CN112391424A - 一种l-天冬氨酸的清洁提取工艺 - Google Patents

一种l-天冬氨酸的清洁提取工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及氨基酸生产技术领域，特别公开了一种L‑天冬氨酸的清洁提取工艺。该L‑天冬氨酸的清洁提取工艺，以产天冬氨酸酶的大肠杆菌培养液和含富马酸的底物溶液为原料，经加氨转化为L‑天冬氨酸，得到转化液，其特征在于：所述转化液经活性炭脱色后，采用富马酸调pH方法结晶提取L‑天冬氨酸；母液回收，补加富马酸，再次配置成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，加热后采用硫酸调pH至L‑天冬氨酸等电点的方法结晶沉淀L‑天冬氨酸。本发明结晶质量好、产品收率高、清洁环保，不仅减少了硫酸用量、铵盐的生成量及废水的排放量，而且解决了单独利用富马酸提取L‑天冬氨酸提取率低的问题。

Description

一种L-天冬氨酸的清洁提取工艺
技术领域
本发明涉及氨基酸生产技术领域，特别涉及一种L-天冬氨酸的清洁提取工艺。
背景技术
L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）是一种重要的酸性氨基酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。在食品工业方面，L-天冬氨酸是多种食品的营养增补剂，还用于合成甜味剂阿斯巴甜；在医药方面，其可用作肝功能促进剂、氨解毒剂和疲劳恢复剂等，且还是合成L-丙氨酸的主要原料和多种医药中间体；在化工方面，其可用于合成高分子材料聚天冬氨酸。
目前，L-天冬氨酸的生产主要利用L-天冬氨酸酶催化富马酸与氨发生加成反应得到，该工艺主要采用游离细胞法，具有酶活力高、工艺简洁、设备投资少等优势。在该工艺中，L-天冬氨酸的提取是用硫酸将pH 8.5左右的酶转化液调至其等电点2.8，结晶沉淀后，再经过滤、干燥得到成品。据统计，每生产1t的L-天冬氨酸，需要消耗0.7t的浓硫酸、产生6-7m3的酸性废水，废水中还含有500kg左右的硫酸铵。工业上对酸性废水一般采用中和、生化处理后排放，也有企业采用单效蒸发浓缩法回收废水中高浓度硫酸铵，流程长、蒸汽能耗高、收率低，一定程度上降低了企业的经济效益。另有报道将富马酸加入到酶转化液中提取L-天冬氨酸，此方法得到的晶体纯度高，但提取率比较低。因此，通过研究L-天冬氨酸的提取条件，得到了一种L-天冬氨酸清洁提取工艺。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种结晶质量好、产品收率高、清洁环保的L-天冬氨酸的清洁提取工艺。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种L-天冬氨酸的清洁提取工艺，以产天冬氨酸酶的大肠杆菌培养液和含富马酸的底物溶液为原料，经加氨转化为L-天冬氨酸，得到转化液，其特征在于：所述转化液经活性炭脱色后，采用富马酸调pH方法结晶提取L-天冬氨酸，抽滤、干燥得L-天冬氨酸晶体；母液回收，补加富马酸，将母液再次配置成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，加热至80-95℃，采用硫酸调pH至L-天冬氨酸等电点的方法结晶沉淀L-天冬氨酸；最后，采用三效蒸发工艺对副产物进行回收，结晶、干燥得到硫酸铵晶体。
本发明以富马酸和硫酸调pH的方法提取L-天冬氨酸，降低了废水排放，减轻了对环境的污染，提高了产品结晶质量和产品收率，提取率达75%以上，纯度达90%以上，透光率达98%以上，比旋光度[α]20D介于+24.5º至+25.5º之间；此外，通过三效蒸发结晶工艺回收废水中的硫酸铵，综合考虑了资源的最大化利用，节能减排效果明显，回收率达96%以上，水分含量小于1%，吨产品蒸汽消耗量为2.5t/t以下。
上述清洁提取工艺，具体包括如下步骤：
（1）将活化的大肠杆菌菌体接入摇瓶中培养，得到一级种子液；将一级种子液转接到发酵培养基中培养，得到二级培养液；
（2）二级培养液与底物溶液混合摇匀，进行转化反应，得到转化液；
（3）将转化液升温后加入活性炭脱色，再经过滤收集滤液；
（4）将滤液升温后加入富马酸迅速搅拌溶解，保温状态下继续缓慢搅拌，大量L-天冬氨酸晶体析出，然后缓慢冷却继续搅拌，沉淀，过滤，干燥，得到L-天冬氨酸晶体；
（5）将过滤后母液回收，补加富马酸，再次配制成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，加热至80-95℃，搅拌滴加入硫酸，直到溶液pH至2.8停止，冷却至室温，过滤取结晶，干燥得L-天冬氨酸晶体；
（6）利用三效顺流强制循环加热泵蒸发工艺处理过滤后溶液，经结晶、干燥得到硫酸铵。
优选的，步骤（1）中，取一环活化后斜面菌体接入摇瓶（500mL摇瓶装液量50mL）中，200rpm、35-37℃下培养8h，得到一级种子液；将一级种子液按体积比1%的接种量转接到发酵培养基中，200rpm下培养10h，得到二级培养液。
优选的，步骤（1）中，斜面培养基的组分为：玉米浆干粉3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2；发酵培养基组分为：富马酸10g/L，玉米浆干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨7g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 6.0。
优选的，步骤（2）中，二级培养液与底物溶液按体积比1：7混合摇匀，于45℃下进行转化反应，待底物溶液中的富马酸质量浓度降到0.2%以下，结束反应；其中，底物溶液组分为：富马酸200g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 9.0。
优选的，步骤（3）中，将转化液升温至50-70℃，加入质量分数为0.1-0.3%的活性炭脱色1-2h；再经过滤收集的滤液，其透光率达95%以上。
优选的，步骤（4）中，将滤液升温至70-90℃，加入富马酸迅速搅拌溶解后，开始有L-天冬氨酸晶体析出，保温状态下继续缓慢搅拌30min，大量L-天冬氨酸晶体析出，然后缓慢冷却至25-50℃，在该温度下继续搅拌30min，完成L-天冬氨酸晶体的沉淀，过滤，干燥2-3h，得到L-天冬氨酸晶体，提取率达65%以上。
优选的，步骤（4）中的母液仍含有大量的天冬氨酸未结晶析出，故将母液回收，补加富马酸，将其在此配成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次；
步骤（5）中，第六次的转化液脱色后，加热至90℃，搅拌条件下，以10-30mL/h的滴加速度加入硫酸，直到溶液pH至2.8停止，冷却至室温5-25min，过滤取结晶，干燥2-3h，即得L-天冬氨酸晶体；提取率达75%以上，纯度达90%以上。
L-天冬氨酸产品分析：透光率达98%以上，比旋光度[α]20D介于+24.5º至+25.5º之间。
上述透光率测定：分光光度法，纯水作参比，c=8g/mL，10mm光程，波长640nm。
上述富马酸含量测定：紫外可见分光光度法，于240nm处测定其吸光度。
上述L-天冬氨酸提取率（%）=晶体干质量/（底物溶液中富马酸物质的质量×天冬氨酸相对分子质量×转化率）×100%。
上述L-天冬氨酸纯度测定：U3000高效液相色谱仪，SinoChrom ODS-BP C18 5μmΦ4.6mm×250mm分析柱；流动相：0.03mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲液（pH2.5）；检测波长：210nm；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。
上述旋光度测定：JASCO P-1020旋光仪，c=0.08g/mL，6mol/L HCl。
优选的，步骤（6）中，过滤后溶液进入一效蒸发器加热室蒸发浓度，温度为109℃，压力为20KPa（表压）；一效蒸发器加热室热源采用1.0MPa饱和蒸汽加热，产生的二次蒸汽经间接冷凝器冷凝，冷凝水用于原料的二级预热，不凝气直接排放到外界；
经一效蒸发器分离室汽液分离，液相在压力差作用下进入二效蒸发器加热室，汽相作为二效蒸发器加热室热源，温度为93℃，压力为40KPa（真空度）；二效蒸发器加热室的冷凝水通过管道进入三效蒸发器加热室，随三效加热室的冷凝水一起进入冷凝水管，由冷凝水泵排出；
经二效蒸发器分离室汽液分离，液相在压力差作用下进入三效蒸发器加热室继续蒸发浓缩，汽相作为三效蒸发器加热室热源，温度为66.5℃，压力为80KPa（真空度）；继续浓缩至固含量达到25%后出料。
所述三效蒸发器内的浓缩溶液经出料泵送入旋流器增浓，增浓厚的45%固含量的硫酸铵溶液进入稠厚器结晶，结晶温度为50-70℃，压力为常压，结晶完成后固含量达50%，经离心机甩干后进入母液池，由液下泵返回到三效蒸发继续蒸发；
当系统内油含量较高时，关闭旋流器直接返回三效分离室的阀门，开启旋流器后的分层器阀门，硫酸铵溶液进入分层器，油组分在其上部经压力平衡管被取出，分离后的溶液返回三效分离室；
获得的硫酸铵晶体进入盘式干燥器，通过蒸汽间接加热，干燥温度为65-78℃，得到硫酸铵产品，水分从干燥器顶部通过风机抽出，经水洗塔水洗尾气排入大气。
硫酸铵产品回收率达96%以上，水分含量小于1%，吨产品蒸汽消耗量为2.5t/t以下。
本发明结晶质量好、产品收率高、清洁环保，不仅减少了硫酸用量、铵盐的生成量及废水的排放量，而且解决了单独利用富马酸提取L-天冬氨酸提取率低的问题，同时实现了副产物（硫酸铵）的资源化，具有显著的经济效益和环保效益，产品符合USP质量标准，值得推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，以便于对本发明的理解，但并不是对本发明的限制。
实施例1：一种L-天冬氨酸的清洁提取工艺
（1）转化培养液的制备
取一环活化后斜面菌体接入500mL（装液量50mL）摇瓶中，200rpm，35-37℃，培养8h，得到一级培养液；将一级种子液按1%（v/v）接种量转接到发酵培养基中，200rpm，培养10h，得到二级培养液。其中，斜面培养基组分为：玉米浆干粉3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2；发酵培养基组分为：富马酸10g/L，玉米浆干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨7g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 6.0。
（2）酶法转化反应
大肠杆菌培养液与底物溶液按体积比1:7混合摇匀，于45℃进行转化反应，待底物溶液中的富马酸质量浓度降到0.2%以下，结束反应。其中，底物溶液组分为：富马酸200g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 9.0。
（3）脱色过滤
将步骤（2）获得的转化液升温至55℃，加入质量分数为0.15%活性炭脱色1-2h，再经过滤收集滤液，透光率达到99.6%。
（4）富马酸结晶
将滤液升温至80℃，富马酸加入量为底物溶液中初始富马酸量的0.65倍，迅速搅拌溶解后，开始有L-天冬氨酸晶体析出，在该温度下继续缓慢搅拌30min，大量L-天冬氨酸晶体析出，然后缓慢冷却至40℃，在该温度下继续搅拌30min，完成L-天冬氨酸晶体的沉淀，过滤，干燥2-3h，得到L-天冬氨酸晶体，提取率达到65.6%，纯度达到96.2%。
（5）硫酸结晶
将步骤（4）中的母液回收，补加富马酸，将母液再次配成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，取600mL滤液加热至87℃，在搅拌条件下，以20mL/h的滴加速度加入60mL硫酸，直到溶液pH至2.8停止，冷却至室温14min，滤取结晶，干燥2-3h，即得L-天冬氨酸晶体，提取率达到76.1%，纯度达到93.8%。
本实施方式得到的L-天冬氨酸产品分析：透光率达98%，比旋光度[α]20D为+24.8º。
（6）硫酸酸解副产物回收
步骤（5）中产生的硫酸铵溶液进入一效蒸发器加热室蒸发浓缩，其温度控制在109℃，压力为20Kpa（表压）， 经一效蒸发器分离室汽液分离，液相进入二效蒸发器继续蒸发浓缩；汽相作为二效蒸发器加热室的热源。一效加热室热源采用1.0MPa饱和蒸汽加热，产生的二次蒸汽经间接冷凝器冷凝，冷凝水用于原料的二级预热，不凝气直接排放到外界。
一效浓缩液在压力差作用下进入二效蒸发器加热室继续浓缩，其温度控制在93℃，压力为40Kpa（真空度），经二效分离室进行汽液分离，液相进入三效蒸发器继续蒸发浓缩；汽相作为三效蒸发器加热室热源。二效加热室的冷凝水通过管道进入三效加热室，随三效加热室的冷凝水一起进入冷凝水罐，由冷凝水泵排出。
二效浓缩液在压力差作用下进入三效蒸发器加热室，其温度控制在66.5℃，压力为80Kpa（真空度），继续浓缩到固含量达到25%后，通过出料泵进入旋流器增浓，增浓后的45%固含量的硫酸铵溶液进入稠厚器结晶，结晶温度为60℃，压力为常压，结晶完成后固含量达到50%，经离心机甩干后硫酸铵进入母液池，由液下泵返回到三效蒸发器继续蒸发。
获得的硫酸铵晶体进入盘式干燥器，通过蒸汽间接加热，干燥温度控制在75℃，水分从干燥器顶部通过风机抽出，经水洗塔水洗尾气排入大气。硫酸铵产品回收率达96.5%，水分含量0.5%，吨产品蒸汽消耗量为2.2t/t。
实施例2：一种L-天冬氨酸的清洁提取工艺
（1）转化培养液的制备
取一环活化后斜面菌体接入500mL（装液量50mL）摇瓶中，200rpm，35-37℃，培养8h，得到一级培养液；将一级种子液按1%（v/v）接种量转接到发酵培养基中，200rpm，培养10h，得到二级培养液。其中，斜面培养基组分为：玉米浆干粉3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2；发酵培养基组分为：富马酸10g/L，玉米浆干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨7g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 6.0。
（2）酶法转化反应
大肠杆菌培养液与底物溶液按体积比1:7混合摇匀，于45℃进行转化反应，待底物溶液中的富马酸质量浓度降到0.2%以下，结束反应。其中，底物溶液组分为：富马酸200g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 9.0。
（3）脱色过滤
将步骤（2）获得的转化液升温至50℃，加入质量分数为0.2%活性炭脱色1-2h，再经过滤收集滤液，透光率达到99%。
（4）富马酸结晶
将滤液升温至90℃，富马酸加入量为底物溶液中初始富马酸量的0.65倍，迅速搅拌溶解后，开始有L-天冬氨酸晶体析出，在该温度下继续缓慢搅拌30min，大量L-天冬氨酸晶体析出，然后缓慢冷却至37℃，在该温度下继续搅拌30min，完成L-天冬氨酸晶体的沉淀，过滤，干燥2-3h，得到L-天冬氨酸晶体，提取率达到71.6%，纯度达到99.0%。
（5）硫酸结晶
将步骤（4）中的母液回收，补加富马酸，将母液再次配成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，取600mL滤液加热至91℃，在搅拌条件下，以23mL/h的滴加速度加入60mL硫酸，直到溶液pH至2.8停止，冷却至室温12min，滤取结晶，干燥2-3h，即得L-天冬氨酸晶体，提取率达到78.4%，纯度达到98.2%。
本实施方式得到的L-天冬氨酸产品分析：透光率达98.9%，比旋光度[α]20D为+25.2º。
（6）硫酸酸解副产物回收
步骤（5）中产生的硫酸铵溶液进入一效蒸发器加热室蒸发浓缩，其温度控制在109℃，压力为20Kpa（表压）， 经一效蒸发器分离室汽液分离，液相进入二效蒸发器继续蒸发浓缩；汽相作为二效蒸发器加热室的热源。一效加热室热源采用1.0MPa饱和蒸汽加热，产生的二次蒸汽经间接冷凝器冷凝，冷凝水用于原料的二级预热，不凝气直接排放到外界。
一效浓缩液在压力差作用下进入二效蒸发器加热室继续浓缩，其温度控制在93℃，压力为40Kpa（真空度），经二效分离室进行汽液分离，液相进入三效蒸发器继续蒸发浓缩；汽相作为三效蒸发器加热室热源。二效加热室的冷凝水通过管道进入三效加热室，随三效加热室的冷凝水一起进入冷凝水罐，由冷凝水泵排出。
二效浓缩液在压力差作用下进入三效蒸发器加热室，其温度控制在66.5℃，压力为80Kpa（真空度），继续浓缩到固含量达到25%后，通过出料泵进入旋流器增浓，增浓后的45%固含量的硫酸铵溶液进入稠厚器结晶，结晶温度为55℃，压力为常压，结晶完成后固含量达到50%，经离心机甩干后硫酸铵进入母液池，由液下泵返回到三效蒸发器继续蒸发。
获得的硫酸铵晶体进入盘式干燥器，通过蒸汽间接加热，干燥温度控制在70℃，水分从干燥器顶部通过风机抽出，经水洗塔水洗尾气排入大气。硫酸铵产品回收率达97.2%，水分含量0.4%，吨产品蒸汽消耗量为1.8t/t。
在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构思下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种L-天冬氨酸的清洁提取工艺，以产天冬氨酸酶的大肠杆菌培养液和含富马酸的底物溶液为原料，经加氨转化为L-天冬氨酸，得到转化液，其特征在于：所述转化液经活性炭脱色后，采用富马酸调pH方法结晶提取L-天冬氨酸，抽滤、干燥得L-天冬氨酸晶体；母液回收，补加富马酸，将母液再次配置成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，加热至80-95℃，采用硫酸调pH至L-天冬氨酸等电点的方法结晶沉淀L-天冬氨酸；最后，采用三效蒸发工艺对副产物进行回收，结晶、干燥得到硫酸铵晶体。
2.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征为，具体包括如下步骤：（1）将活化的大肠杆菌菌体接入摇瓶中培养，得到一级种子液；将一级种子液转接到发酵培养基中培养，得到二级培养液；（2）二级培养液与底物溶液混合摇匀，进行转化反应，得到转化液；（3）将转化液升温后加入活性炭脱色，再经过滤收集滤液；（4）将滤液升温后加入富马酸迅速搅拌溶解，保温状态下继续缓慢搅拌，大量L-天冬氨酸晶体析出，然后缓慢冷却继续搅拌，沉淀，过滤，干燥，得到L-天冬氨酸晶体；（5）将过滤后母液回收，补加富马酸，再次配置成底物溶液，进行第二次的酶反应，如此反复循环5次，第六次的转化液脱色后，加热至80-95℃，搅拌滴加入硫酸，直到溶液pH至2.8停止，冷却至室温，过滤取结晶，干燥得L-天冬氨酸晶体；（6）利用三效顺流强制循环加热泵蒸发工艺处理过滤后溶液，经结晶、干燥得到硫酸铵。
3.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（1）中，取一环活化后斜面菌体接入摇瓶中，200rpm、35-37℃下培养8h，得到一级种子液；将一级种子液按体积比1%的接种量转接到发酵培养基中，200rpm下培养10h，得到二级培养液。
4.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（1）中，斜面培养基的组分为：玉米浆干粉3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2；发酵培养基组分为：富马酸10g/L，玉米浆干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨7g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH 6.0。
5.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（2）中，二级培养液与底物溶液按体积比1：7混合摇匀，于45℃下进行转化反应，待底物溶液中的富马酸质量浓度降到0.2%以下，结束反应；其中，底物溶液组分为：富马酸200g/L，硫酸镁0.2g/L，pH9.0。
6.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（3）中，将转化液升温至50-70℃，加入质量分数为0.1-0.3%的活性炭脱色1-2h。
7.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（4）中，将滤液升温至70-90℃，加入富马酸迅速搅拌溶解后，开始有L-天冬氨酸晶体析出，保温状态下继续缓慢搅拌30min，大量L-天冬氨酸晶体析出，然后缓慢冷却至25-50℃，在该温度下继续搅拌30min，完成L-天冬氨酸晶体的沉淀，过滤，干燥2-3h，得到L-天冬氨酸晶体。
8.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（5）中，第六次的转化液脱色后，加热至90℃，搅拌条件下，以10-30mL/h的滴加速度加入硫酸，直到溶液pH至2.8停止，冷却至室温5-25min，过滤取结晶，干燥2-3h，即得L-天冬氨酸晶体。
9.根据权利要求2所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：步骤（6）中，过滤后溶液进入一效蒸发器加热室蒸发浓度，温度为109℃，压力为20KPa；经一效蒸发器分离室汽液分离，液相进入二效蒸发器加热室，汽相作为二效蒸发器加热室热源，温度为93℃，压力为40KPa；经二效蒸发器分离室汽液分离，液相进入三效蒸发器继续蒸发浓缩，汽相作为三效蒸发器加热室热源，温度为66.5℃，压力为80KPa；继续浓缩至固含量达到25%后出料。
10.根据权利要求9所述的L-天冬氨酸的清洁提取工艺，其特征在于：所述三效蒸发器内的浓缩溶液经出料泵送入旋流器增浓，增浓厚的45%固含量的硫酸铵溶液进入稠厚器结晶，结晶温度为50-70℃，压力为常压，结晶完成后固含量达50%，经离心机甩干后进入母液池，由液下泵返回到三效蒸发继续蒸发；获得的硫酸铵晶体进入盘式干燥器，通过蒸汽间接加热，干燥温度为65-78℃，得到硫酸铵产品。
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