JP4730913B2 - 光学活性ｔｅｒｔ−ロイシン及び光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシン及び光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造方法に関する。光学活性ｔｅｒｔ−ロイシン及び光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドは、医農薬等の出発原料として利用される。

光学活性α−アミノ酸の製造に関する報告は化学的合成法、生物学的合成法ともに数多く見られる。例えば、生物学的合成法として、α−アミノ酸アミド不斉加水分解能を有する微生物等を用いたラセミ体α−アミノ酸アミドの光学分割法が知られている。この方法は、立体選択性の高い微生物の取得により光学純度の高いα−アミノ酸が容易に製造可能であること、原料となるラセミ体α−アミノ酸アミドの製造が容易であること、天然型及び非天然型のいずれの光学活性α−アミノ酸製造にも応用が可能であること等の理由により、光学活性α−アミノ酸の汎用的な製造法として有用である。

しかし、上記、α−アミノ酸アミド不斉加水分解能を有する微生物等を用いたラセミ体又は光学的に純粋でないα−アミノ酸アミドの光学分割法においては、反応終了後、液中に目的とする光学活性α−アミノ酸と光学活性α−アミノ酸アミドが混在するため、光学活性α−アミノ酸と光学活性α−アミノ酸アミドを分離する必要がある。

α−アミノ酸とα−アミノ酸アミドを分離する方法としては、α−アミノ酸アミドを溶媒抽出により除去した後、α−アミノ酸を等電点にて回収する方法（特許文献１、特許文献２）、エタノールを加えアミノ酸を優先的に晶析させる方法（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６参照）、イオン交換樹脂を用いて吸着分離を行う方法（特許文献７）、又はα−アミノ酸アミドを陽イオン交換樹脂に吸着させた後、該イオン交換樹脂に酵素を接触させて立体特異的に加水分解反応を行い、反応と分離を同時に行う光学活性アミノ酸の製造方法（特許文献８）が報告されている。

また、光学分割反応後、得られた光学活性α−アミノ酸水溶液に含まれる水を減圧下除去し、熱有機溶媒にて残渣を洗浄してα−アミノ酸アミドを選択的に除去した後、残った光学活性α−アミノ酸を回収する方法も報告されている（特許文献９）。

この報告には、洗浄・回収した光学活性α−アミノ酸アミドの有機溶媒溶液に強塩基性化合物を加え、加熱してα−アミノ酸アミドのラセミ化反応を行ない、得られたＤ−体及びＬ−体混合物のα−アミノ酸アミドを不斉加水分解反応に再利用する旨も記載されている。

また、ラセミ化に関しては、有機溶媒中、アルカリ存在下加熱してα−アミノ酸アミドをラセミ化する方法が、特許文献１０に記載されている。

いずれの報告でも、ラセミ化反応中に副反応として起こるα−アミノ酸アミドの加水分解反応を抑制するため、光学活性α−アミノ酸アミド溶液中の水分含量を低く抑えることが必須とされており、例えば特許文献１０では有機溶媒中の水分含量を１０％以下と規定している。

しかしながら、上記の光学活性α−アミノ酸の製造方法は各々欠点を有し工業的に効率の良い製造方法ではない。

α−アミノ酸アミドを溶媒抽出により除去した後、α−アミノ酸を等電点にて回収する方法においては、抽出に多量の溶媒を必要とする。よって、装置、コスト面で不利となる。また、イオン交換樹脂を用いて吸着分離を行う方法では、吸着・脱離、回収と多くの行程が必要とし、設備投資の増加、回収効率の低下又は不純物混入機会の、増加の可能性等の問題があり工業的に好ましくない。

一方、反応濃縮液にエタノールを加えα−アミノ酸を優先的に晶析させる方法は、他の方法に比べ、濃縮−晶析を同一槽内で行える等から、操作が簡便であり、装置上の設備投資も少ないという特徴がある。しかし、該方法では濃縮溶液の容積に対し数倍以上の量のエタノールを添加する必要あり、コスト増加の一因となる。また、この技術の報告例は、限られた天然アミノ酸しかなく、かつ取得したアミノ酸の純度について記載されているのもバリンのみであり、他のアミノ酸について高い純度のアミノ酸が収率良く得られるかどうかは全く不明である。従ってこの方法は汎用性ある技術とは言い難い。

また、該方法で、分離した光学活性α−アミノ酸アミドをラセミ化して光学分割反応に再利用することを想定した場合、エタノールは沸点が低く、ラセミ化反応に適当な溶媒ではないことは明白である。例えば、特許文献１０では、エタノール溶液を用いたラセミ化反応の例が記載されているが、反応温度を上昇させるため、反応容器を封管した後、１１０〜１２０℃に容器を加熱して反応を行っている。該方法は、工業スケールにおいては、特殊な装置を必要とする。 従って、エタノールを用いた場合、装置上の設備投資なく常圧下で反応を行うのは困難である。

さらには、分離・回収した光学活性α−アミノ酸アミド含有エタノール溶液は水分含有率が高いこと等を考慮すると、光学活性α−アミノ酸アミドのラセミ化反応を行うためには、さらなる溶液の脱水、溶媒置換等の操作、又は光学活性α−アミノ酸アミド結晶の単離・乾燥操作が必要であり、操作工程が煩雑となる。

水を除去した後、熱有機溶媒にて残渣を洗浄し、α−アミノ酸アミドを選択的に洗浄除去する方法は、光学活性α−アミノ酸アミドを溶液から単離することなく、ラセミ化反応を行なえるという特徴があるが、工業的規模の製造において溶液から水分を完全に除去し濃縮乾固することは技術的に困難であり、操作性、装置上の設備投資等も考えると、この方法は実用的な製造方法ではない。

以上の理由から、公知の手法による光学活性α−アミノ酸の製造方法は、反応後の光学活性α−アミノ酸の回収方法に効率等の面で問題があり、工業的に優位な方法となり得えなかった。
特開昭５８−２０９９８９号 特開昭５７−１３０００号 特開昭６３−８７９９８号 特開昭６１−２７４６９０号 特開昭６０−１８４３９２号 特開昭５９−１５９７８９号 特開平１−２２６４８２号 特開平８−２３９９６号 特開昭６１−２９３３９４号 特開昭６２−２５２７５１号

本発明は、上記問題点を解決した効率の良い光学活性α−アミノ酸及び光学活性α−アミノ酸アミドの製造方法を提供する。

本発明者らは、上記課題の解決のために、鋭意検討を重ねた結果、光学活性α−アミノ酸及び光学活性α−アミノ酸アミド含有水溶液の溶媒を水から炭素数３以上のアルコール溶媒へと置換し、光学活性α−アミノ酸をアルコール溶液から優先的に取得することで、非常に高い収率で光学活性α−アミノ酸を製造し得ることを見いだした。

さらには、より効率良く光学活性α−アミノ酸を製造するため、不斉加水分解反応、光学活性α−アミノ酸の晶析・分離操作の後、分離母液として得られる光学活性α−アミノ酸アミド含有アルコール溶液中から光学活性α−アミノ酸アミドを単離する工程を経ることことなく、光学活性α−アミノ酸アミドのラセミ化反応を実施することができる。また、塩基性化合物添加後、共沸脱水等の水分除去操作を行うことで、塩基性化合物との反応で生じた水分を除去できるため、さらに効率良く光学活性α−アミノ酸アミドのラセミ化反応を行うことが可能であり、かつラセミ化反応後、回収されたＤ−体及びＬ−体α−アミノ酸アミド混合物がα−アミノ酸アミドの不斉加水分解反応の原料として循環利用できることを見いだした。

すなわち、本発明は、Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体又は該処理物を作用させて、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンおよびＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを得、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを採取し、次いで該Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに強塩基性物質加え、加熱することによりラセミ化してＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを生成させ、不斉加水分解反応の原料として循環利用することことを特徴とするＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造法、である。

水性媒体中、ラセミ体α−アミノ酸アミドと立体特異的なα−アミノ酸アミド加水分解能を有する菌体もしくは酵素を接触させた後、溶媒である水を炭素数３以上の直鎖、分岐又は環状アルコールからなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒に置換し、さらに得られたアルコール溶液から光学活性α−アミノ酸を優先的に析出させることで、非常に高い収率で光学活性α−アミノ酸を製造することができる。

また、光学活性α−アミノ酸を分離した後に得られる光学活性α−アミノ酸アミド含有アルコール溶液は、容易に、ラセミ化反応工程へと供することができるので、光学活性α−アミノ酸の製造効率を向上させることができる。

以下に本発明の一般的実施態様について説明する。

本発明において、α−アミノ酸の種類に制限はないが、次の一般式（I）で示されるものが好ましい。

（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっており、水素原子、低級アルキル基、置換低級アルキル基、低級アルケニル基、置換低級アルケニル基、シクロアルキル基、フェニル基、置換フェニル基、複素環基及び置換複素環基を示す一般式（Ｉ）で示されるものとして、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、システイン、チロシン、リジン、ヒスチジン、２−アミノ酪酸、シクロヘキシルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、６−ヒドロキシノルロイシン、ネオペンチルグリシン、ペニシラミン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルグリシン、２−クロロフェニルグリシン、３−クロロフェニルグリシン、４−クロロフェニルグリシン等を挙げることができる。

本発明において、α−アミノ酸アミドの種類に制限はないが、次の一般式（II）で示されるものが好ましい。

（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なっており、水素原子、低級アルキル基、置換低級アルキル基、低級アルケニル基、置換低級アルケニル基、シクロアルキル基、フェニル基、置換フェニル基、複素環基及び置換複素環基を示す。） 一般式（ＩＩ）で示されるものとして、例えば、アラニンアミド、バリンアミド、ロイシンアミド、イソロイシンアミド、メチオニンアミド、トリプトファンアミド、フェニルアラニンアミド、セリンアミド、システインアミド、チロシンアミド、リジンアミド、ヒスチジンアミド、２−アミノ酪酸アミド、シクロヘキシルアラニンアミド、ノルバリンアミド、ノルロイシンアミド、６−ヒドロキシノルロイシンアミド、ネオペンチルグリシンアミド、ペニシラミンアミド、ｔｅｒｔ−ロイシンアミド、フェニルグリシンアミド、２−クロロフェニルグリシンアミド、３−クロロフェニルグリシンアミド、４−クロロフェニルグリシンアミド等を挙げることができる。

α−アミノ酸アミドの光学分割反応は、水性媒体中でラセミ体あるいは光学的に純粋でないα−アミノ酸アミドに立体特異的に作用し、光学活性α−アミノ酸と対応する光学特性を有するα−アミノ酸アミドを与える微生物の作用により行うことができる。該微生物としては、上記反応を触媒するものであれば、特に制限はなく、例えば、エンテロバクタ−・クロアッセイ Ｎ−７９０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８７３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５（ ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３２）等を挙げることができる。これら微生物は菌体をそのまま又は菌体処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、粗又は精製酵素、及びこれらの固定化物）として使用される。

該光学分割反応は、水性媒体中においてα−アミノ酸アミドを上記菌体又は菌体処理物と接触させることによって行われる。通常、α−アミノ酸アミド濃度は０．１〜６０質量％、好ましくは１〜４０質量％、菌体又は菌体処理物の濃度は、その活性量により異なるがアミノ酸アミド質量に対し１／１００００〜１質量、好ましくは１／１０００〜１／１０質量、反応液のｐＨは４〜１１、好ましくは６〜１０、及び反応温度は１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃である。

反応終了後、反応液からの菌体又は菌体処理物の除去方法は特に限定しないが例えば、遠心分離、ろ過等の方法を用いて行うことができる。菌体又は該処理物を除去した反応液は必要に応じて減圧濃縮操作を行ってもよい。

得られた反応液又は濃縮液中の水は、炭素数３以上、好ましくは３〜６、さらに好ましくは４〜６の直鎖、分岐、あるいは環状アルコールの中から選ばれた少なくとも１種類の溶媒に置換される。

溶媒の置換は共沸等の操作によって行なわれ、α−アミノ酸アミドの不斉加水分解反応後得られる光学活性α−アミノ酸及び光学活性α−アミノ酸アミド含有水溶液に含まれる水が、好ましくは９０質量％以上までアルコール溶媒へと置換されるまで操作を行なう。

アルコール溶媒へ置換した後、光学活性α−アミノ酸を取得する方法は、特に限定されないが、例えば、析出による取得法が挙げられる。

光学活性α−アミノ酸を析出させる際の光学活性α−アミノ酸の濃度、温度については高い収率で光学活性α−アミノ酸が回収できるのであれば特に限定はしないが、操作効率等を考慮して濃度は１〜５０質量％、好ましくは５〜３０質量％で、温度は−２０〜６０℃、好ましくは０〜４０℃で行なわれる。また、析出操作時より高い温度にて溶液を加温、撹拌した後、前述した温度にて光学活性α−アミノ酸を析出させることで、純度の高い光学活性α−アミノ酸を得ることができる。さらに析出した光学活性α−アミノ酸の回収操作は連続及び回分のいずれの方法によっても行うことができる。

上記操作により、結晶として析出した光学活性α−アミノ酸は、遠心分離又はろ過等の方法により回収され、その結果、光学活性α−アミノ酸は溶液中に溶解している光学活性α−アミノ酸アミドと分離することができる。

分離母液中の光学活性α−アミノ酸アミドは、必要により、光学活性α−アミノ酸アミドに対して溶解度の低い溶媒への置換、あるいは溶媒を除去して固体状で回収することができる。

光学活性α−アミノ酸アミドのラセミ化反応は、塩基性化合物を分離母液として得られる光学活性α−アミノ酸アミド含有アルコール溶液に加えて行う。

塩基性化合物としては、アルカリ金属水酸化物、又はアルカリ金属のアルコラートのうち、少なくとも１種類が選ばれる。アルカリ金属水酸化物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが、アルカリ金属のアルコラートとしてはナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、カリウムメチラート、カリウム−ｔｅｒｔ−ブチラート等が挙げられる。

加えられるべき塩基化合物の量はアミノ酸アミドに対して０．０１〜１．０モル当量、好ましくは０．０５〜０．５モル当量である。α−アミノ酸アミド含有アルコール溶液中にα−アミノ酸が混在する場合は、α−アミノ酸の１．０モル当量以上の塩基性化合物を前述した量に加算して加えることができる。また、塩基性化合物添加後、共沸脱水等の水分除去操作を行うことで、塩基性化合物との反応で生じた水分を除去できるため、さらに効率良く光学活性α−アミノ酸アミドのラセミ化反応を行うことが可能である。かくしてアルコール溶液として回収された光学活性α−アミノ酸アミドは、アルコール溶媒中に溶解したまま複雑な工程を経ることなく、単純な操作のみでラセミ化反応を実施することができる。

光学活性α−アミノ酸アミドのラセミ化反応の条件は、α−アミノ酸アミド、塩基化合物の種類、濃度等の諸要因により異なり特に限定されるものではないが、一般には反応温度８０〜２００℃、好ましくは１００〜１５０℃で１０分〜２４時間行う。

反応後、 Ｄ−体及びＬ−体α−アミノ酸アミド混合物は、公知の方法により回収され、不斉アミノ酸アミド加水分解反応に循環利用することができる

次に、本発明を実施例により具体的に説明する。

〔参考例１〕
光学活性α−アミノ酸と光学活性α−アミノ酸アミドを含む水溶液の調製
特開昭６２−５５０９７号公報記載の方法に従い、エンテロバクター クロアッセイ Ｎ−７９０１（ＦＥＲＭ Ｐ−８７３）の培養を行った。培養液１Ｌを遠心分離し、次いで湿潤菌体を蒸留水に懸濁して菌体懸濁溶液８００ｇを調製した。この懸濁液にＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド２００ｇを溶解させた後、４０℃にて５２時間反応させた。反応後、遠心分離により菌体を除去し、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン及びＤ−ｔｅｒｔ−ロイシノアミドを各々１０質量％含む水溶液９７０ｇを得た。

ｔｅｒｔ−ロイシン及びｔｅｒｔ−ロイシンアミドの濃度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件１で、各々の光学純度は、ＨＰＬＣ分析条件２で分析を行った。また、溶液の水分量はカールフィッシャー水分測定器（三菱モイスチャーメーターＣＡ−６０：三菱化成社製）を用いて測定した。

〔ＨＰＬＣ分析条件１〕
カラム：イナートシル ＯＤＳ−３Ｖ（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層：０．１％ リン酸水溶液
流速： １ｍＬ／ｍｉｎ
検出： ＲＩ
〔ＨＰＬＣ分析条件２〕
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（４．６φ×２５０ｍｍ）
移動層：水−メタノール（８５：１５）
流速： １ｍＬ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ ２５４ｎｍ
〔実施例１〕
参考例１で得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンとＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む水溶液５００ｇを２５０ｇまで減圧濃縮した後、溶液に１−ブタノール２５０ｇを加えた。さらに溶液を減圧濃縮し、溜出液が２４０ｇとなった時点で再度溶液に１−ブタノールを２５０ｇ加えた。添加後、再び減圧濃縮を行ない、最終的に濃縮液３５０ｇを得た。この時の濃縮液の水分濃度は０．６質量％であった。この濃縮液を６０℃にて２時間撹拌した後、溶液を冷却し、２０℃にてさらに２時間撹拌した。析出した結晶を遠心ろ過により回収し、乾燥質量４８．９ｇのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを得た（収率９８％）。この時、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン結晶中に含まれるＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの量は０．０１質量％未満であった。

回収した分離母液２９５ｇ中にはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド４９．０ｇが含まれていた。

〔実施例２〕
実施例１で得られたＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの１−ブタノール溶液（分離母液）２９５ｇに水酸化カリウム３．０ｇを加えた後、この溶液を２０６ｇまで減圧濃縮した。濃縮液の水分濃度は０．０６質量％であった。濃縮液を６時間加熱還流した後、反応液を８１ｇまで減圧濃縮し、さらに濃縮液にｎ−ヘプタン１００ｇを加えて５℃にて３時間攪拌した。析出した結晶を吸引ろ過にて回収し、乾燥質量４０．２ｇのＤ−体及びＬ−体の混合物のｔｅｒｔ−ロイシンアミドを得た（分離母液からの収率８２％）。このときのｔｅｒｔ−ロイシンアミド結晶のＤ−体：Ｌ−体の存在比率は５０．０：５０．０であった。

Claims (2)

1. Ｄ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体又は該処理物を作用させて、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンおよびＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを得、水分含量が１０質量％以下になるまで共沸により溶媒を１−ブタノールに置換してＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを採取し、次いで該Ｄ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに強塩基性物質加え、加熱することによりラセミ化してＤ，Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを生成させ、不斉加水分解反応の原料として循環利用することことを特徴とするＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造法。
2. 強塩基性物質が水酸化カリウム、カリウムメチラート及びカリウム−ｔｅｒｔ−ブチラートから選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の方法。