JPS5928488A - トリプトフアンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インドールを原料として酵素反応によりＬ−
トリプトファンを製造するに際し、未反応インドールを
分離回収する方法に関するもので応により得られるトリ
プトファンは、未反応インドールを含有するとインドー
ル特有の臭気を有することなどから、医薬用または飼料
添加剤用トリプトファンとも製品中に未反応インドール
を含まないことが望まれてきた。

従来、インドールを原料の１つとし酵素反応によりｌ、
−）リプトファンを製造するに際し、未反応のインドー
ルを反応溶液から除去する方法としては水蒸気蒸留によ
る方法が知られている（特公昭５７−８００号公報）。

この方法のように未反応のインドールは水蒸気蒸留によ
り留去できるが、インドールの蒸気圧は水のそれにくら
べて低いので、その留去には多量の水蒸気を必要とする
。エネルギーコストが高くなった今日、この方法は工業
的な方法とは言えず、この問題を解決することが従来か
ら強く望まれていた。

本発明者らは、この問題を解決すべく鋭意検討した結果
、基質であるインドールと混和するが水と混和しない有
機溶媒の存在下、酵素を用いＬ　−トリプトファンを製
造し、この反応液より有機溶媒を回収、酵素を除去して
得られたＬ　−トＩＪプトファン水溶液中の未反応イン
ドールを前記の有機溶媒により抽出分離することで、イ
ンドールを含まないＬ−）リプトファンを取得し、併せ
て抽出した未反応インドールを含む有機溶媒を反応に再
使用することを特徴とする本発明の方法を完成するに到
った。

本発明の方法によれば、反応液中の未反応インドールを
確実に除去できるばかりでなく、抽出回収されたインド
ール溶液はそのまま次の反応に再使用できるので、その
工業的意義はきわめて大きい。

本発明の方法が適用されるＬ　−）　ＩＪブトファンの
製造法としては、例えばエシェリヒア・コリの存在下Ｌ
−セリンとインドールより製造する方法、また、エシェ
リヒア・コリおよびンユードモナス争プチーダの存在下
インドールとＤＬ−セリンより製造する方法、エシェリ
ヒアコリおよびシュードモナス・プンクタータの存在下
インドールとＤＬ−セリンより製造する方法、アエロバ
クタ−・アエロバクタの存在下インドールとピルビン酸
、アンモニアよＦ）製造する方法等がある。

これ等のトリプトファンの製造はインドールと混和する
が水と混和しない有機溶媒を用い水相との２相系で実施
することが好ましい。すなわち、これらの有機溶媒を使
用すれば、反応に用いられる酵素がインドールにより阻
害を受けるような場合に、水相中のインドール濃度を酵
素活性を阻害する濃度以下に保ちながら反応を実施する
ことができる。

本発明に適用される有機溶媒としては、水と混和しない
がインドールと混和する有機溶媒であれば使用可能であ
る。実際上はインドールの抽出溶媒であると同時にトリ
プトファン製造のための反応溶媒でもあるので、反応に
使用する微生物の活性に影響を与えないことが重要でベ
ンゼン、トルエン、クロルベンゼンなどの芳香族炭化水
素、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトンなど
のケトン類、クエン酸エステル類、ｎ−ブチルアセテー
ト、イソアミルアセテート、エチルブチレートナトのエ
ステル類、アニソールなどのニーチル類などが好ましい
。

本発明の方法を適応するｌ、−）リプトファンの製造法
は、まず適宜選択された酵素、および有機溶媒の存在下
、インドールを基質の１つとして用い適応する反応条件
で実施する。得られた反応液は生成したＬ−トリプトフ
ァン、未反応原料、有機溶媒および酵素などを含有する
反応混合物であり、この反応液から有機溶媒の回収、お
よび酵素の除去を行なう。反応混合物中に酵素と有機溶
媒とが共存した状態で激しく攪拌すると、水相と有機溶
媒相の２相間の界面が不明確になることがあり、未反応
インドールを抽出した有機溶媒の分離が困難となる。

この現象な避けるために、本発明の方法では、通常、反
応混合物からまず有機溶媒を回収する。

溶媒の回収は通常の蒸留などの方法で実施できる。

ついで、有機溶媒を回収した後の反応混合物に含まれて
いる酵素を除去する。

反応混合物中から反応に使用した酵素を除去する方法は
、特に限定されるものではない。工業的に除去する有効
な方法としては、例えば、次の方法が好まし〈実施でき
る。すなわち、有機溶媒を除去した後の反応混合物中に
鉱酸を添加し液のｐＨ＆２〜５とする。しかる後に必要
に応じて加熱する。このような方法で酵素の凝集を促進
させ、この凝集物をｒ過等の方法により除去することが
できる。酵素を除去した反応溶液は必要に応じて濃縮し
ても良い。しかし、反応液中の未反応インドールを効率
良く抽出分離するにはＬ−トリプトファン結晶を溶解し
ておくことが好ましい。これはＬ　−トＩＪブトファン
が水溶媒中で結晶を生成する場合、水中に混在する分子
構造の良く似た未反応インドールを巻き込んで結晶化し
、未反応インドールの抽出が事実上困難となるためであ
る。そのため、有機溶媒による抽出操作をする際の反応
溶液は、処理温度に応じてＬ−トリプトファンが溶液状
態になる濃度とする。

上記のようにして酵素を除去した反応混合液から未反応
インドールを有機溶媒で抽出する。この際、使用される
有機溶媒は前記反応に使用される有機溶媒の中から適宜
選択して使用できる。通常は反応に使用したものと同種
のものが使用されるので、前記の回収された有機溶媒を
使用すればよい。しかし、この使用溶媒は反応に使用し
た溶媒に限定されるものではなく、トリプトファンの反
応および未反応インドールの抽出に、それぞれ特に効果
的な混合溶媒および特定の溶媒で実施できる場合は、適
宜溶媒を選択して使用しても良い。

本発明の方法がインドールを基質の１つとして酵素の存
在下、Ｌ−トリプトファンを製造する際の有効な方法で
ある理由は、回収されたインドールの再使用が可能なこ
とにある。すなわち、一般に酵素反応でＬ−）リプトフ
ァンを製造する際、反応混合物中より反応に使用した酵
素などを一般的な方法で分離し、次いでＬ−トリプトフ
ァンな単離するが、この際回収される未反応原料を含む
溶液をそのま匁再使用すると酵素活性を阻害することが
多く、工業化する場合大きな問題であった。

しかしながら、本発明の方法にしたがい有機溶媒により
反応混合物中より未反応インドールの抽出を実施すると
、Ｌ−）リプトファン結晶中のインドール含有率を低減
できるばかりでなく、有機溶媒で抽出されたインドール
はその溶液状態でそのまま次の反応に再使用しても、酵
素活性に何ら阻害を与えることなく反応が進行する。

また、未反応インドールの抽出の際の有機溶媒の使用量
は有機溶媒と水との間のインドール分離比により異なる
し、またインドールの反応率によっても異なるが、工業
的には一定の比活性をもった酵素が得られインドールの
反応率も一定値を示すので抽出に用いる有機溶媒の使用
量は容易に決定することができる。

未反応インドールの抽出操作は特に限定されることはな
く、常法によれば良い。すなわち、一般的には酵素を除
去した後の反応溶液中に適量の有機溶媒を加え攪拌し水
相と有機相を十分に接触させる。この際、Ｌ−）リプト
ファンの結晶が析出してない状態が好ましいのは前記の
通りであり、工業的にはＬ　−トリプトファンの水への
溶解度を増すため加温した状態で実施すると効果的であ
る。

以上のように２相を均一に接触した後、静置し２相を分
離し水相と有機溶媒相を分離する。この抽出操作は回分
式で実施しても良いが、工業的には向流抽出法による連
続抽出で実施される。

以下の方法により反応溶液中の未反応インドールは有機
溶媒中に効果的に抽出・分液される。未反応インドール
を抽出し含有する有機溶媒は必要により新しい溶媒を追
加したり、混合溶媒系で反応を実施する場合は、他の溶
媒と混合し、新インドールを補充追加して次の反応に使
用する。

本発明の方法により、酵素反応においてしばしば起こる
酵素比活性の変動によるインドールの転化率の変動に対
しても未反応インドールを効率よく回収でき、しかも抽
出回収されたインドールをそのま〜再使用しても、酵素
活性に何ら阻害を与えることなく反応が実施できること
からその工業的意義は太きい。

また、本発明の方法を利用すれば、水溶媒のみで実施し
た酵素を用いるＬ−）ＩＪブトファンの反応液からも未
反応インドールを効果的に抽出回収できることは言うま
でもない。

以下、実施例をもって本発明の方法を詳細に説明する。

実施例１ リン酸−カリ、リン酸二カリ、硫安、および塩化カルシ
ウム、硫酸鉄などのミネラル、酵母エキス、ポリペプト
ンなどの存在下エシエリヒヤ・コリを含んだ菌体をｐＨ
７で３０℃の条件下空気を吹込みながら、グルコース；
インドールを添加しながら培養を実施する。また同様の
培地にゲルコールを添加しながらｐＨ７，３０℃の条件
下空気を吹込みながらシュードモナス・プチーダを含ん
だ菌体を培養する。それぞれの菌体は４０時間後に３０
〜３５９／ｌの濃度に培養され通常の超高速遠心分離機
により含水率７５〜８５％の泥塊として得る。

次にＤＬ−セリン７７．３９、硫安１０．５り、水４８
６りをフラスコに入れ２９％アンモニア水でｐＨ８，５
に調整する。さらに前述のエシエリヒヤコリ菌体枦塊５
１．２ｇ、シュードモナス・プチーダ菌体鎮魂２３６２
りな加えよくかきまぜる。さらにインド−ルアＬ４９を
溶解したトルエン溶液３９２ｇを加え３５℃で４０時間
反応させる。反応マス中のＬ−トリプトファンは液体ク
ロマトグラフィーを分析したら、１２９．８９生成して
いた。収率９５．０％対インドール。次に蒸留によりト
ルエンを留去後反応液を水で希釈し、Ｌ　−）　’Ｊブ
トファンの濃度を４．２Ｗ　ｔ％に調整する。９８％硫
酸でｐＨ４，０に調整したのち、活性炭を２７９加え、
９５℃に昇温する。９５〜９８℃で１時間保温した後同
温度で熱濾過し菌体を活性体と共に除去する。この熱濾
過液中に８０°Ｃで先に回収したトルエンを添加し、よ
くかきまぜる。攪拌を止め静置すると、上相にトルエン
相、下相に水相が分液される。このトルエン相を分液し
、得られた水相に再び前回と同量のトルエンを加え抽出
を繰返した。

抽出した水相中のインドール濃度を分析すると１回目の
抽出で５５ｐｐｍ、２回目の抽出で４１）Ｉ）ｍに低下
していた。

この水相ｋＬ−トリプトファン濃度がｌＱｗｔ％になる
迄濃縮したのち２０℃まで冷却した。析出したＬ−）リ
プトファンの結晶なｐ過、水洗後、乾燥し７た。Ｌ−）
リプトファンの単離収量１００９純度９９．５％；イン
ドール含有量ｏ　ｐｐｍであった。

なお、トルエンで抽出回収されたインドールは不足分を
補充したのち、次の反応に用いたがＬ−トリプトファン
の収率には影響はなく反応は順調に進行した。すなわち
、 リサイクル回数　　　　　　（ｍ６１％／インドール）
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５．０１
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９８．３２９
８．６ ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９７．０４
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５．４５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　９８．７また、反
応混合物中に未反応インドールを５００ｐｐｍ　　、’
　２０００　ｐｐｍ含有する反応液をそれぞれ３１６ｇ
用い、トルエン２７．６７で８０℃の条件下抽出回数と
水相に残存したインドール濃度の関係を調べ抽出効果を
調べた。結果を以下に示す。

インドール濃度　　　　　　　　　　インドール濃度（
ｐｐｍ）　　　　　　（回）　　　　　　（ｐｐｍ）２
０００　　　　　　１　　　　　　　２９９２９９　　
　　　２　　　　　　　５４５４　　　　　　３　　　
　　　　　　９．８５００　　　　　　１　　　　　　
　　４５４５　　　　　　２　　　　　　　　１８１８
　　　　　３　　　　　　　　３ 実施例２ 実施例１と同様な操作で培養したエシエリヒヤ・コリ菌
体の存在下水およびジイソブチルケトン溶媒中Ｌ−セリ
ンとインドールをｐＨ８，５、３５℃４０時間反応させ
、Ｌ−）リプトファンを製造した。Ｌ−トリプトファン
反応収率９８．３％インドール。

次にこの反応混合物を蒸留によりジインブチルケトンを
留去し、その反応液を遠心分離機によりＬ−）リブトフ
ァンおよび菌体その他？含有した湿潤ｐ塊を得る。

この反応ｐ塊を水に排出しＬ−）リプトファン濃度Ｑ、
８ｗｔ％　になるように水で希釈する。Ｌ　−トリプト
ファン結晶を水に溶解して、室温で限外ｐ過膜を通し、
菌体を除去する。この時の水相中のインドール濃度は９
０　ｐ　ｐｍであった。水相の１１５のジイソブチルケ
トンを加え攪拌する。静置したのち、２相に分液したジ
イソブチルケトン相を分液した。次に前回と同量のジイ
ソブチルケトンで同様の操作で抽出を繰返した。

抽出した水相中のインドール濃度を分析したところ１回
目の抽出で３２ｐｐｍ、２回目の抽出で２ｐｐｍ　　に
低下した。

このインドールを含んだジイソブチルケトン相は新たに
必要量のインドールを補充したのち次の反応に用いても
何ら問題はなかった。

実施例３ 実施例１と同様の操作で培養集菌したエシェリヒャ・コ
リ、およびシュードモナス・プンクタータの存在下、水
およびベンゼンの溶媒中ＤＬ−セリンとインドールをｐ
＋−（８，５，３５℃、４８時間反応させＬ−）ＩＪブ
トファンを製造した。Ｌ−）リプトファンの反応収率９
３．７％対インドール。

次にこの反応混合物よりベンゼンを蒸留により留去後Ｌ
−トＩＪブトファン濃度が４．２ｗｔ％になるように水
で希釈した。塩酸でｐＨ３゜５に調整し、活性炭を１５
ｗｔ％対生成トリプトファンを加え９５〜９８℃で１時
間加熱した。同温度で１時間加圧濾過後、ｐ液を８０℃
でベンゼンを加え良くかきまぜた後静置分液する。抽出
に用いたベンゼンは前述の蒸留回収したものを用いた。

次に同量の新たなベンゼンで抽出操作を３回繰返した。

水相中のインドール濃度は抽出前で１８５０ｐｐｍであ
ったが、１回の抽出で２６５ｐｐｍ　、　　２回の抽出
４３ｐｐｍ、　３回の抽出で４．６ｐｐｍとなった。こ
の反応混合物を濃縮・晶析したところ、純度９９．７％
のＬ−１Ｊブトフアンが収率６９．８％対インドール得
られた。インドール含有量２．ｌｐｐｍ。

また、回収されたインドールは必要量のインドールを新
たに加え、ベンゼン溶液として次の反応に使用したが何
ら問題なかった。

特許出願人 三井東圧化学株式会社 ４６５

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）インドールを基質の１つとして酵素反応により１、
   −）リプトファンを製造するに際し、インドールと混和
   するが水と混和しない有機溶媒の存在下にＬ−）リプト
   ファンを生成させて得られた反応液から、有機溶媒の回
   収および酵素の除去を行ない、ついで、前記有機溶媒を
   用いて未反応インドールを抽出分離し、該抽出液な反応
   に再使用することな特徴とするＬ−）リプトファンの製
   造方法。