JPS5948093A - Ｌ−トリプトフアンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインドールを原料として水と混和しないがイン
ドールと混和する有機溶媒の存在下、酵素反応によ、ｊ
ｌ）Ｌ−）リプトファンを製造するに際Ｌ、未反応イン
ドールを効率的に分離回収してＬ−トリプトファンを製
造する方法に関するものである。

インドールを原料として酵素反応または醗酵反応により
得られるトリプトファンは未反応インドールを含有する
とインドール特有の臭気を有することなどから、医薬用
または飼料添加剤用とも製品中に未反応インドールを含
まないことが望まれてきた。

従来、インドールを原料の１つとし酵素反応によりＬ−
）リプトファンを製造するに際し、未反応のインドール
を反応溶液から除去する方法としては水蒸気蒸留による
方法が知られている（特公昭５７−８００）。

この方法のように未反応のインドールは水蒸気蒸留によ
り留去できるが、インドールの蒸気圧は水のそれにくら
べて低いので、その留去には多酸の水蒸気を必要とする
。エネルギーコストが高くなった今日、この方法は工業
的な方法とは言えず、この問題を解決することが従来か
ら強く望まれていた。

本発明者らは、この問題を解決すべく鋭意検討した結果
、基質であるインドールと混和するが水と混和しない有
機溶媒の存在下、酵素を用いＬ−トリプトファンを製造
し、反応終了後との反応／Ｉケを分液することにより未
反応インドールが除去できることを見出し、本発明の方
法を完成するに到った。

すなわち、水と混和しないがインドールと混和する有機
溶媒の存在下、微生物を用いた反応を実施すると、有機
溶媒相はインドールを水相へ供給する役割と同時にイン
ドールを水相から抽出する役割も果たしてい乙。このた
め、水相と有機溶媒相での反応が２相のま＼実施されて
いる場合は、反応終了後、反応液をただ分液して有機溶
媒相を分離ずれば、未反応インドールを含−まないＬ−
トリプトファン反応溶液を得ることができる。

本発明の方法によれば、未反応インドールを確実に除去
できるばかりでなく、分液回収されたインドールを含む
有機溶媒相はそのまま次の反応に再使用できるので、そ
の工業的意義はきわめて大きい。

本発明の方法に適用されるＬ　−）　ＩＪブトファンの
製造法としては、例えばエシエリヒヤ・コリの存在下Ｌ
−セリンとインドールよシ製造する方法、また、エシエ
リヒヤ・コリおよびンユ−トモナス伊プチーダの存在下
インドールとＤ　Ｊ、−セリンより製造する方法、エシ
ェリヒヤコリおよびリュートモナス・ゾ／クタータの存
在下インドールとＪ）Ｌ−セリンより製造する方法、ア
エロバクタ−・アエロバクタの存在下インドールとビル
ピノ酸、アンモニアよシ製造する方法である。

これ等のトリジ１−ファンの製造はインドールと混和す
るが水と混和しない有（幾溶媒を用い水相との２相系で
実施する。すなわち、有機溶媒を使用すれば、反応に用
いられる酵素がインド−ルにより（１は害を受けるよう
な場合水相中のインドール濃度を酵素活性を１り１害す
る濃度以［−に保ちながら反応を実施することができる
。

本発明の方法で適用される有機溶媒としては、水と混和
しないでインドールと混和するイｊ機心媒であれば使用
可能である３、実際−にはインドールの抽出溶媒である
と同時にトリプトファノ製造のための反応溶媒でもある
ので反応に使用する微生物の活性に影響を力えないこと
が重要である。このような有機溶媒として、例えばベン
ゼン、トルエン、クロルベンゼンなどの芳香族炭化水素
、メチルインブチルケトン、ジインブチルケトンなどの
ケトン類、クエン酸エステル類、ｎ〜ブチルアセテート
、インアミルアセ；ｉ−）、エチルブチレートなどのエ
ステル類、ア三ソールなどのエーテル類などが好ましい
。

本発明の方法では、上記のようなインドールと混和し水
と混和しない有機溶媒を酵素含有液に添加することによ
り、酵素の活性を低下させるインドールを有機溶媒相に
ほとんど溶解させ、有機溶媒相と水和量のインドールの
分配比より水相中のインドール濃度を実質的に阻害濃度
以下に抑えて反応を進行させることができる。

また、本発明に用いられる酵素類は、必ずしも純粋であ
る必要はなく、通常、それぞれのｆｉ？素の生産菌の培
養液から遠心分離などの方法により処理などの処理によ
り得られた菌体処理物、さらにはこれらの菌体からの抽
出物ならびに該抽出′吻より得られる酵素等の粗製物が
用いられる３、本発明の方法において反応は反応媒体、
インド−ルその他の基質、酵素及びその他必要な物を２
Ｌｌ＋合して実施する。

反応媒体としての有機溶媒は前記のような、インドール
と混和し、水と混和しないものであれｄ。

良いが、実際−１暑佳反応に使用する酵素に応じ、反応
条件下で、溶媒自身が酵素の活性劣化を起さないものを
選ぶ必要がある。。

使用する有機溶媒は酵素含有液と有］幾溶媒七の２相間
におけるインドールの分配比、あらかじめ測定した酵素
含有液中でのインドールによる阻害濃度からその使用量
を決めると七ができる、。

以−にの反応について、インドールとＬ　ｉたはＤＩ・
−七リンからＬ−１−リプトファンを製へする例を以下
に示す。

この方法において、酵素としてエシェリヒア・コリ変異
株を使用するが、エシェリヒア・コリ変異株を含有する
液において、インドールの阻害濃度はおよそ８００　ｐ
ｐｍである。

従って、インドールを水相中、この濃度以下に分配する
有機溶媒、例えば、トルエン、クロルベンゼン、クエン
酸エチル、メチルイソブチルケトン、アニソールなどを
選択して使用することができる。

例えば、トルエンを選択した場合、２０ｗｔ％濃度のイ
ンドール溶液を使用すれば、インドールはエシェリヒア
・コリ変異株を含有する液中に７２０ｐｐｍ以下で溶解
し、前記の阻害濃度以下で反応を実施することができる
。

同様に、他の溶媒では、つぎのようなインドール濃度に
すれば反応条件下酵素含有液中のインドール濃度を８０
０　ｐｐｍ以下にすることができる。すなわち、クエン
酸エチルでは４０ｗｔ％、メチルイソブチルケトンでは
５０ｗｔ％、アニソールではろ［］　ｗｔ％およびモノ
クロベンゼンでは２０ｗｔ％である。

上記のＬ−）リフトファン要求性エシェリヒア・コリの
トリプトファナーゼ欠損変異株を炭素および窒素源なら
びに無機塩を含有する培地を用いてり、　−）、　１．
１グトフアンの酵素的な製造を実Ｍ！ｌするには、まず
好気性の条件下２８〜４０℃、ｐＨ６〜８の条件でエシ
ェリヒア・コリ変異株を培養し、菌体をその培養液のま
ままたは培地から分離してピリドキザールリン酸塩およ
びＬ−セリン、無機物を溶解した溶液に懸濁させる。ｐ
Ｈ７５〜９５好ましくはｐＨ８〜９の条件下水と混和し
ないがインドールと混和する有機溶媒に溶解したインド
ール溶液を一括、あるいは連続的に加え２０〜４０℃の
範囲で反応を行いＬ−）リプトファンを生成せしめ乙。

この際、有機溶媒の使用量は反応条件下での酵素含有液
相と有機溶媒相との間のインドール分配比と、インドー
ル使用量により決するため、各種有機溶媒によりその使
用量は異なるが、通常（佳酵素含有液相中のインドール
濃度が８００　ｐｐ＋ｎ以Ｆ、工業的に好ましくは７５
０　ｐｐ＋η以丁になるように決めれば良い。

この際、反応生成物である１、　−）　ＩＪブトファン
は酵素含有液中に結晶として析出してくるが、この反応
条件下では、反応の進行に何ら影響を与えない。

この製造法において、基質にＤＬ−セリンを用いても何
ら差１〜つかえない。すなわち、この際はセリンラセマ
ーゼとしてシュードモナス０プテイーダ（ＭＴ−１０１
８２）、またはシュードモナス・プンクタータ（Ｍ　Ｔ
−１０２４３）を用いることにより有機溶媒による活性
劣化を受けることなくＬ−トリプトファンを高収率で得
ることができる。

得られた反応液は生成したＬ）ＩＪブトファン、未反応
原料、有機溶媒および酵素等を含有する反応混合物であ
わ、この反応液を有機溶媒相と水相に分液する。

本発明の方法では、通常、反応混合物をまず２、　　　
　　相に分液１〜、分液後、溶媒相を回収する。水相、
すなわち、Ｌ−’）リブトファンを含有する反応混合液
からは、そこに含−まれる酵素を除去して、Ｌ−トリプ
トファンを取得する。反応混合物中に酵素と有機溶媒と
が共存した状態では水相と有機溶媒相の２相間の界面が
不明確になることがあり分液が困難と々ることかある。

このような点きは、公知の方法、例えば遠心分離機にか
けることにより容易に分液分離することができる。この
際、使用した有機溶媒で再び抽出・分液を繰り返すとイ
ンドールの除去効果は一段と向−トする。

また、分液するさい１．水溶液中のＬ　−トＩＪブトフ
ァンは結晶が析出したま＼でも良いが溶解した状態であ
れば未反応インドールの抽出効果は一層良い。

分液する時の温度は水あるいは使用した有機溶なお分液
回収されたインドール溶液はその溶液のま５次の反応に
使用しても伺ら問題々い。

反応液中の未反応インドールを抽出介有する有機溶媒を
分液分啼した後、反応混合物中から反応に使用した酵素
を除去する方法は特に限定されるものではない。工業的
に除去する有功なｌ法としては例えば次の方法が好まし
〈実施できる。すなわち有機溶媒を除去した後の反応混
合物中に鉱酸を添加し液のｐＨを２〜５とする。しかる
後に必要に応じて加熱する。このような方法で酵素の凝
集を促進させ１酵素の凝集物をｒ過等の方法により除去
することができる。酵素を除去した反応溶液は濃縮して
ＴＪ−４リプトフア／を得ることができる。

以−ヒの方法により反応溶液中の未反応インドールは有
機溶媒中に効果的に溶解分液される。未反応インドール
を含有する有機溶媒は必要によシ新しい溶媒を追加した
り新インドールを補充追加して次の反応に使用する。

本発明の方法がインドールを基質の１つとして酵素の存
在下Ｌ−）リプトファ／を製造する際、有効な方法であ
る理由は、回収されたインドールの再使用が可能なこと
にある。すなわち、一般に酵素反応でＬ　７１Ｊブトフ
アンを製造する際反応混合物中より反応に使用した酵素
などを一般的な方法で分離し、次いでＬ−）リプドアフ
ァンを単離するが、この際得られる未反応原料を含む溶
液を多く、工業化する場合大きな問題−あつた。しかる
に本発明の方法にしたがい有機溶媒により反応混合物中
より未反応インドールの抽出を実施するとＬ−トリプト
ファン結晶中のインドール含有率を低減できるばかりで
なく、有機溶媒で抽出されたインドールはその溶液状態
でそのまま次の反応に再使用しても何ら酵素、活性に阻
害を力えることなく反応が進行する。

本発明の方法は、単にＬ−トリプトファン製品中のイン
ドールを除去する目的たけでなく、原料であるインドー
ルを回収再匝用する点で極めて工業上の意義は大きい。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する、。

実施例１ リン酸−カリ、リン酸二カリ、硫安および塩化カルシウ
ム、硫酸鉄などのミネラル、酵母エキス、ポリペプトン
などの存在下エシェリヒャ・コリを含んだ菌体をｐＨ７
，０で３０℃の条件下、空気を吹き込みながらグルコー
ス、インドールを添加しながら培養を実施する。まだ同
様の培地にグルコースのみを添加しながらｐＨ７，０，
６０℃の条件下、空気を吹き込みながらシュードモナス
・プチーダを含んだ菌体を培養する。それぞれの菌体は
４０時間後に６０〜３５ｆｌ／ｌの濃度まで培養され、
通常の超遠心分離機により含水率７５〜８しチの湿潤沢
塊として取り出すことができる。

次Ｋｎｂ−セリン１１３１、硫酸アンモニウム６０グ、
ピリドキザールリン酸１０ｍ９および蒸留水６６ｆ／を
入れたろ００罰フラスコをかきまぜながら６５℃でｐＨ
を８，５に２９％アンモニア水で調整する。

次にエシエリヒヤ・コリを含んだ菌体ｒ塊４０１、シュ
ードモナス・プチーダを含んだ菌体ηゴ塊２．５２を加
え５５℃で良くかきまぜ分散させる。

さらにインドール１１５ｖをジインブチルケトン２６８
グに溶解した溶液を加え、３５℃で４０時間回転数９　
Ｏｒｐｍでかきまぜ反応させる。

反応終了後、攪拌を止め静置し２相に分離した上相のジ
イソブチルケトン相を分液し、更に同液量のジイソブチ
ルケトンを加え、９０　ｒｐｍで・６０分攪拌したのち
静置し先き吉同様にしてジイソブチルケトン相を分液回
収した。　” この結果、反応終了後反応系に残存していた未反応イン
ドールは、１回目のジイソブチルケト７分液により８５
％回収され、さらに２回目の抽出分液によシタ９チ回収
されていた。インドール分析はガスクロマトグラフィ、
−により実施しだ。

この回収ジイソブチルケトンは、必要量のインドールを
補給し、次の反応に用いても何ら間順なかった。

実施例２ 実施例１と同様にして、トルエン４５．７　ｆｌを用い
反応を実施した。反応では、撹拌回転数６４Ｏｒｐｍで
実施しだ。反応終了後、反応系は均一のエマルジョン系
になっているため、２相の界面をはつきりさせるため遠
心分離機にかけた。

上相のトルエン相を分液し、さらに同量のトルエンを加
え、未反応インドールの抽出を繰、収した。

仁の結果、反応終了後の反応液中の未成１．（“Ｌ、イ
／・ドールに対し、１回目の抽出で８７９６．２回目の
抽出で９９９チが回収された。

なお、このインドールを含んだ回収トルエンは、必要量
のインドールを補給し、次の反応に用いても何ら問題な
かった。

実施例ろ 実施例１と同様にして、クエン酸エチル１４６１を用い
反応を実施しだ。反応終了後、均一のエマルジョン系に
なっている反応生成物を、連続遠心分離機にかけ水相系
とクエン酸エチル系に分液した。この水相系に反応に使
用したクエン酸エチルと同量を添加ｌ〜、再び連続遠心
分離機により水相と有機相を分離した。

この水相の一部をサンプリングし、高速液体クロマトグ
ラフィーにより生成したトリプトファンを分析測定した
ところ、収率は９９７係対インドールであった。

この反応生成物を、Ｌ−トリプトファン濃度が４、２　
ｖｖｔ％になるように水で希釈し、硫酸でｐＨを６５に
調整し、粉末活性炭を１５ｗ’ｔ％対し一トリプトファ
ン添加し、９８〜１００℃で１時間加熱した。Ｌ−トリ
ブトファン結晶が完全に溶解しだら、同温度で熱時吸引
ｆ過し、活性炭と共に反応に用いた菌体を除去する。

この熱ｒ過液を、Ｌ−ト＋）ブトファン濃度が１０ｗｔ
係になるまで濃縮し、１０’Ｃまで冷却した後、ｐＨを
５９に調整後析出した結晶をｆ別、水洗、乾燥した。

Ｌ−トリプトファンの単離収率７４５　ｒｎｏｔ％対イ
ンドールで、純度９９４係インドール含有量１２ｐμｎ
のリン片状晶が得られた。

なお、クエン酸エチル抽出で回収されたインドールは、
不足分を補給したのち、次の反応に用いたが、Ｌ−トリ
プトファンの収率には影響はなく、反応は順調に進行し
た。

実施例４ 実施例１と同様にして、エンエリヒャ・コリを含んだ菌
体、およびシュードモナス／・プチーダを含んだ菌体を
培養し、超遠心分離機により含水率７５％のそれぞれの
菌体１塊を得た。

次にＤ　Ｌ−セリン７Ｚ３２、硫安１０５グ、水４８６
７を入れたフラスコを２９チアンモニア水でｐＨ８，５
に調整したのち、先きに得たエシエリヒャ・コリ菌体Ｐ
塊５１．２ｆ、シュードモナス・プチーダ菌体ｒ塊２０
２グを加えた。よくかきまぜ分散させたのち、インドー
ル７８．４２を溶解したトルエン溶液３９２２を加え、
６５℃で４８時間反応させた。

反応終了後、反応液の一部を採取し、遠心分離機にてト
ルエン相と水相を分離する。Ｌ−）リプトファンの結晶
が析出している水相を、アルカリ添加によりＬ〜トリプ
トファンを溶解したのち、メンブランフィルタ−で菌体
を除去する。このｒ液を、高速液体クロマトグラフィー
でＬ−）リストファン収率を分析し、反応液中のＬ−１
−ＩＪブトファン収率を求めたところ９９．３　ｍｏ７
％対インドールであった。

次に、この反応液を遠心分離機により水相とトルエン相
を分液し、ガスクロマトグラフィーでトルエン中に含ま
れる未反応インドール濃度を測定したら２．５ｐｐｍで
あった。

なお、このインドールを含んだトルエン溶液に必要量６
イ・イトールを添加し、次の反応に用いたがＬ−）リス
トファン収率に何ら影響を与えることなく反応はハ「調
に進行した。すなわち、回収トルエン相　　　　Ｌ−ト
リプトファン反応収率０　　　　　　　　　　　　　　
９９ろ１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９８
５２　　　　　　　　　　　　９８９ ろ９９２ ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９８２５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　９９４一方、遠心
分離で回収された水相シま、Ｌ　−）　！ｊブトファン
濃度が４．２　ｗｔ％になるように水で希釈し、９８％
硫酸でｐＨ４，０に調整した。粉末活性炭を２７７加え
、９８℃に昇温後、９８〜１００℃で１時間保温し析出
しているＬ−トリプトファンの結晶を溶解した。

４熱ｒ過により活性炭と共に菌体をＪｊ別し、このｒ液
をＬ−１リプトファンａ度が１５　ｗｔ％になるように
濃縮晶析した。析出したリン片状のＴ、−）リプトファ
ノ結晶を１０℃でｒ別し、水洗後乾燥すると、純度９９
２チの淡黄色リン片状晶のｂ−トリプトファンが収率８
１．３　ｍｏｌ　％対インドールで得られた。比旋光度
−６１８、重金属含有数２０　ｐｐｍ以下、強熱残分０
．０２　ｗｔ％、アンモニウム含有数０．０Ｉ　ｗｔ係
であった。

特許出願人 三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）インドールを基質の１つとして、水と混和しないが
   インドールと混和する有機溶媒の存在下、酵素反応によ
   ｐＬ＝ｌ−リプトファンを製造するに際し、反応混合液
   中の未反応インドールを有機溶媒相として分液除去する
   ことを特徴とするＬ−）リプトファンの製造方法