TW202333581A - 由發酵液製備含胺基酸製品之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及從發酵液製備胺基酸顆粒之方法，其中，該製備的胺基酸顆粒不含細胞。

Description

由發酵液製備含胺基酸製品之方法
本發明涉及從發酵液製備移除細胞的胺基酸顆粒之方法。
作為製造飼料用之胺基酸顆粒的方法之一，使用利用微生物的發酵法，且可由微生物發酵液的直接乾燥及固化製造胺基酸顆粒。
特別地，具低溶解度的混合胺基酸的造粒方法已為習知技術(US 2021-0094903 A1)。
當從發酵液製備胺基酸顆粒時，用於發酵液製造流程的菌株(細胞)可能留在發酵液中。當胺基酸顆粒含有細胞時，有製品註冊流程變得複雜的問題，且難以在有GM菌株疑慮的國家販售該製品。此外，在顆粒的情況，有難以製造純度高於發酵液的製品的問題，但藉由移除細胞，有可製造比傳統顆粒更高含量的製品的優勢。
[習知技術文獻]
[專利文獻]
(專利文獻1)美國申請公開號2021-0094903 A1
(專利文獻2)美國專利號8465962 B2
(專利文獻3)美國專利號9885093 B2
(專利文獻4)美國專利號10351859 B2
(專利文獻5)美國專利號7863435 B2
(專利文獻6)美國專利號10787692 B2
(專利文獻7)美國專利號9029105 B2
(專利文獻8)美國申請公開號2021-0094903 A1
本發明的一個目的為提供一種因移除細胞而相較於傳統發酵液具有高胺基酸含量且各粒子尺寸含量一致及具有相較於傳統顆粒製品較少GM菌株疑慮的顆粒製品的製備方法。
此外，本發明之另一個目的為提供因移除細胞而相較於傳統發酵液具有高胺基酸含量且相較於傳統顆粒製品具有較少GM菌株疑慮的胺基酸顆粒。
本發明將於下文詳敘。同時，揭露於本發明中的各內容及實施方案亦可被應用於其他內容及實施方案。即，本發明中所揭露的各種要素的所有組合落於本發明的範疇內。另外，本發明的範疇並不受限於下述特定內容。
此外，本說明書通篇引用許多論文及專利參考文獻。所引用之論文及專利參考文獻的公開內容藉由引用的方式整體合併本文中，並將更清楚地描述本發明所屬技術領域之程度及本發明的內容。
為實現以上目的，本發明的一態樣提供一種胺基酸顆粒的製備方法，包含：
藉由從含有胺基酸的發酵液移除細胞以製備發酵濾液的第一步驟；及
從該發酵濾液形成顆粒的第二步驟。
本發明的製備方法藉由在製備胺基酸顆粒流程中移除細胞而簡化製品註冊流程，且可預先應對有基因改造(GM)疑慮的國家。此外，在顆粒的情況，有難以製造純度高於發酵液的製品的問題，但藉由移除細胞，有可製造比傳統顆粒含量更高的製品的優勢。因此，可利用本發明的製備方法多樣化製品純度。
如本文中所用，術語「胺基酸顆粒」指含有顆粒形式胺基酸的混合物。然而，如有必要，只要本發明的發明精神沒有改變可變換該胺基酸顆粒的配方。此外，如上所述，可進一步執行後續流程以實行各種胺基酸顆粒配方。上述胺基酸顆粒可用作飼料等，但其用途不限於此。
此後，將詳述依據本發明的一態樣的胺基酸顆粒製備方法的各步驟。
首先，執行藉由從含有胺基酸的發酵液移除細胞以製備發酵濾液的第一步驟。
如本文中所用，術語「移除細胞」並不限於在溶液或製品中完全不含有該細胞。具體地，從溶液或製品移除細胞指從溶液或製品單離用於製備胺 基酸發酵液的菌株至其質量可忽略的程度。因此，在為自其移除細胞的發酵液的發酵濾液、或由其製備的胺基酸顆粒、及該製品的組成物之質量分析中，由該細胞所佔的質量為可忽略的。
該第一步驟發酵液含有的胺基酸可為L-胺基酸，且具體地，該胺基酸可為具低溶解度之胺基酸。例如，可應用本發明製備方法的胺基酸可為在水中於25℃時具有大於0g/100g且小於或等於20g/100g的低溶解度的胺基酸，但不限於此。相較於現有流程，藉由應用如所述之具低溶解度之胺基酸，可期待更出色的效果。
具體地，胺基酸可以是纈胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、組胺酸或苯丙胺酸，但不限於此。
該第一步驟發酵液含有的胺基酸可藉由萃取方法、合成方法、發酵方法、酵素方法等製備。在某些情況中，胺基酸可從利用微生物藉由發酵方法製備的發酵製品提供。如本文中所用，術語「發酵製品」或「發酵液」指利用微生物酵素性或代謝性合成或分解有機質的製品。例如，可包含藉由培養基中培養微生物取得的含有微生物的培養物本身、或從其移除微生物而取得的培養物的濃縮品、乾燥製品、或凍乾製品。在此情況中，該胺基酸混合溶液可包含L-胺基酸及整體發酵製品、或可從發酵製品移除不純物。在本發明中，該含有胺基酸的發酵液可為藉由US 8465962 B2、US 9885093 B2、US 10351859 B2、US 7863435 B2、US 10787692 B2、US 9029105 B2、US 2021-0094903 A1揭露的發酵方法所取得的發酵製品的液體，但不限於此。
本發明的「含有胺基酸的發酵液」可與「含胺基酸發酵液」或「胺基酸發酵液」互換使用。
在第一步驟中製備以提供胺基酸的發酵液可為藉由培養製造L-胺基酸的微生物取得的結果。在此時，如本文中所用，術語「製造L-胺基酸的微生物」包含野生型微生物及其中自然或人工發生基因改造的微生物，且可為包含基因改造以製造所冀蛋白質或製品的微生物之如當外部基因插入或內源基因的活性增強或失活而減弱或增強特定機制的微生物等。
上述用於第一步驟的微生物可為選自短桿菌屬(Brervibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、大腸桿菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、鏈絲菌屬(Streptomyces)、或假單孢菌屬(Pseudomonas)等微生物，或其人工突變株的至少一者。因此，該第一步驟可復包含利用上述微生物至少一者製備胺基酸混合溶液的步驟。
可用於第一步驟的上述本發明的微生物中，「棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物」可包含所有棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物。具體地，可為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、粗乳酸棒狀桿菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒狀桿菌(Corynebacterium deserti)、有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、石南棒狀桿菌(Corynebacterium callunae)、停滯棒狀桿菌(Corynebacterium stationis)、單獨棒狀桿菌(Corynebacterium singulare)、耐鹽棒狀桿菌(Corynebacterium halotolerans)、紋帶棒狀桿菌(Corynebacterium striatum)、產胺棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、汙染棒狀桿菌(Corynebacterium pollutisoli)、模擬棒狀桿菌(Corynebacterium imitans)、龜口腔棒狀桿菌(Corynebacterium testudinoris)、或微黃棒狀桿菌(Corynebacterium flavescens)，及更具體地麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，但不限於此。
該棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物，具體地麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，為廣泛用於L-胺基酸及其他有用物質製造的革蘭氏陽性微生物。為了製造該L-胺基酸及其他有用物質，實施各種研究以發展高效生產的微生物及發酵流程的技術。例如，在棒狀桿菌屬(Corynebacterium)微生物中，主要使用如增加參與L-色胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-組胺酸、L-蘇胺酸等的生物合成酵素的編碼基因表現、或移除對該生物合成不必要的基因之目標材料特異性的手段。
在第一步驟中，細胞如上述從該製備的發酵液移除。如上述，細胞的移除未必指從發酵液完全移除細胞以使發酵液無菌。為了移除該細胞，可使用離心、過濾、以蛋白結晶沉澱劑處理(鹽析法)、萃取、超音波破碎(ultrasonic disruption)、超過濾、透析、諸如分子篩層析法(凝膠過濾)、吸附層析法、離子交換層析法、親和層析法等之各種層析法、HPLC、或其組合。上述方法之外，該細胞可利用所屬技術領域中習知的合適方法而從發酵液分離。
在第一步驟中，在某些情況中，可在單離細胞前執行從發酵液分離胺基酸晶體或在發酵液中溶解胺基酸晶體的步驟。該胺基酸晶體指當發酵液中含有高濃度的具有相對低溶解度的胺基酸時，一些胺基酸在發酵液中結晶。當溶液含有胺基酸晶體時，有可能在細胞移除流程期間也移除胺基酸晶體的疑慮。該胺基酸晶體可藉由在發酵液中溶解或在細胞移除前分別地單離晶體來回收，因而可預防在發酵流程中製造的胺基酸被丟棄。
當從該第一步驟中的發酵液單離胺基酸晶體時，流程效率可藉由在該第二步驟中回收單離的晶體而增加，且胺基酸顆粒中的胺基酸含量(胺基酸純度)可藉由調整胺基酸晶體的劑量來調控。
當在第一步驟中的發酵液單離胺基酸晶體時，溶劑可額外加至該發酵液。當額外加入溶劑時，該溶劑可加至達到胺基酸的溶解度。在此時，該溶劑可為水(H2O)。
此外，該第一步驟可包含加入鈣源。具體地，鈣源可在從該第一步驟中的發酵液移除細胞之前或之後加至發酵液。
如本文中所用，術語「鈣」為脊椎動物的必要礦物質，其功能為使骨骼健康及促進血液循環。超過99%的鈣在骨骼及牙齒中，而剩下的存在於血液與肌肉中。合適量的鈣保持骨骼健康並預防骨質疏鬆。其亦扮演預防藉由肌肉收縮的肌肉痙攣及藉由降低膽固醇量級來減少心血管疾病發生率之角色。然而，當鈣不足時，骨骼無法正常成型且肌肉及神經變得異常，因而即使是小創傷仍可輕易發生如骨折的傷害，且骨質疏鬆的風險增加。該鈣預防腹瀉及痢疾且亦以飼料添加劑的形式提供給動物以協助消化及吸收，特別是在仔豬。
如本文中所用，術語「鈣源」不受限地指提供鈣離子(Ca2+)的物質。鈣源的實例可包含氫氧化鈣(Ca(OH)2)、氧化鈣(CaO)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鈣(CaSO4)或氯化鈣(CaCl2)，但不限於此。
如本文中所用，術語「氫氧化鈣(Ca(OH)2)」為無色晶體或白色粉末形式的無機化合物。當溶於水中時氫氧化鈣為鹼性，且由於其不昂貴並具有低毒性，在本發明中可用作為鈣離子的來源。
如本文中所用，術語「氧化鈣(CaO)」為溶於水而產生鈣離子的物質，扮演與氫氧化鈣相同的角色。由於在水中溶解流程期間的溶解熱相對大，可在流程期間提供氫氧化鈣漿料形式，其已經先與水反應。該從氧化鈣到氫氧化鈣的反應為下式：CaO+H2O→Ca(OH)2。為了使用等同量的氫氧化鈣，即，基於鈣離子的等同莫耳比，由氫氧化鈣乘以0.76所取得的量可與水反應並加入，該0.76為氧化鈣分子量對氫氧化鈣分子量的值。如以上反應式所示，氧化鈣及水在莫耳比1：1反應，因而，額外加入的水量可由所需的氫氧化鈣減去加入的氧化鈣取得、或可加入更高的量以讓所有使用的氧化鈣反應。
在第一步驟中，可提供該鈣源使加入的鈣離子相對於含有胺基酸的發酵液中的胺基酸之莫耳比為0.02至2.0、0.05至2.0、0.07至1.5、0.1至1.0、或0.2至0.6，但不限於此。
鈣源可在鈣源加入步驟中以粉末、水溶液或漿料的形式加入，但不限於此。
如上所述，第一步驟執行後，從含有胺基酸的發酵液移除細胞，並製備發酵濾液。在執行對製備發酵濾液的第二步驟顆粒形成前，可執行濃縮該發酵濾液的濃縮步驟以增加該發酵濾液中的胺基酸濃度。
在濃縮步驟中，濃縮該發酵濾液以製備濃縮的發酵濾液。濃縮發酵濾液可指減少發酵濾液中所含的溶劑量的流程，並從而增加胺基酸的濃度。
在濃縮步驟中使用的濃縮裝置沒有限制。例如，可使用強制循環濃縮管(forced circulation concentration pipe)、及可使用槳式乾燥器(paddle dryer)、漿料乾燥設施等，但裝置不限於此。
濃縮步驟中的濃度可在大於0%(w/w)及小於或等於75%(w/w)的濃度執行。濃縮的程度指當比較發酵濾液及濃縮發酵濾液時溶劑移除(重量比)的程度。如果濃縮的程度超過範圍，該濃縮溶液變成凝膠且流動性顯著下降，使得下一步驟的推展困難。然而，該上述濃縮的程度可依據用於胺基酸顆粒製備流程中器材的形式及/或操作方法而改變。例如，該濃度可為5%(w/w)或更高及75%(w/w)或更低、10%(w/w)或更高及70%(w/w)或更低、或20%(w/w)或更高及65%(w/w)或更低，但不限於此。
在濃縮步驟中，如有需要可額外執行鈣源導入步驟。當該發酵濾液在濃縮步驟濃縮時，溶液中胺基酸的濃度增加且從而有該胺基酸可能以晶體的形式沉澱的疑慮，而該胺基酸在濃縮流程期間的沉澱可藉由加入鈣源至濃縮液預防。特別地，當該鈣源並未在上述第一步驟加入，該鈣源可在濃縮之前或之後加至發酵濾液或濃縮發酵濾液。
亦可包含粉碎濃縮液中晶體的步驟。此可利用傳統均質機執行，但不限於此。透過該粉碎步驟，發酵液中晶體的平均粒子尺寸可降低，例如，當使用流化床造粒機(fluidized bed granulator)時可預防可能發生的噴嘴堵塞。
如上所述，透過在濃縮及/或晶體粉碎化中添加鈣源可在相對高濃縮程度執行該濃縮流程，且當濃縮程度增加，移除更大量的溶劑，因此，在後續造粒流程的第二步驟需要移除的水量可降低。
接著，執行從第一步驟取得的發酵液，及在某些情況中，從第一步驟取得的發酵液的濃縮溶液之製備顆粒流程的第二步驟。
在第二步驟中，「顆粒」係宏觀粒子，其為如粉末的小粒子組成之較大尺寸的永久聚集體，且可為平均粒徑為50μm至5mm、75μm至4mm或100μm至3mm的粒子。
執行第二步驟以從粉末或細固體材料形成顆粒，該顆粒為具有預定尺寸的粒子，且可利用所屬技術領域已知的造粒方法執行而沒有限制。例如，可採用混合型造粒法，其中晶種透過進料器以恆速注入混合型造粒機，並同時透過計量液體泵供應發酵液以取得顆粒；或流化床造粒法，其中預定量的晶種導入流化床造粒機，並隨恆定速度注入預定量的發酵液以形成顆粒。特別地，復可包括乾燥取得顆粒的步驟，但不限於此。
在第二步驟中，該晶種對發酵液漿料固體混合比例可為300%(w/w)至900%(w/w)。該晶種對漿料固體混合比例可與「晶種輸入比例」交換使用。在某些情況中，該晶種的混合比例可為300%(w/w)至850%(w/w)、350%(w/w)至800%(w/w)、或300%(w/w)至800%(w/w)。顆粒的形成可藉由以上述比例導入晶種而在該流程期間加速。然而，該晶種混合比例可依據流程期間導入胺基酸的種類、該第二步驟中顆粒形成的流程操作條件等而改變，且不限於上述範圍。
如本文中所用，術語「晶種(seed)」亦稱為晶種的晶體(a crystal of a seed)或晶種晶體(seed crystal)，指用作液體結晶或造粒的催化劑的材料。具體地，本發明中的晶種可指胺基酸晶體，例如與待造粒的發酵濃縮物中含有的胺基酸相同種類的胺基酸的晶體，但不限於此。當晶種與發酵液接觸時，發酵液中存在的固體成分和晶種結合而形成聚集作用，從而形成顆粒。
例如，此時使用的晶種可具有150μm至300μm的平均粒子尺寸。具體地，可以使用具有平均粒子尺寸為150μm至250μm、200μm至300μm或200μm至250μm的晶種，但不限於此。使用的晶種粒子尺寸後續地可影響依據本發明製造的顆粒之製造率，且所屬技術領域具有通常知識者可考慮所期望的含水量適當地選擇。
此外，本發明的製備方法復可包括在第二步驟之前將出水水分率(discharged moisture rate)調整為5%(w/w)至50%(w/w)的步驟。在本發明中，術語「出水水分率」也稱為「混合水分率」，且為整個混合物中水分的比例，其可藉由從100%(w/w)的整個混合物減去總固體%(w/w)計算。就本發明而言，當將發酵液與晶種混合以行後續造粒並加至混合器時，隨著出水水分率增加，回收率降低及生產率的增加。例如，出水水分率可調整為5%(w/w)至50%(w/w)、5%(w/w)至45%(w/w)、6%(w/w)至40%(w/w)、10%(w/w)至30%(w/w)、或15%(w/w)至30%(w/w)，但不限於此。然而，如果出水水分率低於以上範圍，可能因高黏度而難以輸送漿料，且如果當出水水分率超過以上範圍時，可能有下游流程超載及造粒期間過度使用蒸汽的問題。出水水分率可依據濃縮液中含有胺基酸的種類而範圍略有不同。
出水水分率可藉由發酵液的漿料的輸入速率來確定。具體地，隨著漿料輸入速率的增加，顆粒粒子的含水量可能增加，且隨著漿料輸入速率的降低，顆粒粒子的含水量可能降低。由於輸入速率係依據發酵液漿料的規模判定，因此所屬技術領域具有通常知識者可適當選擇和判定輸入速率。
此外，本發明的製備方法復可包含選自由製備發酵液的步驟；調節pH的步驟；濃縮步驟；乾燥步驟；或分離步驟的一個或多個步驟。以上各步 驟可以利用所屬技術領域習知的方法(US 2021-0094903 A1)執行而沒有限制。更進一步，具體條件可以適當改變以優化流程，但不限於此。
依據本發明，可能從透過如上所述的第一至第二步驟移除細胞而取得胺基酸顆粒。由於胺基酸顆粒不含有細胞，該胺基酸含量可為至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、或90%或更多。因此，本發明的製備方法適合提供有高胺基酸含量的製品。
本發明的製備方法提供自其移除細胞的胺基酸顆粒。由於依據本發明提供的該胺基酸顆粒不含有細胞，其與含有細胞的其他胺基酸顆粒相比在相同重量具有較高的胺基酸含量。
此後，藉用實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅為說明的目的且本發明之範疇不意欲由或於這些實施例限制。
實施例1：製備含有色胺酸的胺基酸顆粒
在實施例1中，製備含有色胺酸的胺基酸顆粒。為此，製備含有色胺酸的發酵液(濃度90.0g/L、固體含量13.5%(w/w)、比重1.035、純度64.4%、細胞15%)，並利用離心機(PTM006，Tomoe Engineering Co.,Ltd.，4000/3500RPM，進料率2.1LPM、1號擋板(Dam))從該含色胺酸發酵液單離胺基酸晶體，然後利用板式過濾膜(陶瓷過濾系統/Pure Tech，溫度60℃，TMP 1.0，反向器40Hz)單離細胞以製備發酵濾液。在發酵濾液加入鈣源後，利用20L濃縮管(N-21NS，EYELA，水浴溫度70℃，真空壓力120Torr)濃縮胺基酸晶體，然後利用攪碎機 (Hanil Electric，SHMF-3600TG)粉碎該濃縮液中的胺基酸晶體以製備濃縮發酵濾液。在Ploughshare®混合造粒機(Lodige)中混合該濃縮發酵濾液及該製程中產生的晶體以取得製品。
產生於製程中的含色胺酸的胺基酸晶體的重量約為4.9kg，該胺基酸晶體中色胺酸的含量約為2.0kg，該胺基酸晶體含水量約為57.8%(w/w)，且該胺基酸晶體固體含量約為42.2%(w/w)。
此外，該製程使用的含色胺酸發酵濾液總重約為31.0kg，該總體積約為31.1L，該發酵濾液中色胺酸含量約為390.1g(約1.9mol)，該發酵濾液中色胺酸濃度約為12.5g/L，該發酵濾液的pH值約為5.8，該發酵濾液的固體含量約為2.5%(w/w)(0.8kg)，且該發酵濾液中含有的色胺酸的量約為總固體含量的50.3%。
導入製程的鈣源為氫氧化鈣，且輸入量約為28.3g(約0.2mol)。
該鈣源加至發酵濾液，該加入鈣源的發酵濾液的固體含量約為2.6%(796.6g)，且該加入鈣源的發酵濾液中含有的色胺酸的量約為總固體含量的49.0%。
此外，在藉由濃縮其中加入鈣源的發酵濾液而提供的濃縮發酵濾液的情況中，濃度約為240.7g/L且固體含量約為48.3wt%。
實施例1-1：製備84%色胺酸純度的胺基酸顆粒
利用實施例1中製備的濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備具有84%色胺酸純度的胺基酸顆粒。
在胺基酸顆粒中，該色胺酸純度藉由計算胺基酸顆粒中含有的色胺酸相對於總固體含量(總重減去水分佔有的重量)的重量比計算。
下表統整加至製程的濃縮發酵濾液輸入量、胺基酸晶體、晶種、及從其製備胺基酸顆粒之各要素的固體含量、含水量、及色胺酸含量。
[表1]
Figure 111149788-A0202-12-0014-1
作為製備胺基酸顆粒的結果，製備約882.0g的色胺酸顆粒，且該色胺酸顆粒的固體含量為697.7g，含水量為184.3g，且色胺酸含量為588.1g。分析色胺酸純度約為84.3%，其為色胺酸顆粒中含有的固體中的色胺酸比例，且水分比例約為20.9%。
依據在製程中製備的胺基酸顆粒中含有色胺酸顆粒尺寸之分類結果如下：
[表2]
Figure 111149788-A0202-12-0014-2
從以上實驗結果，確認了具有高色胺酸純度的胺基酸顆粒可在移除細胞後從濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備。此外，透過色胺酸顆粒尺寸分析確認各粒子尺寸的胺基酸的含量一致。
實施例1-2：製備其中含水量經調控的胺基酸顆粒
接著，在利用實施例1中製備的濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種的具有84%色胺酸純度的胺基酸顆粒之製備中，確認了是否可改變含水量並維持最終製品中的色胺酸純度。
下表統整加至製程的濃縮發酵濾液輸入量、胺基酸晶體、晶種、及從其製備胺基酸顆粒之各要素的固體含量、含水量、及色胺酸含量。
[表3]
Figure 111149788-A0202-12-0015-3
作為製備胺基酸顆粒的結果，製備約761.0g的色胺酸顆粒，且該色胺酸顆粒的固體含量為614.1g，含水量為146.9g，且色胺酸含量為515.8g。分析色胺酸純度約為84.0%，其為色胺酸顆粒中含有的固體中的色胺酸比例，且水分比例為約為19.3%。
[表4]
Figure 111149788-A0202-12-0016-4
作為製備胺基酸顆粒的結果，製備約826.0g的色胺酸顆粒，且該色胺酸顆粒的固體含量為642.5g，含水量為183.5g，且色胺酸含量為539.7g。分析色胺酸純度約為84.0%，其為色胺酸顆粒中含有的固體中的色胺酸比例，且水分比例為約為22.2%。
然而，當水分比例約為25%時，確認到造粒執行不佳。
實施例1-3：製備約90%色胺酸純度的胺基酸顆粒
接著，確認是否可利用實施例1中製備的濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備具有不同色胺酸純度的胺基酸顆粒。具體地，確認了是否可利用相同的濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備具有91%色胺酸純度的胺基酸顆粒。
下表統整加至製程的濃縮發酵濾液輸入量、胺基酸晶體、晶種、及從其製備胺基酸顆粒之各要素的固體含量、含水量、及色胺酸含量。
[表5]
Figure 111149788-A0202-12-0016-5
Figure 111149788-A0202-12-0017-6
作為製備胺基酸顆粒的結果，製備約1099.1g的色胺酸顆粒，且該色胺酸顆粒的固體含量為846.3g，含水量為252.8g，且色胺酸含量為773.5g。分析色胺酸純度約為91.4%，其為色胺酸顆粒中含有的固體中的色胺酸比例，且水分比例為約為23.0%。
依據在製程中製備的胺基酸顆粒中含有色胺酸顆粒尺寸之分類結果如下：
[表6]
Figure 111149788-A0202-12-0017-7
從以上實驗結果，確認較高色胺酸純度的胺基酸顆粒可在移除細胞後從濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備。
此外，透過色胺酸尺寸分析確認各粒子尺寸的胺基酸的含量一致。
實施例1-4：製備約70%色胺酸純度的胺基酸顆粒
接著，確認是否可利用實施例1中製備的濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備具有降低色胺酸純度的胺基酸顆粒。具體地，確認了是否可利用相同的濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備具有70%色胺酸純度的胺基酸顆粒。
下表統整加至製程的濃縮發酵濾液輸入量、胺基酸晶體、晶種、及從其製備胺基酸顆粒之各要素的固體含量、含水量、及色胺酸含量。
[表7]
Figure 111149788-A0202-12-0018-8
作為製備胺基酸顆粒的結果，製備約830.0g的色胺酸顆粒，且該色胺酸顆粒的固體含量為678.5g，含水量為151.5g，且色胺酸含量為469.6g。分析色胺酸純度約為69.2%，其為色胺酸顆粒中含有的固體中的色胺酸比例，且水分比例為約為18.2%。
相對於上述具有約70%色胺酸純度的胺基酸顆粒，確認是否可僅改變含水量而維持色胺酸純度。
[表8]
Figure 111149788-A0202-12-0019-9
作為製備胺基酸顆粒的結果，製備約900.0g的色胺酸顆粒，且該色胺酸顆粒的固體含量為710.5g，含水量為189.5g，且色胺酸含量為491.5g。分析色胺酸純度約為69.2%，其為色胺酸顆粒中含有的固體中的色胺酸比例，且水分比例為約為21.2%。
依據在製程中製備的胺基酸顆粒中含有色胺酸顆粒尺寸之分類結果如下：
[表9]
Figure 111149788-A0202-12-0019-10
從以上實驗結果，確認降低色胺酸純度的胺基酸顆粒可在移除細胞後從濃縮發酵濾液、胺基酸晶體、及晶種製備。此外，確認了製備具有不同含水量且降低純度的胺基酸顆粒是可能的。
此外，透過色胺酸顆粒尺寸分析確認對各粒子尺寸之胺基酸含量為相似的。
然而，確認到當含水量約為15%時顆粒成型不佳。
實施例2：製備含有蘇胺酸的胺基酸顆粒
在實施例2中，製備含有蘇胺酸的胺基酸顆粒。為此，製備含有蘇胺酸的發酵液(濃度221.0g/L、固體含量23.3%(w/w)、比重1.028、純度92.4%、細胞16.7%)，並利用離心機((PTM006，Tomoe Engineering Co.,Ltd.，4000/3500RPM，進料率2.1LPM、1號擋板)從該含蘇胺酸發酵液單離胺基酸晶體，然後利用板式過濾膜(陶瓷過濾系統/Pure Tech，溫度60℃，TMP 1.0，反向器40Hz)單離細胞以製備發酵濾液。在發酵濾液加入0.3莫耳比的Ca(OH)2後，利用20L濃縮管(N-21NS，EYELA，水浴溫度70℃，真空壓力120Torr)濃縮胺基酸晶體，然後利用攪碎機(Hanil Electric，SHMF-3600TG)粉碎該濃縮液中的胺基酸晶體以製備濃縮發酵濾液。利用雙滾筒乾燥機(DS-21，Daesung Machinery Co.,Ltd.，蒸氣壓力0.4bar，進料率0.5LPM，10RPM)製備該晶體。
在含有蘇胺酸的胺基酸顆粒的製備中，在造粒製程中使用Ploughshare®混合造粒機(Lodige)(實施例2-1)及流化床造粒機(FBG-3,S1 Korea Co.,Ltd.)(實施例2-2)。
實施例2-1：利用混合造粒機製備含蘇胺酸胺基酸顆粒
在含有蘇胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用Ploughshare®混合造粒機(Lodige)。用於實驗中的進料之組成(濃酸發酵濾液)如下：
[表10]
Figure 111149788-A0202-12-0021-11
接著，用於實驗中的晶種之組成如下：
[表11]
Figure 111149788-A0202-12-0021-12
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的蘇胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表12]
Figure 111149788-A0202-12-0021-13
Figure 111149788-A0202-12-0022-14
從以上實驗的結果取得具有79.2%蘇胺酸純度的胺基酸顆粒。
實施例2-2：利用流化床造粒機製備含蘇胺酸的胺基酸顆粒
在含有蘇胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用流化床造粒機(FBG-3,S1 Korea Co.,Ltd.)。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
表13
Figure 111149788-A0202-12-0022-43
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。利用先導性滾筒乾燥機製備該晶種。
[表14]
Figure 111149788-A0202-12-0022-16
Figure 111149788-A0202-12-0023-17
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的蘇胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表15]
Figure 111149788-A0202-12-0023-18
從以上實驗的結果取得具有80.9%蘇胺酸純度的胺基酸顆粒。
如上所述，確認了流化床造粒機及混合造粒機皆可用於含有蘇胺酸的胺基酸顆粒的製備。該製備的胺基酸顆粒中蘇胺酸純度在兩情況中實質上相同。
實施例3：製備含有異白胺酸的胺基酸顆粒
在實施例3中，製備含有異白胺酸的胺基酸顆粒。為此，製備含有異白胺酸的發酵液(濃度86.9g/L、固體含量10.5%(w/w)、比重1.030、純度81.0%、細胞11%)，並以如實施例2之相同方式製備濃縮發酵濾液。
在含有異白胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用Ploughshare®混合造粒機(Lodige)(實施例3-1)及流化床造粒機(FBG-3,S1 Korea Co.,Ltd.)(實施例3-2)。
實施例3-1：利用混合造粒機製備含異白胺酸胺基酸顆粒
在含有異白胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用混合造粒機。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
[表16]
Figure 111149788-A0202-12-0024-19
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。利用先導性滾筒乾燥機製備該晶種。
[表17]
Figure 111149788-A0202-12-0024-20
Figure 111149788-A0202-12-0025-21
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的異白胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表18]
Figure 111149788-A0202-12-0025-22
從以上實驗的結果取得具有69.4%異白胺酸純度的胺基酸顆粒。
實施例3-2：利用流化床造粒機製備含異白胺酸胺基酸顆粒
在含有異白胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用流化床造粒機。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
[表19]
Figure 111149788-A0202-12-0025-23
Figure 111149788-A0202-12-0026-24
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。利用先導性滾筒乾燥機製備該晶種。
[表20]
Figure 111149788-A0202-12-0026-25
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的異白胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表21]
Figure 111149788-A0202-12-0026-26
從以上實驗的結果取得具有67.9%異白胺酸純度的胺基酸顆粒。
如上所述，確認了流化床造粒機及混合造粒機皆可用於含有異白胺酸的胺基酸顆粒的製備。該製備的胺基酸顆粒中異白胺酸純度在兩情況中一致。
實施例4：製備含有纈胺酸的胺基酸顆粒
在實施例4中，製備含有纈胺酸的胺基酸顆粒。為此，製備含有纈胺酸的發酵液(濃度68.4g/L、固體含量10.1%(w/w)、比重1.020、純度66.8%、細胞5%)，並以如實施例2之相同方式製備濃縮發酵濾液。
在含有纈胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用Ploughshare®混合造粒機(Lodige)(實施例4-1)及流化床造粒機(FBG-3,S1 Korea Co.,Ltd.)(實施例4-2)。
實施例4-1：利用混合造粒機製備含纈胺酸胺基酸顆粒
在含有纈胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用混合造粒機。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
[表22]
Figure 111149788-A0202-12-0027-27
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。利用先導性滾筒乾燥機製備該晶種。
[表23]
Figure 111149788-A0202-12-0028-28
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的纈胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表24]
Figure 111149788-A0202-12-0028-29
從以上實驗的結果取得具有74.3%纈胺酸純度的胺基酸顆粒。
實施例4-2：利用流化床造粒機製備含纈胺酸胺基酸顆粒
在含有纈胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用流化床造粒機。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
[表25]
Figure 111149788-A0202-12-0029-30
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。利用先導性滾筒乾燥機製備該晶種。
[表26]
Figure 111149788-A0202-12-0029-31
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的纈胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表27]
Figure 111149788-A0202-12-0029-32
Figure 111149788-A0202-12-0030-33
從以上實驗的結果取得具有75.5%纈胺酸純度的胺基酸顆粒。
如上所述，確認了流化床造粒機及混合造粒機皆可用於含有纈胺酸的胺基酸顆粒的製備。該製備的胺基酸顆粒中纈胺酸純度在兩情況中一致。
實施例5：製備含有組胺酸的胺基酸顆粒
在實施例5中，製備含有組胺酸的胺基酸顆粒。為此，製備含有組胺酸的發酵液(濃度97.0g/L、固體含量15.4%(w/w)、純度63.0%、細胞13%)，並以如實施例2之相同方式製備濃縮發酵濾液。
在含有組胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用Ploughshare®混合造粒機(Lodige)(實施例5-1)及流化床造粒機(FBG-3,S1 Korea Co.,Ltd.)(實施例5-2)。
實施例5-1：利用混合造粒機製備含組胺酸胺基酸顆粒
在含有組胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用混合造粒機。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
[表28]
Figure 111149788-A0202-12-0030-34
Figure 111149788-A0202-12-0031-35
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。該晶種利用真空乾燥機在約100℃乾燥2小時製備。
[表29]
Figure 111149788-A0202-12-0031-36
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的組胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表30]
Figure 111149788-A0202-12-0031-37
從以上實驗的結果取得具有66.6%組胺酸純度的胺基酸顆粒。
實施例5-2：利用流化床造粒機製備組胺酸胺基酸顆粒
在含有組胺酸的胺基酸顆粒的製備中，使用流化床造粒機。用於實驗中的進料之組成(濃縮發酵濾液)如下：
[表31]
Figure 111149788-A0202-12-0032-38
接著，用於實驗中的晶種之組成如下。該晶種利用真空乾燥機在約100℃乾燥2小時製備。
[表32]
Figure 111149788-A0202-12-0032-39
藉由加入濃縮發酵濾液進料及晶種所製備的組胺酸顆粒形式之胺基酸顆粒組成分析的結果如下：
[表33]
Figure 111149788-A0202-12-0032-40
Figure 111149788-A0202-12-0033-41
從以上實驗的結果取得具有66.0%組胺酸純度的胺基酸顆粒。
如上所述，確認了流化床造粒機及混合造粒機皆可用於含有組胺酸的胺基酸顆粒的製備。該製備的胺基酸顆粒中組胺酸純度在兩情況中相似。
透過以上實施例，確認對多種胺基酸可利用多種裝置製備移除菌株的胺基酸顆粒。如以上實施例所示，當藉由移除菌株製備胺基酸顆粒時，確認到隨著胺基酸含量在最終製品中增高，以高胺基酸含量製備顆粒具優勢。
此外，確認可由調整用於製程的晶種、濃縮發酵濾液、及如有需要胺基酸晶體的輸入量利用流化床造粒機及混合造粒機製備胺基酸顆粒。
從以上描述，本發明所屬技術領域具有通常知識者將可理解，在不改變本發明的技術概念或必要特徵下，係可以不同的具體形式來實施本發明。在這方面，本文中所揭露之實施例目的僅為說明，而不應解釋為限制本發明的範疇。相反地，本發明意欲涵蓋不僅該示例性的實施例，而且可包含在由所附專利範圍所定義的本發明的精神及範疇中之多種替代方案、修改方案、等效方案、及其他實施方案。

Claims (11)

  1. 一種製備胺基酸顆粒的方法，包括：
    第一步驟，從含有胺基酸的發酵液移除細胞製備發酵濾液；以及
    第二步驟，從該發酵濾液形成顆粒。
  2. 如請求項1所述之方法，其中，該胺基酸為具有於25℃時大於0g/100g且小於或等於20g/100g之水溶解度的胺基酸。
  3. 如請求項1所述之方法，其中，該胺基酸為選自由纈胺酸、色胺酸、蘇胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、組胺酸或苯丙胺酸所組成群組中之至少一者。
  4. 如請求項1所述之方法，其中，該第一步驟包括濃縮該發酵濾液。
  5. 如請求項1所述之方法，其中，該第一步驟復包括從該發酵液分離胺基酸晶體，
    其中，提供該單離的胺基酸晶體至該第二步驟。
  6. 如請求項1所述之方法，其中，該第一步驟復包括溶解存在於該發酵液及/或發酵濾液中的胺基酸晶體。
  7. 如請求項1所述之方法，其中，該第一步驟復包括將鈣源加至該發酵液及/或發酵濾液。
  8. 如請求項7所述之方法，其中，提供該鈣源使加入的鈣離子相對胺基酸之莫耳比為0.02至2.0。
  9. 如請求項1所述之方法，其中，該方法復包括補充至少一部分該在第二步驟取得的胺基酸晶種至第三步驟的顆粒形成步驟。
  10. 一種具有50%胺基酸含量或更多且無細胞的胺基酸顆粒。
  11. 如請求項7所述之方法，其中，該胺基酸顆粒包括相對該顆粒中的胺基酸0.02至2.0莫耳比之鈣。
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