JP2575403B2 - Ｌ−トリプトファンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−トリプトファンの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 Ｌ−トリプトファンは必須アミノ酸の一つであり、医
薬品、健康食品、飼料添加物などに使用される有用な化
合物である。本発明はＬ−トリプトファンの製造方法に
関する。
薬品、健康食品、飼料添加物などに使用される有用な化
合物である。本発明はＬ−トリプトファンの製造方法に
関する。
Ｌ−トリプトファンの製造方法としては、グルコース
等を原料とする発酵法、アンスラニル酸等を出発原料と
する反発酵法の外に、インドールを原料としてＬ−セリ
ンと酵素的縮合反応させてＬ−トリプトファンを得る、
あるいはインドールとピルピン酸及びインモニアに酵素
を作用させてＬ−トリプトファンを得る酵素反応による
方法などが知られている。
等を原料とする発酵法、アンスラニル酸等を出発原料と
する反発酵法の外に、インドールを原料としてＬ−セリ
ンと酵素的縮合反応させてＬ−トリプトファンを得る、
あるいはインドールとピルピン酸及びインモニアに酵素
を作用させてＬ−トリプトファンを得る酵素反応による
方法などが知られている。
これらの酵素反応に用いる酵素、例えばトリプトファ
ンシンターゼは菌体外へ溶液状で抽出されると比較的不
安定であることが知られており、またその精製も多くの
ステップを踏まねばならず操作が繁雑である。そのため
に通常使用する場合は、酵素生産菌を培養後の酵素を菌
体内にとどめたままの菌体ごと反応系に供給する方法が
実施されている（特開昭55−148095外）。
ンシンターゼは菌体外へ溶液状で抽出されると比較的不
安定であることが知られており、またその精製も多くの
ステップを踏まねばならず操作が繁雑である。そのため
に通常使用する場合は、酵素生産菌を培養後の酵素を菌
体内にとどめたままの菌体ごと反応系に供給する方法が
実施されている（特開昭55−148095外）。
しかしながら、菌体ごと酵素源として使用する場合に
は、反応終了後使用済となった廃菌体の処理が困難であ
る。
は、反応終了後使用済となった廃菌体の処理が困難であ
る。
例えばpH調整をして活性炭などを核として、これに加
熱により菌体を凝集、吸着させ固液分離して廃菌体を除
く方法などが一般的に実施されているが（発酵と工業 V
ol 40 No.10 P906〜、特開昭59−45896）、この場合目
的とするアミノ酸は完全に溶解した状態で扱う必要があ
り、トリプトファンは水に対する溶解度が低いために処
理時に多量の水で希釈する必要がありそのため容積効率
が悪く、また凝集の核となる活性炭その他に付着、吸着
することによるロスも甚だ大である。
熱により菌体を凝集、吸着させ固液分離して廃菌体を除
く方法などが一般的に実施されているが（発酵と工業 V
ol 40 No.10 P906〜、特開昭59−45896）、この場合目
的とするアミノ酸は完全に溶解した状態で扱う必要があ
り、トリプトファンは水に対する溶解度が低いために処
理時に多量の水で希釈する必要がありそのため容積効率
が悪く、また凝集の核となる活性炭その他に付着、吸着
することによるロスも甚だ大である。
本発明者らは上記の問題を踏まえ、トリプトファンシ
ンターゼを水溶液として長時間保存しても失活させるこ
となく菌体からトリプトファンシンターゼを容易にかつ
安定的に菌体外へ水溶液状で抽出できる方法を見出し先
に出願した（特願昭62−172863）。
ンターゼを水溶液として長時間保存しても失活させるこ
となく菌体からトリプトファンシンターゼを容易にかつ
安定的に菌体外へ水溶液状で抽出できる方法を見出し先
に出願した（特願昭62−172863）。
本発明方法は、菌体から抽出した酵素水溶液を用い
て、Ｌ−トリプトファンを製造する方法を提供するもの
である。
て、Ｌ−トリプトファンを製造する方法を提供するもの
である。
即ち本発明方法は、インドールとセリンとの酵素反応
によりＬ−トリプトファンを得る方法において、菌体よ
り抽出した酵素水溶液を用いて反応を行い、得られたス
ラリー状の反応マスをアンモニアでpH10以上にして含有
Ｌ−トリプトファンを完全に溶解させて均一な溶液とな
すことを特徴とするＬ−トリプトファンの製造方法であ
り、更にその水溶液を、主として未反応のインドールを
除去するための溶媒抽出、分液などからなる精製工程に
付す方法をも含むものである。本発明方法において、イ
ンドールとセリンとの反応に用いる酵素としては特に限
定されず、トリプトファンシンターゼやトリプトファナ
ーゼ等が挙げられ、その生産菌としても特に限定はない
が、例えばトリプトファンシンターゼ生産菌としてはエ
シュリヒア・コリ MT−10232（FERM BP−19）、エシ
ュリヒア・コリ MT−10242（FERM BP−20）などの微
生物や、ノイロスポラ・クラッサ（ATCC 14692）など
の微生物を例示できる。特にエシュリヒア・コリから得
られたトリプトファンシンターゼ水溶液を用いるのが好
ましい。
によりＬ−トリプトファンを得る方法において、菌体よ
り抽出した酵素水溶液を用いて反応を行い、得られたス
ラリー状の反応マスをアンモニアでpH10以上にして含有
Ｌ−トリプトファンを完全に溶解させて均一な溶液とな
すことを特徴とするＬ−トリプトファンの製造方法であ
り、更にその水溶液を、主として未反応のインドールを
除去するための溶媒抽出、分液などからなる精製工程に
付す方法をも含むものである。本発明方法において、イ
ンドールとセリンとの反応に用いる酵素としては特に限
定されず、トリプトファンシンターゼやトリプトファナ
ーゼ等が挙げられ、その生産菌としても特に限定はない
が、例えばトリプトファンシンターゼ生産菌としてはエ
シュリヒア・コリ MT−10232（FERM BP−19）、エシ
ュリヒア・コリ MT−10242（FERM BP−20）などの微
生物や、ノイロスポラ・クラッサ（ATCC 14692）など
の微生物を例示できる。特にエシュリヒア・コリから得
られたトリプトファンシンターゼ水溶液を用いるのが好
ましい。
また例えばトリプトファンシンターゼ生産菌の培養方
法については、炭素源としてシュクロース、グルコー
ス、糖密等の糖類、グリセリン等の多価アルコール類、
クエン酸等の有機酸類、窒素源としてアンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、無機物としてリン酸一カリウム、リン酸二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガンなどを用い、また
生育に必要なアミノ酸、ビタミン、核酸類、あるいは酵
母エキス、肉エキス、ポリペプトンなどを添加して培養
を行う。
法については、炭素源としてシュクロース、グルコー
ス、糖密等の糖類、グリセリン等の多価アルコール類、
クエン酸等の有機酸類、窒素源としてアンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、無機物としてリン酸一カリウム、リン酸二カリウ
ム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガンなどを用い、また
生育に必要なアミノ酸、ビタミン、核酸類、あるいは酵
母エキス、肉エキス、ポリペプトンなどを添加して培養
を行う。
本発明に用いる酵素水溶液の調整については、特願昭
62−172863号の記載に準じて行う。
62−172863号の記載に準じて行う。
即ち、まず培養した菌体の破砕を行うが、菌体の破砕
工程においては、培養終了後の培養液をそのままあるい
は一旦、遠心分離により集菌後、バッファーなどに希釈
して行ってもよく、破砕の手段としては、超音波、磨
砕、加工剪断など物理的、機械的な破砕によるもの、あ
るいは化学的な方法がある。
工程においては、培養終了後の培養液をそのままあるい
は一旦、遠心分離により集菌後、バッファーなどに希釈
して行ってもよく、破砕の手段としては、超音波、磨
砕、加工剪断など物理的、機械的な破砕によるもの、あ
るいは化学的な方法がある。
機械的に行う場合の装置としては次のようなものがあ
る。
る。
超音波を利用するものとして日本精製機製 US−1,20
0、磨砕を利用するものとしてシンマル・エンタープラ
イズ製 Dyno−Mill KDL,加圧剪断を利用するものとし
て、SLM・AMINCO社製フレンチプレス、ブランリューベ
高圧セル破砕器などである。
0、磨砕を利用するものとしてシンマル・エンタープラ
イズ製 Dyno−Mill KDL,加圧剪断を利用するものとし
て、SLM・AMINCO社製フレンチプレス、ブランリューベ
高圧セル破砕器などである。
また化学的に行う場合には、例えば界面活性剤や、ト
ルエン、酢酸ブチル等の有機溶媒との接触により行うこ
とができる。
ルエン、酢酸ブチル等の有機溶媒との接触により行うこ
とができる。
破砕の条件は使用する破砕器の種類等によっても異な
るが、菌体濃度は５〜100g/、好ましくは30〜60g/
、pHは６〜10、また温度は酵素の失活という点から30
℃以下とすることが必要であり操作製とのかねあいより
５〜15℃で行うのが好ましい。
るが、菌体濃度は５〜100g/、好ましくは30〜60g/
、pHは６〜10、また温度は酵素の失活という点から30
℃以下とすることが必要であり操作製とのかねあいより
５〜15℃で行うのが好ましい。
破砕の程度は簡易的にOD（光学密度）の測定すること
により可能であり、十分に破砕をする必要がある。
により可能であり、十分に破砕をする必要がある。
破砕終了後は、トリプトファンシンターゼが菌体外へ
移行した懸濁液に、塩化ナトリウムを添加して40〜45℃
で熱処理を行う。
移行した懸濁液に、塩化ナトリウムを添加して40〜45℃
で熱処理を行う。
熱処理終了後の懸濁液は直ちに30℃以下冷却して遠心
分離により菌体残渣などを除き、酵素水溶液として回収
する。
分離により菌体残渣などを除き、酵素水溶液として回収
する。
得られる酵素液の活性はおよそ0.1〜0.2gトリフトフ
ァン／酵素液ml・Hrであり、所望ならこれを限外濾過膜
などを使用して濃縮した後使用しても良い。
ァン／酵素液ml・Hrであり、所望ならこれを限外濾過膜
などを使用して濃縮した後使用しても良い。
本発明における原料のＬ−セリンとインドールの装入
方法としては、インドールが酵素を阻害することを考慮
して、Ｌ−セリンを仕込んだ中にインドールを分割添加
する方法（特開昭58−16692号公報）、Ｌ−セリンを溶
解もしくは懸濁した水溶液と、インドールを溶解した有
機溶媒溶液を接触させ、インドールをフィードする方法
（特開昭59−11187号公報）、また原料としてセリンを
ラセミ化する酵素の存在下、Ｌ−セリンのかわりにDL−
セリンまたはＤ−セリンを用いる方法（特開昭57−3143
8号公報）等を用いることができる。
方法としては、インドールが酵素を阻害することを考慮
して、Ｌ−セリンを仕込んだ中にインドールを分割添加
する方法（特開昭58−16692号公報）、Ｌ−セリンを溶
解もしくは懸濁した水溶液と、インドールを溶解した有
機溶媒溶液を接触させ、インドールをフィードする方法
（特開昭59−11187号公報）、また原料としてセリンを
ラセミ化する酵素の存在下、Ｌ−セリンのかわりにDL−
セリンまたはＤ−セリンを用いる方法（特開昭57−3143
8号公報）等を用いることができる。
例えば、前記の特開昭59−11187号公報に記載の原料
装入法を用いる場合には、Ｌ−セリと硫酸アンモニウ
ム、ピリドキサールリン酸などを水媒体中に溶解もしく
は懸濁させ、Ｌ−セリンの濃度が２〜20wt％となる様に
し、一方インドールをトルエンなどの有機溶媒に溶解し
てインドール濃度が10〜40wt％の溶液とし、それらを、
インドールに対してＬ−セリンのモル比が1.0〜1.1とな
る様に反応槽に仕込み、酵素水溶液をセリン1gに対して
活性の総量が0.5〜2.0gトリプトファン/Hrとなる様に添
加して、アルカリ、好ましくは濃安水でpHを8.0〜9.0に
合わせて、反応温度を30〜50℃で20〜60Hr反応させれば
よい。
装入法を用いる場合には、Ｌ−セリと硫酸アンモニウ
ム、ピリドキサールリン酸などを水媒体中に溶解もしく
は懸濁させ、Ｌ−セリンの濃度が２〜20wt％となる様に
し、一方インドールをトルエンなどの有機溶媒に溶解し
てインドール濃度が10〜40wt％の溶液とし、それらを、
インドールに対してＬ−セリンのモル比が1.0〜1.1とな
る様に反応槽に仕込み、酵素水溶液をセリン1gに対して
活性の総量が0.5〜2.0gトリプトファン/Hrとなる様に添
加して、アルカリ、好ましくは濃安水でpHを8.0〜9.0に
合わせて、反応温度を30〜50℃で20〜60Hr反応させれば
よい。
本発明方法では、上記のような反応を実施した場合、
得られた反応液のトルエン層のインドール残分を分析す
ることにより転換率を算出できる。
得られた反応液のトルエン層のインドール残分を分析す
ることにより転換率を算出できる。
このようにして得られた反応終了後の反応マス水層中
にはＬ−トリプトファンが４〜40重量％のスラリーとな
って存在する。
にはＬ−トリプトファンが４〜40重量％のスラリーとな
って存在する。
通常、菌体ごと酵素源として使用する常法において
は、前記した如く廃菌体は反応後固液分離して除去する
必要があり、そのため反応マス中のＬ−トリプトファン
は４〜５重量％に水希釈される。しかしながら本発明に
おいては、反応マスから菌体を除去する工程は不要であ
り、多量の水希釈する必要はないので、容積効率を考慮
してＬ−トリプトファンが10重量％以上存在する状態で
反応させたほうがよい。
は、前記した如く廃菌体は反応後固液分離して除去する
必要があり、そのため反応マス中のＬ−トリプトファン
は４〜５重量％に水希釈される。しかしながら本発明に
おいては、反応マスから菌体を除去する工程は不要であ
り、多量の水希釈する必要はないので、容積効率を考慮
してＬ−トリプトファンが10重量％以上存在する状態で
反応させたほうがよい。
本発明においては、精製工程に付す前にこのスラリー
に20〜35℃程度の温度で濃アンモニア水またはアンモニ
アガスを吹き込みpH10以上、好ましくはpH11以上にして
Ｌ−トリプトファンを溶解させる。pHが10より、低いと
スラリー液中のＬ−トリプトファンは完全に溶解されな
いが、pH10以上にすればＬ−トリプトファンは急激に10
重量％以上の溶解度に達し、ほぼ均一な溶液状態とな
る。
に20〜35℃程度の温度で濃アンモニア水またはアンモニ
アガスを吹き込みpH10以上、好ましくはpH11以上にして
Ｌ−トリプトファンを溶解させる。pHが10より、低いと
スラリー液中のＬ−トリプトファンは完全に溶解されな
いが、pH10以上にすればＬ−トリプトファンは急激に10
重量％以上の溶解度に達し、ほぼ均一な溶液状態とな
る。
通常、Ｌ−トリプトファンの精製においては、廃菌体
などの不溶物を除去した後、未反応のインドールが製品
中に残存すると飼料添加物として商品価値を著しく失う
ため、トルエンなどの溶媒を用いて抽出除去する。
などの不溶物を除去した後、未反応のインドールが製品
中に残存すると飼料添加物として商品価値を著しく失う
ため、トルエンなどの溶媒を用いて抽出除去する。
本発明においては、アンモニアによりpH10以上にする
ことにより均一な高濃度水溶液となり、これより溶媒で
除去して未反応インドールを除去する場合は、不溶物の
除去等行わずにそのまま抽出、分液することが可能であ
り、精製が従来法により極めて簡略化できる。
ことにより均一な高濃度水溶液となり、これより溶媒で
除去して未反応インドールを除去する場合は、不溶物の
除去等行わずにそのまま抽出、分液することが可能であ
り、精製が従来法により極めて簡略化できる。
また場合によっては、酵素由来の不溶物や着色物質が
ごく微量精製前の溶液中に析出していることもあるが、
その場合は常法に従いセライト、活性炭などを共存さ
せ、固液分離することによりこれらは容易に除去でき、
さらに必要あらばイオン交換樹脂や多項質樹脂と接触さ
せればよい。
ごく微量精製前の溶液中に析出していることもあるが、
その場合は常法に従いセライト、活性炭などを共存さ
せ、固液分離することによりこれらは容易に除去でき、
さらに必要あらばイオン交換樹脂や多項質樹脂と接触さ
せればよい。
このように本発明方法は、Ｌ−トリプトファンを高濃
度の溶液状態で精製処理に付すことができ、その後常圧
下もしくは減圧下に60〜100℃にて加熱することによ
り、アンモニアを系外へ除くと同時に適当な濃度（10〜
20重量％）まで濃縮する。濃縮後のpHは６〜８となり、
中和の必要はない。以降、晶析、濾過、乾燥を常法に従
い実施して精Ｌ−トリプトファンを得る。
度の溶液状態で精製処理に付すことができ、その後常圧
下もしくは減圧下に60〜100℃にて加熱することによ
り、アンモニアを系外へ除くと同時に適当な濃度（10〜
20重量％）まで濃縮する。濃縮後のpHは６〜８となり、
中和の必要はない。以降、晶析、濾過、乾燥を常法に従
い実施して精Ｌ−トリプトファンを得る。
以下に実施例及び比較例を示す。
トリプトファンシンターゼ生産菌であるエシュリヒア
・コリ−MT−10242（FERM BF−20）を、500ml容坂口フ
ラスコ中に表−１に示す組成の培地100mlに接種し、35
℃で24時間培養した。この培養液500ml（坂口フラスコ
５本）を30のジャーファメンター中の表−２に示す組
成の培地15に接種し、35℃、pH6.8（28％アンモニア
水で調整）で培養した。45％グルコース液を予め殺菌し
ておき適時添加することにより計4.5kgを供給し、培養
時間48時間にて最終的な菌体濃度が、乾燥菌体30g/
（固型分濃度３重量％）の培養液17を得た。 表−１ バクト−トリプトン （Bacto−Tryptone） 10g バクト−イーストエキストラクト （Bacto−yeast extract） 5gNaCl 10g 蒸溜水で１に希釈して使用（pH7.5） 表−２ KH2PO4 2g K2HPO4 2g （NH4）2SO4 1.5g MgSO4・7H2O 2g ポリペプトン 2g 酵母エキス 2g CuCl2・2H2O 40mg MnSO4・5H2O 40mg ZnSO4・7H2O 10mg Na2MoO4・2H2O 10mg H8BO8 10mg CaCl2・2H2O 10mg CoCl2・6H2O 10mg FeSO4・7H2O 10mg AlCl3・6H2O 10mg Ｌ−トリプトファン（栄養要求性） 300mg 蒸留水で１に希釈して使用（pH6.8） 得られた培養液を遠心分離機で分離し集菌体を得た。
得られた集菌体のトリプトファンシンターゼ活性は、4g
−トリプトファン／乾燥菌体（ｇ）であった。
・コリ−MT−10242（FERM BF−20）を、500ml容坂口フ
ラスコ中に表−１に示す組成の培地100mlに接種し、35
℃で24時間培養した。この培養液500ml（坂口フラスコ
５本）を30のジャーファメンター中の表−２に示す組
成の培地15に接種し、35℃、pH6.8（28％アンモニア
水で調整）で培養した。45％グルコース液を予め殺菌し
ておき適時添加することにより計4.5kgを供給し、培養
時間48時間にて最終的な菌体濃度が、乾燥菌体30g/
（固型分濃度３重量％）の培養液17を得た。 表−１ バクト−トリプトン （Bacto−Tryptone） 10g バクト−イーストエキストラクト （Bacto−yeast extract） 5gNaCl 10g 蒸溜水で１に希釈して使用（pH7.5） 表−２ KH2PO4 2g K2HPO4 2g （NH4）2SO4 1.5g MgSO4・7H2O 2g ポリペプトン 2g 酵母エキス 2g CuCl2・2H2O 40mg MnSO4・5H2O 40mg ZnSO4・7H2O 10mg Na2MoO4・2H2O 10mg H8BO8 10mg CaCl2・2H2O 10mg CoCl2・6H2O 10mg FeSO4・7H2O 10mg AlCl3・6H2O 10mg Ｌ−トリプトファン（栄養要求性） 300mg 蒸留水で１に希釈して使用（pH6.8） 得られた培養液を遠心分離機で分離し集菌体を得た。
得られた集菌体のトリプトファンシンターゼ活性は、4g
−トリプトファン／乾燥菌体（ｇ）であった。
さらに集菌体をリン酸バッファー（pH7.5）に、乾燥
菌体30g/となる様に懸濁し、その200mlを５℃まで冷
却しフレンチプレス−細胞破砕機（SLM・AMINCO社製）
にて11,200psi（800kg/cm2）で破砕した。破砕度は破砕
前の菌体懸濁液のOD（660nm）を100として破砕終了後の
ODは10であり、十分菌体が破砕されていることが確認さ
れた。
菌体30g/となる様に懸濁し、その200mlを５℃まで冷
却しフレンチプレス−細胞破砕機（SLM・AMINCO社製）
にて11,200psi（800kg/cm2）で破砕した。破砕度は破砕
前の菌体懸濁液のOD（660nm）を100として破砕終了後の
ODは10であり、十分菌体が破砕されていることが確認さ
れた。
破砕終了後の懸濁液は液温が10℃以上とならない様に
して冷却機付高速遠心分離機で菌体残渣を除いた。
して冷却機付高速遠心分離機で菌体残渣を除いた。
菌体残渣を除いた酵素液200mlに塩化ナトリウム1gを
加えて容器ごと温湯に浸し、内温が40℃〜45℃となるよ
うに10分間保温後、直ちに氷冷した。新たに不溶物が析
出したので再び冷却機付高速遠心分離機でこれを除去
し、200mlの酵素水溶液を得た。
加えて容器ごと温湯に浸し、内温が40℃〜45℃となるよ
うに10分間保温後、直ちに氷冷した。新たに不溶物が析
出したので再び冷却機付高速遠心分離機でこれを除去
し、200mlの酵素水溶液を得た。
得られた酵素水溶液のトリプトファンシンターゼ活性
は、0.11g−トリプトファン／酵素液ml・Hrであった。
活性の菌体よりの回収率は92％であった。
は、0.11g−トリプトファン／酵素液ml・Hrであった。
活性の菌体よりの回収率は92％であった。
このようにして得た酵素液160ml及びＬ−セリンの結
晶26.8g、ピリドキサール−５′−リン酸0.02gを500ml
容セパラブルフラスコに仕込み、1N NaOHでpH8.5に調整
し、さらに水を加えて水層の重量を212.8gとした。別に
インドール26.8gをトルエン107gに溶解した溶液を作製
し、これを前記の水層と混合し、35℃の恒温水層中で20
時間攪拌反応をさせた。反応開始後２〜５時間程度で反
応器内はＬ−トリプトファンの結晶が析出し反応終了時
にはスラリーとなった。この時のトルエン層中のインド
ール残分よりＬ−トリプトファンへの転換率を算出する
と98％であった。
晶26.8g、ピリドキサール−５′−リン酸0.02gを500ml
容セパラブルフラスコに仕込み、1N NaOHでpH8.5に調整
し、さらに水を加えて水層の重量を212.8gとした。別に
インドール26.8gをトルエン107gに溶解した溶液を作製
し、これを前記の水層と混合し、35℃の恒温水層中で20
時間攪拌反応をさせた。反応開始後２〜５時間程度で反
応器内はＬ−トリプトファンの結晶が析出し反応終了時
にはスラリーとなった。この時のトルエン層中のインド
ール残分よりＬ−トリプトファンへの転換率を算出する
と98％であった。
さらに恒温槽中35℃に保温したままで濃アンモニア水
（25％）をスラリーに徐々に加え、計142g使用してpHを
11とした。この時水層中のＬ−トリプトファンは完全に
溶解し、トルエン層は上層部へ分離した。上層部のトル
エンは分液により分離回収し、新たにトルエン107gを加
えて攪拌抽出後、トルエンを再度分液により分離回収し
た。残った水層中のインドールは5ppm以下であった。
（25％）をスラリーに徐々に加え、計142g使用してpHを
11とした。この時水層中のＬ−トリプトファンは完全に
溶解し、トルエン層は上層部へ分離した。上層部のトル
エンは分液により分離回収し、新たにトルエン107gを加
えて攪拌抽出後、トルエンを再度分液により分離回収し
た。残った水層中のインドールは5ppm以下であった。
次に、水層350g（Ｌ−トリプトファン約13重量％）を
ロータリー・エバポレーターにて内温60〜80℃、真空度
100mmHg前後で、300g（Ｌ−トリプトファン約15重量
％）まで濃縮した。濃縮後にはＬ−トリプトファンが析
出し、そのpHは7.8であった。
ロータリー・エバポレーターにて内温60〜80℃、真空度
100mmHg前後で、300g（Ｌ−トリプトファン約15重量
％）まで濃縮した。濃縮後にはＬ−トリプトファンが析
出し、そのpHは7.8であった。
これを５℃に冷却して２時間晶析し減圧下ヌッチェで
濾過してＬ−トリプトファンの湿ケーキ80.2gを得て、
これを乾燥後精Ｌ−トリプトファン38.4gを得た。収率
は82％／インドールであり、また純度は99.6％、▲
〔α〕20 D▼＝−30.9、インドール1ppm以下であり、飼
料添加物公定書グレードを十分満足するものであった。
濾過してＬ−トリプトファンの湿ケーキ80.2gを得て、
これを乾燥後精Ｌ−トリプトファン38.4gを得た。収率
は82％／インドールであり、また純度は99.6％、▲
〔α〕20 D▼＝−30.9、インドール1ppm以下であり、飼
料添加物公定書グレードを十分満足するものであった。
尚、反応に用いた酵素水溶液のトリプトファンシンタ
ーゼの活性は以下のようにして試験した。
ーゼの活性は以下のようにして試験した。
下記に示した組成の反応液を使用して35℃で１時間反
応し、酵素液単位容量（ml）あたり単位時間（Hr）にＬ
−セリンとインドールから生成するＬ−トリプトファン
の量（ｇ）で表示した。
応し、酵素液単位容量（ml）あたり単位時間（Hr）にＬ
−セリンとインドールから生成するＬ−トリプトファン
の量（ｇ）で表示した。
インドール 2.0 重量％ Ｌ−セリン 1.8 〃 トリトンＸ−100 5.0 〃 ピリドキサール−５′−リン酸 0.01 〃 硫安 2.5 〃 30倍希釈の酵素液 0.5 ml 蒸留水で１に希釈して使用（pH8.5） 〔比較例〕 実施例と同様にして培養を行い集菌体を得た。この集
菌体（乾燥換算4.4g）をそのまま使用して、実施例と同
様にして、即ちＬ−セリンの結晶26.8g、ピリドキサー
ル−５′−リン酸0.02gを500ml容セパラブルフラスコに
仕込み、1N NaOHでpH8.5に調整し、さらに水を加えて水
層の重量を212.8gとした。別にインドール26.8gをトル
エン107gに溶解した溶液を作製しこれを前記の水層と混
合し、35℃の恒温水槽中で20時間攪拌反応させた。その
際反応開始時より直ちに菌体が析出してスラリーとなっ
た。反応終了後トルエン層中のインドール残分よりＬ−
トリプトファンへの転換率を算出すると95％であった。
菌体（乾燥換算4.4g）をそのまま使用して、実施例と同
様にして、即ちＬ−セリンの結晶26.8g、ピリドキサー
ル−５′−リン酸0.02gを500ml容セパラブルフラスコに
仕込み、1N NaOHでpH8.5に調整し、さらに水を加えて水
層の重量を212.8gとした。別にインドール26.8gをトル
エン107gに溶解した溶液を作製しこれを前記の水層と混
合し、35℃の恒温水槽中で20時間攪拌反応させた。その
際反応開始時より直ちに菌体が析出してスラリーとなっ
た。反応終了後トルエン層中のインドール残分よりＬ−
トリプトファンへの転換率を算出すると95％であった。
次に、水を920g加えて反応マス水層中のＬ−トリプト
ファン濃度を４％とした。この状態では水層とトルエン
層は菌体の浮遊したスラリーのため分離がされておらず
両者の分液は不可能であった。したがって、攪拌下に加
熱してトルエンは水とともに共沸回収した。
ファン濃度を４％とした。この状態では水層とトルエン
層は菌体の浮遊したスラリーのため分離がされておらず
両者の分液は不可能であった。したがって、攪拌下に加
熱してトルエンは水とともに共沸回収した。
残った水層は約1,010gであり、Ｌ−トリプトファン含
量は43.5gであった。40℃まで冷却後、濃硫酸約5gを加
えてpHを4.0に調整した。さらに活性炭（武田−精製白
サギ）を10g添加して90〜95℃に加熱して１時間攪拌
し、菌体を活性炭を核に凝集させた。加熱したままヌッ
チェにより濾過を行い約1,000gの濾液を得た。Ｌ−トリ
プトファン含量が36.9gであった。
量は43.5gであった。40℃まで冷却後、濃硫酸約5gを加
えてpHを4.0に調整した。さらに活性炭（武田−精製白
サギ）を10g添加して90〜95℃に加熱して１時間攪拌
し、菌体を活性炭を核に凝集させた。加熱したままヌッ
チェにより濾過を行い約1,000gの濾液を得た。Ｌ−トリ
プトファン含量が36.9gであった。
得られた濾液を加熱下（50〜80℃）にてトルエン107g
を加えて攪拌洗浄後トルエンを分液により回収した。残
った水層中のインドールは5ppm以下であった。
を加えて攪拌洗浄後トルエンを分液により回収した。残
った水層中のインドールは5ppm以下であった。
水層1,000gをロータリー・エバポレーターにて内温60
〜80℃、真空度100mmHg前後で250g（Ｌ−トリプトファ
ン約15重量％）まで濃縮した。濃縮液からはＬ−トリプ
トファンが析出し、そのpHは5.6であった。
〜80℃、真空度100mmHg前後で250g（Ｌ−トリプトファ
ン約15重量％）まで濃縮した。濃縮液からはＬ−トリプ
トファンが析出し、そのpHは5.6であった。
これを実施例と同様５℃に冷却して２時間晶析し、減
圧下ヌッチェで濾過してＬ−トリプトファンの湿ケーキ
57.0gを得た。これを乾燥して精Ｌ−トリプトファン29.
5gを得た。収率は63.0％／インドールであり、純度は9
9.4％、▲〔α〕20 D▼＝−30.3、インドール1ppm以下で
あった。
圧下ヌッチェで濾過してＬ−トリプトファンの湿ケーキ
57.0gを得た。これを乾燥して精Ｌ−トリプトファン29.
5gを得た。収率は63.0％／インドールであり、純度は9
9.4％、▲〔α〕20 D▼＝−30.3、インドール1ppm以下で
あった。
実施例及び比較例で示されるように、本発明方法によ
り、反応に抽出酵素水溶液を用い、また反応後アンモニ
アを添加してpH10以上にすることにより、反応液中のＬ
−トリプトファン含有量が高濃度であってもＬ−トリプ
トファンを均一な溶液に溶解させることができる。
り、反応に抽出酵素水溶液を用い、また反応後アンモニ
アを添加してpH10以上にすることにより、反応液中のＬ
−トリプトファン含有量が高濃度であってもＬ−トリプ
トファンを均一な溶液に溶解させることができる。
これにより精製、分離工程が簡略化でき、しかも容積
効率が極めてよくなり、Ｌ−トリプトファン製造の全工
程においてＬ−トリプトファン濃度を10重量％以上で操
作できる方法である。
効率が極めてよくなり、Ｌ−トリプトファン製造の全工
程においてＬ−トリプトファン濃度を10重量％以上で操
作できる方法である。
Claims (4)
- 【請求項１】インドールとセリンから、酵素反応により
Ｌ−トリプトファンを得る方法において、菌体より抽出
した酵素水溶液を用いて反応を行い、得られたスラリー
状の反応マスを精製工程に付す前に、アンモニアでpH10
以上にして、Ｌ−トリプトファンを溶解させ均一な溶液
となすことを特徴とするＬ−トリプトファンの製造方
法。 - 【請求項２】溶解された溶液中のＬ−トリプトファンの
濃度が10重量％以上である特許請求の範囲第（１）項記
載の方法。 - 【請求項３】精製工程が、溶媒抽出及び分液による特許
請求の範囲第（１）項記載の方法。 - 【請求項４】酸素水溶液が、トリプトファンシンターゼ
水溶液である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21135587A JP2575403B2 (ja) | 1987-08-27 | 1987-08-27 | Ｌ−トリプトファンの製造方法 |
| BR888803497A BR8803497A (pt) | 1987-07-13 | 1988-07-12 | Processo para preparacao de l-triptofanio e processo para preparacao de solucao enzimatica aquosa de triptofanio sintese outriptofanese |
| DK388888A DK388888A (da) | 1987-07-13 | 1988-07-12 | Fremgangsmaade til fremstilling af l-tryptophan og fremgangsmaade til fremstilling af en stabil vandig enzymoploesning |
| KR1019880008652A KR900005773B1 (ko) | 1987-07-13 | 1988-07-12 | L-트립토판의 제조방법 및 안정한 효소 수용액의 제조방법 |
| EP88306349A EP0299715A3 (en) | 1987-07-13 | 1988-07-12 | Process for preparing L-tryptophan |
| AU18985/88A AU613057B2 (en) | 1987-07-13 | 1988-07-12 | Process for preparing L-tryprophan and process for preparing a stable aqueous enzyme solution |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21135587A JP2575403B2 (ja) | 1987-08-27 | 1987-08-27 | Ｌ−トリプトファンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6455188A JPS6455188A (en) | 1989-03-02 |
| JP2575403B2 true JP2575403B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=16604596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21135587A Expired - Fee Related JP2575403B2 (ja) | 1987-07-13 | 1987-08-27 | Ｌ−トリプトファンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2575403B2 (ja) |
-
1987
- 1987-08-27 JP JP21135587A patent/JP2575403B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6455188A (en) | 1989-03-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |