CN107043732A

CN107043732A - 能够产生l‑氨基酸的微生物及使用其产生l‑氨基酸的方法

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Publication number: CN107043732A
Application number: CN201611001910.7A
Authority: CN
Inventors: 丁起龙; 李锡明; 黄荣彬; 李根喆; 李光镐
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2017-08-15
Anticipated expiration: 2033-01-07
Also published as: MY188383A; EP2801611B1; EP2801611A4; HUE049168T2; CN104185679A; ES2796799T3; US20150050703A1; BR112014016751B1; DK2801611T3; KR101327093B1; JP2017042167A; CN105695381B; CA2860616C; WO2013103268A2; PH12014501556B1; CN105695381A; CN105695382A; RU2600875C2; CA2860616A1; US20170198317A1

Abstract

本发明涉及能够产生L‑氨基酸的微生物及使用其产生L‑氨基酸的方法。更具体地，本发明涉及：重组大肠杆菌(Escherichia coli)，其通过提高产生ATP的能力更加有效地产生L‑苏氨酸或L‑色氨酸，所述ATP在产生L‑苏氨酸或L‑色氨酸时用作细胞中最丰富的能量来源；以及通过使用所述重组大肠杆菌产生L‑苏氨酸或L‑色氨酸的方法。

Description

能够产生L-氨基酸的微生物及使用其产生L-氨基酸的方法

本申请是申请号为201380008312.0的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/KR2013/000072的中国国家阶段申请。

技术领域

本发明涉及能够产生L-苏氨酸或L-色氨酸的微生物以及使用其产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法。

背景技术

已知通过发酵产生有用产物的微生物在增强生物合成途径时需要非常大量的能量，例如ATP。

如本领域中已知的，在微生物代谢过程中，通过分解代谢反应产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(H))与用于合成代谢反应的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP(H)之间的细胞内平衡是非常重要的。NAD(H)是通过食物氧化产生ATP的分解代谢反应的中间体并作为能量来源起作用。并且NADP(H)在提供体内代谢过程中的还原力中发挥作用，即通过与通常催化合成代谢反应的酶进行反应来提供合成分子所需的高能电子。其之间的平衡通过如以下反应式1)所示的NAD磷酸化或者通过如以下反应式2)所示的NADP去磷酸化来调节。

反应式1)

反应式2)

因此，为了有效地产生还原力(例如NADPH)，应一同增加磷酸源，例如ATP。

ATP(腺苷-5’-三磷酸)具有高能磷酸键，并且当其水解为ADP和磷酸时产生能量。ATP主要通过经由微生物的电子传递系统进行的化学渗透磷酸化或者通过底物水平磷酸化产生。所产生的ATP降解以提供细胞所需的能量并且通过糖酵解途径或氧化磷酸化再生而被重复使用。

基于该事实，已经进行了研究以将细菌的ATP能量再生过程用于大量产生有用产物，从而有助于能量供应(Biosci Biotechnol Biochem.，(1997)61∶840-845)。在关于大肠杆菌(E.coli)中ATP再生的研究中，发现当少数基因，包括ysaA(NCBI Gene ID：948085)、ydaS(NCBI Gene ID：945923)和ybiX(NCBI Gene ID：947502)基因分别缺陷时，微生物中的ATP水平比亲本菌株中的ATP水平高约150％，并且将该发现应用于产生谷胱甘肽(FEMSMicrobiol Lett.，(2009)297：217-224)。然而，没有直接的报道直接地解释由通过所述基因所编码的蛋白质活性弱化引起的氨基酸产量增加。

发明内容

技术问题

本发明人发现，提高ATP(其用作产生L-氨基酸的细胞中最丰富的能量来源)的细胞内水平有效地增加了L-苏氨酸或L-色氨酸的产量，从而完成本发明。

本发明的一个目的是提供一种重组大肠杆菌菌株，其通过提高ATP的生产力而具有提高的L-苏氨酸或L-色氨酸生产力。

本发明的另一个目的是提供使用所述重组大肠杆菌菌株来产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法。

技术方案

为了完成上述目的，本发明的一个实施方案提供了产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述菌株被修饰以弱化(使其变弱)选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质YsaA、具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质YdaS和具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质YbiX。

本发明的一个实施方案还提供了用于产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法，其包括培养所述重组大肠杆菌菌株。

有利效果

本发明提供了一种重组微生物，其L-苏氨酸或L-色氨酸生产力通过提高具有L-苏氨酸或L-色氨酸生产力的微生物中的细胞内ATP水平来提高。根据本发明，其提供了通过恢复能量代谢平衡以提高细胞活性并减少培养时间来提高L-苏氨酸或L-色氨酸的产量的方法。

附图说明

图1示出了产生L-苏氨酸的菌株相对于其亲本菌株的相对ATP水平(％)。

图2示出了产生L-色氨酸的菌株相对于其亲本菌株的相对ATP水平(％)。

具体实施方式

在下文中，将详细地描述本发明。

本发明的一个实施方案提供了产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述菌株被修饰以弱化选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质YsaA、具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质YdaS和具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质YbiX。

可用于本发明的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的微生物可以是能够产生L-苏氨酸或L-色氨酸的任何微生物，例如埃希氏菌属细菌(Escherichia sp.Bacterium)、大肠杆菌、棒状杆菌细菌(Coryneform bacterium)、沙雷菌氏属细菌(Serratia sp.bacterium)、普罗威登斯菌属细菌(Providencia sp.Bacterium)等。特别地，可使用属于埃希氏菌属的微生物。

在本发明的一个具体实施方案中，使用具有L-色氨酸生产力的重组大肠杆菌菌株CJ600(KCCM 10812P)(韩国专利注册号10-0792095)，其通过基因工程改造具有L-苯丙氨酸生产力的重组大肠杆菌菌株(KFCC 10066)从而使色氨酸营养缺陷型脱敏，阻断L-苯丙氨酸生物合成并增强色氨酸生物合成相关基因来获得。

在本发明的另一个具体实施方案中，使用具有L-苏氨酸生产力的重组大肠杆菌菌株FTR2533(KCCM-10541)(韩国专利注册号10-0576342)，其通过基因工程改造具有L-苏氨酸生产力的大肠杆菌突变菌株(KFCC 10718)从而使野生型galR基因失活来获得。

YsaA(具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质)被预测为具有4Fe-4S铁氧化还原蛋白型组分的氢化酶，但是尚未发现其确切功能。

YdaS(具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质)被预测为DNA结合转录调节因子，但是尚未发现其确切功能。

YbiX(具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质)是Fe(II)依赖性加氧酶超家族的一种，其作为使用氧来氧化其底物的氧化还原酶起作用。

本发明的多肽YsaA、YdaS和YbiX分别具有由SEQ ID NO：2、4和6表示的氨基酸序列，但不限于此，因为所述蛋白质的氨基酸序列可取决于微生物的物种或菌株。

换言之，本发明的蛋白质可以是编码具有以下氨基酸序列的蛋白质的突变体或人工变体，所述氨基酸序列包括由SEQ ID NO：2、4和6表示的氨基酸序列的一个或更多个位置中的一个或几个氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位，只要所述突变体或人工变体可通过弱化本发明中所描述的活性而有助于增加氨基酸的产量。本文中，“几个”氨基酸的数量根据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置或类型而不同，但特别地为2至20个，特别地为2至10个，并且更特别地为2至5个。此外，氨基酸的这种替换、缺失、插入、添加或倒位还包括由基于具有多肽活性的微生物个体或物种差异的天然存在突变或人工改变所引起的那些变化。

本文所使用的术语“弱化”是指通过使编码蛋白质的基因部分或全部缺失，或者通过修饰表达调控序列以减少基因的表达，或者通过修饰染色体基因序列以使蛋白质的活性变弱，或者通过其组合来使蛋白质的活性变弱。

在本发明中，可通过选自以下的方法来实现活性的弱化：1)使编码蛋白质的多核苷酸部分或全部缺失；2)修饰表达调控序列以减少多核苷酸的表达；3)修饰染色体多核苷酸序列以使蛋白质的活性变弱；以及4)其组合。

可通过用核酸序列部分缺失的多核苷酸或通过染色体插入载体的标记基因来替换染色体中编码内源靶蛋白的多核苷酸来进行用于使编码蛋白质的多核苷酸部分或全部缺失的方法。

在本文中，术语核酸序列的“部分”根据基因的种类而不同，但是与其位置无关，并且其特别地为1至200，更特别地为1至100，甚至更特别地为1至50。

此外，可通过由一个或更多个核苷酸的缺失、插入、非保守或保守替换或者其组合在表达调控序列中诱导突变以弱化所述表达调控序列的活性，或者通过用较弱活性的序列替换所述表达调控序列来进行修饰表达调控序列以减少多核苷酸表达的方法。所述表达调控序列包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译终止的序列。

此外，可通过由一个或更多个核苷酸的缺失、插入、非保守或保守替换或者其组合在序列中诱导突变以弱化所述序列的活性，或者通过用具有较弱活性的经修饰的核苷酸序列替换所述序列来进行本发明的修饰编码蛋白质的染色体多核苷酸序列的方法。

可将本发明的编码蛋白质的多核苷酸引入宿主细胞中并且可用难以在宿主中表达的密码子来替换。此外，可延长其N-端或C-端或使其缺失，并且可修饰起始密码子以调控表达水平。

本发明多核苷酸中的每一个都可具有编码以下蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质与由SEQ ID NO：2、4和6表示的各个氨基酸序列具有至少80％，特别地至少90％，更特别地至少95％，并且甚至更特别地至少97％的同源性，只要所述多核苷酸可弱化变体的蛋白质活性。更特别地，所述多核苷酸具有分别由SEQ ID NO：1、3和5表示的多核苷酸序列。

如本文所使用的术语“同源性”是指两个氨基酸序列之间的同一性。可使用公知的方法来测定同源性，例如计算诸如分数、同一性和相似性的参数的计算机程序BLAST 2.0。

此外，可将本发明的多核苷酸序列与由SEQ ID NO：1、3和5表示的多核苷酸序列以及在严格条件下由上述核苷酸序列产生的探针杂交，并且可以是编码正常功能蛋白质的经修饰的序列。

如本文所使用的术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。或者，所述术语涉及多核苷酸或蛋白质，包括其衍生物(Molecular Cloning，A LaboratoryManual，J.Sambrook等编，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold SpringHarbor；New York，1989；或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，John Wiley&Sons，Inc.，New York)。

具体地，“严格条件”是指在65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH₂PO₄(pH 7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中杂交。SSC是pH 7的0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠。在杂交之后，在室温下在2×SSC中，然后在68℃下在0.1至0.5×SSC/0.1×SDS中洗涤DNA转移到其上的膜。

如本文所使用的术语“载体”是指这样的DNA构建体，其包含与合适的调控序列可操作地连接的靶蛋白编码基因的核苷酸序列，以便能够在合适宿主细胞中表达靶基因。调控序列包括能够起始转录的启动子、用于调控该转录的任何操纵子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于调控转录和翻译终止的序列。一旦转化到合适的宿主中，载体可复制或独立在宿主基因组起作用，或者在一些情况下可整合到基因组本身中。

用于本发明的载体没有特别限制并且可以是本领域已知的任何载体，只要其可在宿主中复制。常用载体的实例可包括天然质粒或重组质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体。例如，噬菌体载体或粘粒载体包括pWE15、M13、λBL3、λBL4、λXII、λSHII、λPII、λ10、λ11、Charon4A和Charon21A，并且质粒载体包括pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET-型质粒。可使用的载体没有特别限制，并且可使用任何已知的表达载体。具体地，可使用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。最具体地，可使用pACYC177、pCL和pCC1BAC载体。

此外，用于本发明的载体是能够转化宿主细胞，从而将编码靶蛋白的多核苷酸插入所述宿主细胞染色体中的载体。载体的具体实例包括但不限于：在大肠杆菌和棍棒型细菌(Coryne-type bacteria)中可在两个方向上自主复制的穿梭载体pECCG112(Kap-Soo，Noh，Kor.Jour.Microbiol.1991年7月，第149-154页)。

此外，可通过用于插入细菌染色体的载体来用新的多核苷酸替换染色体中编码内源靶蛋白的多核苷酸。可通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)将多核苷酸插入染色体中。因为可通过同源重组将本发明载体插入染色体中，所以其还可包含用于确认其插入染色体中的选择标记。所述选择标记用来选择经载体转化的细胞，即用来确认靶多核苷酸的插入。用于本发明的选择标记可选自提供可选择表型例如药物抗性、营养缺陷型、细胞毒性试剂抗性或表面蛋白表达的标记。在用选择性试剂处理的环境下，只有表达选择标记的细胞能够存活或示出不同的表型，从而可选择经转化的细胞。

如本文所使用的术语“转化”意为将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中以便能够在宿主细胞中表达由多核苷酸编码的蛋白质。经转化的多核苷酸包括插入宿主细胞染色体中或位于染色体外的所有基因，只要其可在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括DNA和RNA，其编码靶蛋白。只要可将多核苷酸引入宿主细胞中并使其在那里表达，可以以任何形式引入所述基因。

例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞中，所述表达盒是包含用于表达基因的所有元件的多核苷酸构建体。所述表达盒包含与所述基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。所述表达盒可以是能够自主复制的表达载体的形式。多核苷酸也可通过自身引入宿主细胞中，并且可与宿主细胞中表达所必需的序列可操作地连接。

具体地，弱化由ysaA、ydaS或ybiX基因编码的蛋白质的活性可通过使所述基因缺失来弱化。具体地，可使用化学品或光(例如UV光)诱导基因突变，从而获得具有缺失基因的变体。或者，可通过基因重组技术将染色体基因替换为缺乏活性的核苷酸，通过经同源重组进行基因置换的方法获得缺乏蛋白质活性的变体。

此外，本发明的一个实施方案还提供了用于产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法，所述方法包括培养产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述菌株被修饰以弱化选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质YsaA、具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质YdaS和具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质YbiX。

本发明的培养方法可在本领域已知的合适培养基和培养条件中进行。本领域的任何技术人员可根据所选择的菌株类型容易地对该培养方法进行修改。培养方法的实例包括但不限于：分批培养、连续培养和分批补料培养。

用于本发明微生物培养的培养基和培养条件可以是只要用于属于埃希氏菌属的微生物培养的那些培养基和培养条件，但是这些培养基和培养条件应适当地满足本发明微生物的需求。

在本发明的一个具体实施方案中，可在需氧条件下在包含合适的碳源、氮源、氨基酸、维生素等的常规培养基中培养微生物，同时调节温度、pH等。

可用于本发明的碳源包括碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨糖醇；醇类，例如糖醇、甘油、丙酮酸、乳酸和柠檬酸；以及氨基酸，例如有机酸、谷氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。此外，可使用天然有机营养源，例如淀粉水解产物、糖蜜、黑糖蜜(blackstrap molasses)、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆。具体地，有机营养源包括葡萄糖和经无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，并且可没有限制地使用合适量的碳源。

可用于本发明的氮源包括无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺；以及有机氮源，例如蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物、鱼粉或其消化产物、脱脂大豆饼或其消化产物等。这些氮源可单独使用或组合使用。培养基可包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾以及相应的含钠盐作为磷源。

可用于本发明的无机化合物包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰和碳酸钙。此外，培养基可包含氨基酸、维生素和合适的前体。这些培养基或前体可以以分批或连续的方式添加到培养基中。

在培养期间可以以合适的方式将化合物例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸添加到培养基中以调节培养基的pH。

此外，在培养期间，可使用消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来抑制气泡的形成。另外，为了使培养基保持在有氧状态，可将氧气或含氧气体注射至培养基中。此外，为了使培养基保持在缺氧状态或无氧状态，不注射气体，或者将氮气、氢气或二氧化碳气体注射至培养基中。培养基通常保持在27℃至37℃的温度下，特别地在30℃至35℃的温度下。可连续培养微生物直到获得期望水平的有用物质。具体地，培养周期为10小时至100小时。

本发明的方法还可包括纯化或回收在培养步骤中产生的L-氨基酸。可通过使用合适方法从培养基中纯化或回收期望的L-氨基酸来进行纯化或回收过程，所述合适方法根据用来培养微生物的方法来选择，例如，分批、连续或分批补料培养方法。

在下文中，将参照实施例进一步详细地描述本发明。然而，应理解，这些实施例用于说明的目的，而不意图限制本发明的范围。

实施例

实施例1：构建产生L-苏氨酸和L-色氨酸的菌株，所述菌株具有由ysaA、ydaS或 ybiX基因编码的蛋白质的弱化活性

在该实施例中，通过同源重组使产生L-色氨酸的菌株KCCM10812P(韩国专利注册号10-0792095)和产生L-苏氨酸的菌株KCCM10541(韩国专利注册号10-0576342)中的ysaA、ydaS或ybiX基因的每一个缺失。

产生L-色氨酸的亲本菌株KCCM10812P是来源于具有L-苯丙氨酸生产力的大肠杆菌变体KFCC 10066的菌株。其是具有L-色氨酸生产力的重组大肠杆菌菌株，特征在于染色体色氨酸营养缺陷型是脱敏的，pheA、trpR、mtr和tnaAB基因是弱化的并且aroG和trpE基因是经修饰的。

此外，产生L-苏氨酸的亲本菌株KCCM10541是来源于大肠杆菌KFCC10718(韩国专利公开公布号1992-0008365)的菌株。其具有L-甲硫氨酸类似物抗性、甲硫氨酸营养缺陷型表型、L-苏氨酸类似物抗性、渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型、L-赖氨酸类似物抗性和α-氨基丁酸抗性，并且能够产生L-苏氨酸。

待缺失的ysaA、ydaS和ybiX基因具有分别由SEQ ID NO：1、2和3表示的多核苷酸序列。

为了该目的，使用一步失活方法(由Datsenko KA等开发)，其是使用λred重组酶的诱变技术(Proc Natl Acad Sci USA.，(2000)97：6640-6645)。作为用于确认插入基因中的标记，使用了pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因(韩国专利公开公布号2009-0075549)。

使用pUCprmfmloxC作为模板以及引物对1和2、引物对7和8以及引物对13和14通过聚合酶链式反应(在下文中称为PCR)扩增约1200-bp的基因片段，其具有所述三种基因各自的一部分和pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因的一部分。PCR进行30个循环，每个循环由在94℃变性30秒、在55℃退火30秒和在72℃延伸1分钟组成。

[表1]

此外，使通过PCR扩增获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后将其洗脱并用作二次PCR中的模板。进行二次PCR以使得初次DNA片段的5’和3’端区域具有20对互补的核苷酸碱基。使用洗脱的初次PCR产物作为模板以及引物对3和4、引物对9和10及引物对15和16通过PCR扩增约1300-bp的基因片段，其包括所述基因的5’和3’区域。将PCR进行30个循环，每个循环由在94℃变性30秒、在55℃退火30秒和在72℃延伸1分钟组成。使通过PCR扩增获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后将其洗脱并用于重组。

根据由Datsenko KA等开发的方法(Proc Natl Acad Sci USA.，(2000)97：66406645)，使经pKD46转化的大肠杆菌菌株成为感受态的，然后用通过PCR获得的1300-bp的基因片段转化。在具有氯霉素抗性的LB培养基上对所得菌株进行选择。使用引物对5和6、引物对11和12及引物对17和18进行PCR，扩增产物的大小分别为1450bp、1530bp和1640bp，并且确认基因是缺失的。

从具有氯霉素抗性的初次重组菌株中移除pKD46，然后将pJW168载体引入菌株中，并且从细菌细胞中移除氯霉素标记基因(Gene，(2000)247，255-264)。所得细菌细胞为由引物对5和6、引物对11和12及引物对17和18所获得的约400-bp、500-bp和600-bp的扩增产物，并且确认实现了期望的基因缺失。

根据上述方法，构建了产生L-苏氨酸的菌株KCCM10541 ΔysaA、KCCM10541 ΔydaS和KCCM10541 ΔybiX。同样地，构建了产生L-色氨酸的菌株KCCM10812P ΔysaA、KCCM10812P ΔydaS和KCCM10812P △ybiX。

实施例2：构建重组的产生L-苏氨酸和L-色氨酸的菌株，所述菌株具有ysaA、ydaS 和ybiX基因中两个或更多个的缺失

根据实施例1中描述的方法，构建了具有所述基因中两个或更多个的缺失的重组菌株。

将使用λred重组酶的pKD46载体引入具有所述基因中任何一个的缺失的菌株中，然后使菌株成为感受态的。同样地，将通过PCR扩增的基因片段转化到具有所述基因之一缺失的不同菌株中，所述基因片段包括三种基因的一部分和pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因。在具有氯霉素抗性的LB培养基上筛选所得菌株，并通过使用实施例1中描述的引物对确认了所述基因组合的缺失。

根据上述方法，构建了产生L-苏氨酸的菌株KCCM10541 ΔysaA ΔydaS、KCCM10541 △ydaS △ybiX、KCCM10541 ΔybiX ΔysaA和KCCM10541 △ysaA ΔydaS ΔybiX。同样地，构建了产生L-色氨酸的菌株KCCM10812P△ysaA △ydaS、KCCM10812P ΔydaS△ybiX、KCCM10812P ΔybiX ΔysaA和KCCM10812P ΔysaA ΔydaS ΔybiX。

在如上所述获得的重组菌株之中，将KCCM10541 ΔysaA ΔydaS ΔybiX和KCCM10812P ΔysaA ΔydaS ΔybiX分别命名为“大肠杆菌CA03-4257P”和“大肠杆菌CA04-2002”，并且在2011年12月29日分别以登录号KCCM11243P和KCCM11245P保藏在国际保藏机构韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(韩国首尔西大门区弘济I洞361-221)。

实施例3：测量构建的产生L-苏氨酸的菌株和产生L-色氨酸的菌株中的ATP水平

在该实施例中，定量地测量了实施例1和实施例2中构建的菌株中的ATP水平。

为了该目的，使用由Kiyotaka Y.Hara等开发的使用荧光素酶的方法(″AnEfficient Method for Quantitative determination of Cel1u1ar ATP SyntheticActivity″，J Biom Scre，(2006)第11卷：No3：第310-17页)。

具体地，将具有不同遗传特征的菌株在含有葡萄糖的LB液体培养基中培养过夜。通过离心移除上清液，用100mM Tris-Cl(pH 7.5)洗涤细菌细胞，然后用PB缓冲液(渗透性缓冲液：40％[v/v]葡萄糖，0.8％[v/v]Triton X-100)处理30分钟以释放细胞内ATP。接着，通过离心移除上清液，将作为荧光素酶底物的荧光素添加到细胞中。使细胞静置10分钟，然后用光度计测量细胞中的荧光素酶活性以定量地测定ATP水平。测量结果在图1和图2中示出。所有结果记录为三次重复实验的平均值。

如在图1和图2中可见，由实施例1和实施例2中产生L-苏氨酸的菌株和产生L-色氨酸的菌株构建的菌株中的ATP水平均提高。此外，具有所述基因组合缺失的菌株中的ATP水平高于具有所述基因之一缺失的菌株中的ATP水平。

实施例4：在含葡萄糖培养基中检查产生L-苏氨酸的菌株的效价，所述菌株具有由 ysaA、ydaS和ybiX基因编码的单个或组合酶的弱化活性

根据实施例1和实施例2中所述的方法，从产生L-苏氨酸的菌株KCCM10541(韩国专利注册号10-0576342)中使单独或组合的ysaA、ydaS和ybiX基因缺失以提高细胞内ATP水平。使用葡糖糖作为碳源评估所得菌株的效价。

具体地，将具有不同遗传特征的菌株于33℃下在培养箱中的LB固体培养基上培养过夜并且通过接种环接种到具有下表2中所示组成的25ml含葡萄糖培养基中。然后，将菌株在培养箱中于33℃和200rpm下孵育50小时。结果在下表3中示出。所有结果记录为三瓶结果的平均值。

[表2]

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	70g
KH₂PO₄	2g
		(NH₄)₂SO₄	25g
MgSO₄·H₂O	1g
		FeSO₄·H₂O	5mg
MnSO₄·H₂O	5mg
		酵母提取物	2g
碳酸钙	30g
		pH	6.8

[表3]

＊在30小时测定

＊＊在50小时测定

如上表3中可见，我们已经证明相比于亲本菌株的葡萄糖利用率，根据本发明构建的重组的产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的葡萄糖利用率提高了高达约22％，并且相比于亲本菌株中的苏氨酸产量，重组菌株的苏氨酸产量增加了高达约7％。鉴于图1中所示的ATP水平，这些结果表明，通过提高的ATP水平增加了重组菌株的葡萄糖消耗速率或氨基酸生产力。

实施例5：在含蔗糖培养基中检查产生L-苏氨酸的菌株的效价，所述菌株具有由 ysaA、ydaS和ybiX基因编码的单个或组合酶的弱化活性

根据实施例1和实施例2中所述的方法，从产生L-苏氨酸的菌株KCCM10541(韩国专利注册号10-0576342)中使单独或组合的ysaA、ydaS和ybiX基因缺失以提高细胞内ATP水平。使用蔗糖作为碳源评估了所得菌株的效价。

具体地，将具有不同遗传特征的菌株于33℃下在培养箱中的LB固体培养基上培养过夜并且通过接种环接种到具有下表4中所示组成的25ml含蔗糖培养基中。然后，将菌株在培养箱中于33℃和200rpm下孵育48小时。结果在下表5中示出。所有结果记录为三瓶结果的平均值。

[表4]

组成	浓度(每升)
		蔗糖	70g
KH₂PO₄	2g
		(NH₄)₂SO₄	25g
MgSO₄·H₂O	1g
		FeSO₄·H₂O	5mg
MnSO₄·H₂O	5mg
		酵母提取物	2g
碳酸钙	30g
		pH	6.8

[表5]

＊在24小时测定

＊＊在48小时测定

如上表5中可见，我们已经证明相比于亲本菌株的蔗糖利用率，根据本发明构建的重组的产生L-苏氨酸的大肠杆菌菌株的蔗糖利用率提高了高达约10％，并且相比于亲本菌株中的苏氨酸产量，重组菌株的苏氨酸产量增加了高达约5％。鉴于图1中所示的ATP水平，这些结果表明，通过提高的ATP水平提高了重组菌株的活性和蔗糖消耗速率或氨基酸生产力。

实施例6：在含葡萄糖培养基中检查产生L-色氨酸的菌株的效价，所述菌株具有由 ysaA、ydaS和ybiX基因编码的单独或组合酶的弱化活性

根据实施例1和实施例2中所述的方法，从产生L-色氨酸的菌株KCCM10812P(韩国专利注册号10-0792095)中使单独或组合的ysaA、ydaS和ybiX基因缺失以提高细胞内ATP水平。使用葡糖糖作为碳源评估所得菌株的效价。

为了检查效价，将菌株通过接种环接种到LB固体培养基上，然后在培养箱中培养过夜。然后通过接种环将其接种到具有下表6中所示组成的25ml瓶状效价培养基(flasktiter medium)中。然后，将菌株在培养箱中于37℃和200rpm下孵育48小时。结果在下表7中示出。所有结果记录为三瓶结果的平均值。

[表6]

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	60g
K₂HPO₄	1g
		(NH₄)₂SO₄	10g
NaCl	1g
		MgSO₄·H₂O	1g
柠檬酸钠	5g
		酵母提取物	2g
碳酸钙	40g
		柠檬酸钠	5g
苯丙氨酸	0.15g
		酪氨酸	0.1g
pH	6.8

[表7]

＊在33小时测定

＊＊在48小时测定

如上表7中可见，我们已经证明了相比于亲本菌株的葡萄糖消耗，根据本发明构建的重组的产生L-色氨酸的大肠杆菌菌株的葡萄糖消耗增加了高达约10％，并且相比于亲本菌株中的色氨酸产量，重组菌株的色氨酸产量增加了高达约38％。鉴于图2中所示的ATP水平，这些结果表明，通过提高的ATP水平增加了重组菌株的活性和葡萄糖消耗速率或氨基酸生产力。

虽然已经参照具体的说明性实施方案描述了本发明，但是本发明所属领域中的技术人员可理解，本发明可以以其他特定形式实施而不偏离本发明的技术精神或基本特征。因此，认为上述实施方案在所有方面都是说明性的并且为非限制性的。此外，本发明的范围由所附权利要求而不是详细的描述来限定，并且应理解，来源于本发明的含义和范围的所有修改或变化及其等效方案均包括在所附权利要求的范围内。

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：

1.产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述菌株被修饰以弱化选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质YsaA、具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质YdaS和具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质YbiX。

2.根据项1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述蛋白质YsaA由以SEQ ID NO：1表示的多核苷酸序列编码，所述蛋白质YdaS由以SEQ ID NO：3表示的多核苷酸序列编码，并且所述蛋白质YbiX由以SEQ ID NO：5表示的多核苷酸序列编码。

3.根据项1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)CA03-4257P(KCCM11243P)。

4.根据项1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-色氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)CA04-2002(KCCM11245P)。

5.一种用于产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法，所述方法包括培养产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述菌株被修饰以弱化选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质(YsaA)，具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质(YdaS)和具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质(YbiX)。

6.根据项5所述的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)CA03-4257P(KCCM11243P)。

7.根据项5所述的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-色氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)CA04-2002(KCCM11245P)。

登录号

保藏机构：韩国微生物培养中心(国际)

登录号：KCCM11243P

保藏日期：2011年12月29日

保藏机构：韩国微生物培养中心(国际)

登录号：KCCM11245P

保藏日期：2011年12月29日

申请人或代理人档案号PP12-0158

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

申请人或代理人档案号PP12-0158

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 产生L-氨基酸的微生物及使用其产生L-氨基酸的方法

<130> PA11-0471

<160> 24

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 474

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

atgaaccggt ttattattgc ggatgcgacg aaatgtatcg gttgccgtac ctgtgaagtg 60

gcttgcgcag tgtcgcatca tgagaatcag gattgcgctg cgttgtcacc agacgagttt 120

atttcccgta ttcgtgtcat taaagaccac tgctggacca cggcagtagc ctgtcatcag 180

tgtgaagatg caccgtgcgc gaatgtctgc cctgttgacg cgataagccg cgaacatggg 240

catattttcg ttgaacaaac acgttgcatt ggctgtaaaa gctgtatgct ggcttgcccg 300

tttggtgcga tggaggtcgt ttcttcgcgc aaaaaggcga gggcgattaa gtgcgatctg 360

tgctggcatc gggagacggg accggcctgt gttgaagcct gcccgacaaa ggcgttgcag 420

tgcatggatg tcgagaaagt gcagcggcat cggctacggc agcagcctgt ttga 474

<210> 2

<211> 157

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Asn Arg Phe Ile Ile Ala Asp Ala Thr Lys Cys Ile Gly Cys Arg

1 5 10 15

Thr Cys Glu Val Ala Cys Ala Val Ser His His Glu Asn Gln Asp Cys

20 25 30

Ala Ala Leu Ser Pro Asp Glu Phe Ile Ser Arg Ile Arg Val Ile Lys

35 40 45

Asp His Cys Trp Thr Thr Ala Val Ala Cys His Gln Cys Glu Asp Ala

50 55 60

Pro Cys Ala Asn Val Cys Pro Val Asp Ala Ile Ser Arg Glu His Gly

65 70 75 80

His Ile Phe Val Glu Gln Thr Arg Cys Ile Gly Cys Lys Ser Cys Met

85 90 95

Leu Ala Cys Pro Phe Gly Ala Met Glu Val Val Ser Ser Arg Lys Lys

100 105 110

Ala Arg Ala Ile Lys Cys Asp Leu Cys Trp His Arg Glu Thr Gly Pro

115 120 125

Ala Cys Val Glu Ala Cys Pro Thr Lys Ala Leu Gln Cys Met Asp Val

130 135 140

Glu Lys Val Gln Arg His Arg Leu Arg Gln Gln Pro Val

145 150 155

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 3

atgaaaaaag agaactattc attcaagcaa gcttgtgctg ttgtcggtgg gcaatcagca 60

atggctaggc ttttaggtgt atcacctcca agcgtaaatc aatggatcaa aggggtacgt 120

caattgcctg ccgagagatg tccagcaatt gaacgtgcaa caagaggtga ggttctgtgc 180

gaagaacttc gtcctgatat tgactggtca tatttacgac gttcggcatg ttgttcgcag 240

aatatgtcag tgaagcaact aaatgacagt aacaaatcct catttgatca tacctga 297

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Lys Lys Glu Asn Tyr Ser Phe Lys Gln Ala Cys Ala Val Val Gly

1 5 10 15

Gly Gln Ser Ala Met Ala Arg Leu Leu Gly Val Ser Pro Pro Ser Val

20 25 30

Asn Gln Trp Ile Lys Gly Val Arg Gln Leu Pro Ala Glu Arg Cys Pro

35 40 45

Ala Ile Glu Arg Ala Thr Arg Gly Glu Val Leu Cys Glu Glu Leu Arg

50 55 60

Pro Asp Ile Asp Trp Ser Tyr Leu Arg Arg Ser Ala Cys Cys Ser Gln

65 70 75 80

Asn Met Ser Val Lys Gln Leu Asn Asp Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp

85 90 95

His Thr

<210> 5

<211> 678

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 5

atgatgtacc acattcccgg cgtgttatcg ccacaggacg tcgctcgttt tcgcgaacaa 60

ctggaacaag ccgaatgggt ggatggacgc gtcaccaccg gcgcacaagg tgcgcaagtt 120

aagaacaatc aacaggtcga cacccgcagc acgttatacg ccgccctgca aaatgaggtg 180

ctgaacgcgg ttaaccaaca tgctttattc tttgccgcgg ccttgccgcg taccctttcc 240

acgccgctgt ttaatcgcta tcagaacaat gaaacctatg gtttccatgt ggatggcgca 300

gtacgcagcc atccacaaaa cggctggatg cgtactgacc tttctgccac gctgttttta 360

agcgatccac aaagctacga cggcggcgaa ctggtcgtta atgacacctt cggacaacat 420

cgggtaaaac tcccggcagg cgatctcgtg ttgtatccct ccagcagcct gcattgcgtg 480

acacccgtaa cccgcggcgt acgagtggca tcatttatgt ggatccagtc gatgatccgc 540

gatgataaaa agcgcgccat gctgtttgaa ctggacaaca atattcagtc gctgaaaagc 600

cgctacggcg aaagtgaaga gatcctgtcg ctgcttaatc tttatcataa tctgctgcgg 660

gaatggtcgg agatctga 678

<210> 6

<211> 225

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 6

Met Met Tyr His Ile Pro Gly Val Leu Ser Pro Gln Asp Val Ala Arg

1 5 10 15

Phe Arg Glu Gln Leu Glu Gln Ala Glu Trp Val Asp Gly Arg Val Thr

20 25 30

Thr Gly Ala Gln Gly Ala Gln Val Lys Asn Asn Gln Gln Val Asp Thr

35 40 45

Arg Ser Thr Leu Tyr Ala Ala Leu Gln Asn Glu Val Leu Asn Ala Val

50 55 60

Asn Gln His Ala Leu Phe Phe Ala Ala Ala Leu Pro Arg Thr Leu Ser

65 70 75 80

Thr Pro Leu Phe Asn Arg Tyr Gln Asn Asn Glu Thr Tyr Gly Phe His

85 90 95

Val Asp Gly Ala Val Arg Ser His Pro Gln Asn Gly Trp Met Arg Thr

100 105 110

Asp Leu Ser Ala Thr Leu Phe Leu Ser Asp Pro Gln Ser Tyr Asp Gly

115 120 125

Gly Glu Leu Val Val Asn Asp Thr Phe Gly Gln His Arg Val Lys Leu

130 135 140

Pro Ala Gly Asp Leu Val Leu Tyr Pro Ser Ser Ser Leu His Cys Val

145 150 155 160

Thr Pro Val Thr Arg Gly Val Arg Val Ala Ser Phe Met Trp Ile Gln

165 170 175

Ser Met Ile Arg Asp Asp Lys Lys Arg Ala Met Leu Phe Glu Leu Asp

180 185 190

Asn Asn Ile Gln Ser Leu Lys Ser Arg Tyr Gly Glu Ser Glu Glu Ile

195 200 205

Leu Ser Leu Leu Asn Leu Tyr His Asn Leu Leu Arg Glu Trp Ser Glu

210 215 220

Ile

225

<210> 7

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 1

<400> 7

gtagggacgc gctctctggc actctgctgt tttagtgcaa aggagtgatc aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 8

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 2

<400> 8

ggcataaaca aagcgcactg ttccggcgtt gagaaacgcc ggaaaacgtt tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 3

<400> 9

gctttggaca agtgccaaaa ctttaacatt tccttcgttg gatcaaagca gtagggacgc 60

gctctctggc 70

<210> 10

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 4

<400> 10

attgaatttg gaagaatttg taggccggat aaggcgttta cgccgcatct ggcataaaca 60

aagcgcactg 70

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 5

<400> 11

gagagaaaaa tctcctgaaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 6

<400> 12

cctacatgat ttctgcaata 20

<210> 13

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 7

<400> 13

attgcgttag gcgtcgccta atatttctgt gtgtttttgg agttcattcg aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 8

<400> 14

attcgatgtg ctcatgcttg attttcatga atcatttgcc tcttgatgtt tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 15

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 9

<400> 15

ttacattagg caatccctac ccttactgca ttaggcacag cctattgaca attgcgttag 60

gcgtcgccta 70

<210> 16

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 10

<400> 16

attggctacc catgcctgcc ctttttcggc tgctagggca aacaacactg attcgatgtg 60

ctcatgcttg 70

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 11

<400> 17

tatagagcct ttcttaatcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 12

<400> 18

cgcagatatt cttcagtaat 20

<210> 19

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 13

<400> 19

catttctgat tcagatgtgg ggcgcaggcc ccactttttg gagaaattgt aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 20

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 14

<400> 20

tgtacagtta agtgtagcta atccagggac gaactcgggc agttcaagca tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 21

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 15

<400> 21

accgttatca cccgggcgag ccaagaacct tcttgctcac agccaatatg catttctgat 60

tcagatgtgg 70

<210> 22

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 16

<400> 22

gtcatcgtta gcccaaccgg atgccatatc gacctcccca tatcaatact tgtacagtta 60

agtgtagcta 70

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 17

<400> 23

aaaggttcag acggcgcggt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 18

<400> 24

taagcgcacg ccaggaatgg 20

Claims

1.产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其在产生L-苏氨酸或L-色氨酸的大肠杆菌中具有弱化的以下蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质(YbiX)。

2.根据权利要求1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述重组大肠杆菌菌株还具有弱化的选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质(YsaA)和具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质(YdaS)。

3.根据权利要求1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述蛋白质YbiX由以SEQ ID NO：5表示的多核苷酸序列编码。

4.根据权利要求2所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述蛋白质YsaA由以SEQ ID NO：1表示的多核苷酸序列编码，所述蛋白质YdaS由以SEQ ID NO：3表示的多核苷酸序列编码。

5.根据权利要求1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)KCCM11243P。

6.根据权利要求1所述的产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-色氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)KCCM11245P。

7.一种用于产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法，所述方法包括培养产生L-苏氨酸或L-色氨酸的重组大肠杆菌菌株，其在产生L-苏氨酸或L-色氨酸的大肠杆菌中具有弱化的以下蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的蛋白质YbiX。

8.根据权利要求7所述的用于产生L-苏氨酸或L-色氨酸的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株还具有弱化的选自以下的至少一种蛋白质的活性：具有由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的蛋白质YsaA和具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的蛋白质YdaS。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)KCCM11243P。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株是产生L-色氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)KCCM11245P。