変異を持つスクロース転写制御因子ｃｓｃＲは、配列番号１７の塩基配列によって暗号化される。

実施例９：ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋの導入によるＬ−トレオニン生産性の向上
ｃｓｃＲ変異（配列番号１７）の含まれたｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋ（配列番号１８）プラスミドをＡＢＡ５Ｇに新たに形質転換してフラスコ力価評価を行った。３３℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養した菌株を表１の２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で３０時間培養した。その結果を表５に示す。

表５に示すように、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＡＢＡ５Ｇ菌株は、３０時間培養した場合、１８．７ｇ／Ｌのスクロースを用い、６．０ｇ／ＬのＬ−トレオニンを生産したが、ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含むＡＢＡ５Ｇ菌株は、３３．４ｇ／Ｌのスクロースを用い、１２．４ｇ／ＬのＬ−トレオニンを生産した。すなわち、ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋが含まれたＡＢＡ５Ｇは、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＡＢＡ５Ｇ菌株に比べてスクロース利用速度が約１．８倍、トレオニン生産性が６．４ｇ／Ｌ程度それぞれ上昇し、ｐＡｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの含まれたＡＢＡ５Ｇに比べてもスクロース利用速度が約１．２倍、トレオニン生産性が２．７ｇ／Ｌ程度それぞれ増加した。したがって、ｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含む組み換え菌株の場合、スクロース利用性およびＬ−トレオニンの生産性が向上することを確認することができた。前記形質転換された微生物をＣＡ０３−０３０８と命名し、これを２００８年１２月２３日付で韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設の韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ−１０９７８Ｐで寄託した。

実施例１０：ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋの導入によるＯ−スクシニル−ホモセリン生産性の向上
実施例８で製作されたｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを、米国公開特許第２００９／０２５３１８７号に記載されたＯ−スクシニル−ホモセリン生産菌株としてのＣＪＭ−１１Ａ（ＫＣＣＭ−１０９２２Ｐ）に形質転換し、０．１％の低濃度スクロースが含まれたＭａｃＣｏｎｋｅｙ固体培地に塗抹して３７℃で一日培養した後、濃い紫色のコロニーを選別した。
選別された形質転換体を３３℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養した菌株を、スクロースが含有された表１の２５ｍＬ力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で培養した。その結果を表６に示す。

表６に示すように、親菌株としてのｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＣＪＭ−１１Ａ菌株は、４８時間培養した場合、３０．２ｇ／Ｌのスクロースを用い、１２．３ｇ／ＬのＯ−スクシニル−ホモセリンを生産したが、ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含むＣＪＭ−１１Ａ菌株は、５０．４ｇ／Ｌのスクロースを用い、２０．５ｇ／ＬのＯ−スクシニル−ホモセリンを生産して、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＣＪＭ−１１に比べてスクロース利用速度が１．７倍増加し、８．２ｇ／Ｌの向上したＯ−スクシニル−ホモセリン生産性を示した。すなわち、ｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含む組み換え菌株の場合、スクロース利用性およびＯ−スクシニル−ホモセリンの生産性が向上することを確認することができた。

実施例１１：ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋの導入によるＯ−アセチル−ホモセリン生産性の向上
実施例８で製作されたｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを、米国公開特許第２００９／０２５３１８６号に記載されたＯ−アセチル−ホモセリン生産菌株としてのＣＪＭ−Ｘ（ＫＣＣＭ−１０９２１Ｐ）に形質転換し、０．１％の低濃度スクロースが含まれたＭａｃＣｏｎｋｅｙ固体培地に塗抹して３７℃で一日培養した後、濃い紫色のコロニーを選別した。
選別された形質転換体を３３℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養した菌株を、スクロースが含有された表１の２５ｍＬ力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で培養した。その結果を表７に示す。

表７に示すように、親菌株ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＣＪＭ−Ｘ菌株は、４８時間培養した場合、２９．９ｇ／Ｌのスクロースを用い、１０．７ｇ／ＬのＯ−アセチル−ホモセリン（以下、ＯＡＨ）を生産したが、ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含むＣＪＭ−Ｘ菌株は、５３．５ｇ／Ｌのスクロースを用い、１５．４ｇ／ＬのＯＡＨを生産して、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＣＪＭ−Ｘに比べてスクロース利用速度が１．８倍増加し、８．８ｇ／Ｌの向上したＯＡＨ生産性を示した。すなわち、ｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含む組み換え菌株の場合、スクロース利用性およびＯＡＨの生産性が向上することを確認することができた。

実施例１２：ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋの導入によるＬ−トリプトファン生産性の向上
実施例８で製作されたｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋをＬ−トリプトファン生産菌株としてのＣＪ２８５（ＫＣＣＭ−１０５３４、韓国微生物保存センターに２００３年１１月２８日付で寄託）に形質転換し、０．１％の低濃度スクロースが含まれたＭａｃＣｏｎｋｅｙ固体培地に塗抹して３７℃で一日培養した後、濃い紫色のコロニーを選別した。
選別された形質転換体を３３℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養した菌株を、スクロースが含有された表８の２５ｍＬ力価培地に１白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で培養した。その結果を表９に示す。

表９に示すように、親菌株ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＣＪ２８５菌株を６０時間培養した場合、２４．７ｇ／Ｌのスクロースを用い、４．９ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを生産したが、ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含むＣＪ２８５菌株は、３７．１ｇ／Ｌのスクロースを用い、８．９ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを生産して、ｐＡｃｓｃＢＫＡＲを含むＣＪ２８５に比べてスクロース利用速度が１．５倍増加し、４．０ｇ／Ｌの向上したＬ−トリプトファン生産性を示した。すなわち、ｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含む組み換え菌株の場合、スクロース利用性およびＬ−トリプトファンの生産性が向上することを確認することができた。

以上の説明より、当業者であれば、本発明はその技術的思想または必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連し、以上述べた実施例は全ての面で例示的なもので、限定的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導入される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

本発明に係る向上したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する場合、発酵産業に主に用いられた澱粉糖以外にスクロースを主炭素源として用いることにより、急変する世界の穀物価格に柔軟に対処することができるうえ、高収率のＬ−アミノ酸を生産することができる。

Claims (15)

1. フルクトースキナーゼ活性が付与されていないという条件で、スクロース非同化性微生物にスクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子の活性を付与し、マンノキナーゼの活性を強化させたことを特徴とする、増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物であって、スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼ、スクロース転写制御因子およびマンノキナーゼが大腸菌由来である、エシェリキア属微生物であり、
   マンノキナーゼ活性強化が、マンノキナーゼ遺伝子のコピー数増加、およびプロモーター交換からなる群から選択される１以上の方法により実施される、エシェリキア属微生物。
2. マンノキナーゼ遺伝子のコピー数の増加は、染色体への挿入、およびマンノキナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの形質導入によることを特徴とする、請求項１に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
3. 前記ベクターは、配列番号１５の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
4. スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子の活性付与がスクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼおよびスクロース転写制御因子をコードする塩基配列を含むベクターで形質転換されたことを特徴とする、請求項１に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
5. 前記塩基配列はそれぞれ配列番号４、６および７の塩基配列であることを特徴とする、請求項４に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
6. スクロース転写制御因子の１３０番目のアミノ酸がチロシンで置換されたことを特徴とする、請求項５に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
7. スクロース転写制御因子が配列番号１７の塩基配列でコードされていることを特徴とする、請求項６に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
8. スクロースパーミアーゼ、スクロースヒドロラーゼ、スクロース転写制御因子およびマンノキナーゼをコードする塩基配列を全て含むベクターで形質転換したことを特徴とする、請求項１に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
9. 前記ベクターが配列番号１８の塩基配列でコードされていることを特徴とする、請求項１に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
10. エシェリキア属微生物が大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
11. 大腸菌が大腸菌ＣＡ０３−０３０８（受託番号ＫＣＣＭ１０９７８Ｐ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物。
12. Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニン、Ｏ−スクシニル−ホモセリン、Ｏ−アセチル−ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−トリプトファンよりなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリア属微生物。
13. Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニン、Ｏ−スクシニル−ホモセリン、Ｏ−アセチル−ホモセリンおよびＬ−トリプトファンよりなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１２に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリア属微生物。
14. 炭素源としてスクロースが全体または一部に含まれた培養培地に、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の増加したＬ−アミノ酸生産能およびスクロース同化能を有するエシェリキア属微生物を接種して培養する段階と、
    前記段階で得られる培養物からＬ−アミノ酸を分離する段階とを含むことを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の生産方法。
15. Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニン、Ｏ−スクシニル−ホモセリン、Ｏ−アセチル−ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−トリプトファンよりなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１４に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
    
    
    
    
    
    

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