CN108299278B - 一种提取分离l-色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种提取分离L‑色氨酸的方法。本发明对含有L‑色氨酸的发酵液进行微滤、脱色、色谱分离和减压浓缩处理，得到色氨酸结晶浆料1；将其进行梯度降温结晶处理，得到湿晶体和一次母液；湿晶体干燥后，得到色氨酸晶体；一次母液脱色、减压浓缩，得到色氨酸结晶浆料2；将其进行梯度降温结晶处理，得到湿晶体和二次母液；二次母液脱色处理后转入陶瓷微滤膜出料进行循环；湿晶体进行干燥处理，得到色氨酸晶体。该方法具有条件温和、操作简便、分离步骤少、选择性好，清洁生产等特点，克服了现有技术存在的收率不高、污水排量大及生产强度大的缺点，并且使L‑色氨酸的收率和质量显著提高。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种提取分离L-色氨酸的方法。
背景技术
L-色氨酸又被称为第二必需氨基酸，目前广泛应用于医药、食品、饲料添加剂以及农业环境检测等行业。近年来，随着国内饲料工业发展迅速，以及L-色氨酸及其代谢产物研究的越来越深入，尤其是随着我国老龄化程度不断加重，其在医药行业上的用途也不断扩大，L-色氨酸逐渐成为一种国际市场发展潜力巨大、国内市场需求较大的产品。
(1)L-色氨酸在医药研究方面的应用
L-色氨酸在医药行业的应用一直是医药界的研究热点。L-色氨酸及其代谢产物能够广泛参与到生物体内的新陈代谢过程，在L-色氨酸的分解代谢过程中可以产生多种生理活性物质，如5-羟色胺(5-HT)、色素、烟酸、吲哚乙酸、生物碱、辅酶、褪黑素和植物激素等。这些代谢产物能够广泛参与到人体的各项生理活动，同时会参与众多的生理调节。近年来研究发现，L-色氨酸不只用来制作氨基酸注射液，对于抑郁症、高血压及疼痛都有良好的效果，在欧美一些国家已经广泛应用于临床治疗。
(2)L-色氨酸在饲料添加剂行业的应用
L-色氨酸是饲料市场上的除酪氨酸和蛋氨酸之外的三大氨基酸饲料添加剂之一。如果禽类体内L-色氨酸供应不足时，动物体内会出现一系列不适应症状，如脂肪积累速度减缓、机体生长缓慢，公畜有时候会出现睾丸发育不良等现象。而且，在饲料中添加微量的L-色氨酸就可以达到促进动物体体重增加的目的，具有良好的效果。
(3)L-色氨酸在食品行业的应用
人体也不能自身合成L-色氨酸，为了满足自身需要，需要从外界获取L-色氨酸，而来源主要就是食物。L-色氨酸在人及动物的体内代谢过程发挥着重要的作用，所以L-色氨酸又称为第二必需氨基酸。L-色氨酸在食物添加剂的应用方面现在越来越受到人们的重视。在国内外很多地方，已经将L-色氨酸制作为食品添加剂，人体摄入之后会对人体生理活动有许多积极作用，比如可以提高机体对植物蛋白的利用效率，加速蛋白分解利用。另外，L-色氨酸容易与金属离子发生作用，作为一种螯合剂来使用时，经常用作防腐剂，添加到奶粉中防止变质或用作鱼类保鲜剂。
(4)L-色氨酸在农业以及环境监测方面的应用
L-色氨酸在农业害虫防治方面也有一定应用，例如L-色氨酸可以使南方毛虫拒食死亡。L-色氨酸还可以加入到水杨酸和环磷酸中作为稳定剂，能够增强其杀虫效果。色氨酸具有吲哚环，具有良好的荧光吸收性，是荧光性最强的氨基酸，因此可用于检测生物生态系统及自然环境中有毒金属离子(如Cu2+、As3+、Pb2+)。色氨酸对环境有高度敏感性，某些物质极微小的极性变化也可以使吸收光谱发生变化，因此，将色氨酸作为极性探针，可以检测环境中某些成分的极性变化。
目前，离子交换法是从发酵液中提纯L-色氨酸的主流方法，然而离子交换均为单柱间歇操作，树脂利用率低，对L-色氨酸的吸附量一般在64～90g/kg树脂范围，且离子交换工艺一般包括进样、纯水洗杂、0.2～0.5mol/L低浓度氨水洗杂(如L-谷氨酸杂质)、2mol/L高浓度氨水解析L-色氨酸和水洗等步骤，工艺步骤繁琐，对L-色氨酸解吸缺乏精确控制，存在解吸拖尾现象，解吸收率徘徊在93％～95％，洗脱剂消耗大，增加了L-色氨酸的生产成本，而低浓度氨水洗杂去除谷氨酸步骤要严格控制洗脱时间以及出料pH，因此对于杂质的去除率并不高，而且该步骤也会伴随L-色氨酸的损失。
国内L-色氨酸发酵生产提取基本沿用上述方法，个别工进行了调整，但未从根本上解决L-色氨酸提取过程发酵液杂质去除不彻底、离子交换树脂污染严重、L-色氨酸提取收率低、L-色氨酸产品纯度低等问题。
随着生化分离技术的进步，先进的分离设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜分离技术和工业色谱分离术的发展和应用，使各种生化分离工艺大为改观。膜分离技术用于发酵产品的分离精制已有成功的先例，但利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中分离提取L-色氨酸，还未见报道。
发明内容
为了克服现有发酵法生产L-色氨酸的提取收率低及提取过程造成的环境污染严重等缺点和不足，本发明的目的在于提供一种提取分离L-色氨酸的方法，该方法利用膜分离与工业色谱分离组合技术从发酵液中分离提取L-色氨酸，具有操作简单、成本低、提取收率高等优点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提取分离L-色氨酸的方法，包含如下步骤：
(1)调整含有L-色氨酸的发酵液pH至3.0～4.5，并加热至60～70℃；然后采用陶瓷微滤膜进行微滤，得到色氨酸陶瓷清液和菌体蛋白；
(2)采用活性炭对步骤(1)制得的色氨酸陶瓷清液进行脱色处理，过滤，得到含色氨酸的脱色清液；然后将含色氨酸的脱色清液进行色谱分离，其中，固定相为Na+型均孔强酸性阳离子树脂，得到色氨酸提取液；
(3)将步骤(2)制得的色氨酸提取液减压浓缩至色氨酸浓度为70～80g/L，得到色氨酸结晶浆料1；将色氨酸结晶浆料1进行梯度降温结晶处理，离心分离，得到湿晶体和一次母液；
(4)对步骤(3)制得的湿晶体进行干燥处理，得到色氨酸晶体；对步骤(3)制得的的一次母液采用活性炭进行脱色处理，过滤，得到脱色液；将脱色液减压浓缩至60～70g/L，得到色氨酸结晶浆料2；将色氨酸结晶浆料2进行梯度降温结晶处理，离心分离，得到湿晶体和二次母液；
(5)对步骤(4)制得的二次母液采用活性炭进行脱色处理，过滤后转入步骤(1)陶瓷微滤膜出料(色氨酸陶瓷清液)进行循环；将步骤(4)制得的湿晶体进行干燥处理，得到色氨酸晶体；
步骤(1)中所述的调整含有L-色氨酸的发酵液pH的试剂优选为硫酸；
步骤(1)中所述的加热优选采用板式换热器；
步骤(1)中所述的微滤的条件优选为进料压力0.5Mpa，出料压力0.3Mpa；
步骤(2)中所述的脱色的条件优选为：活性炭添加量为色氨酸陶瓷清液中总酸(色氨酸)质量的15～25％，60～70℃脱色40～60min；
步骤(2)中所述的色谱分离的条件优选为：柱温50～60℃，含色氨酸的脱色清液进料流量2～3倍柱体积，进料流速每小时2～3倍柱体积；然后用质量分数为0.15～0.2％的氨水顶洗0.5～1倍柱体积，顶洗出料为色谱残液；顶洗结束后用2～3倍柱体积的质量分数为0.15～0.2％的氨水洗脱，得到色氨酸提取液；
步骤(3)中所述的减压浓缩的条件优选为压力-0.08MPa，温度50～80℃；
步骤(3)中所述的减压浓缩进一步优选在三效升膜式蒸发器中进行，其中，进料流速20～30m3/h，三效出料4～6m3/h，一效温度50～60℃，二效温度60～70℃，三效温度70～80℃；
步骤(3)中所述的梯度降温结晶处理的条件优选为：每小时降温15～20℃，结晶时间为4～5h，出料温度优选为18～25℃；
步骤(3)中所述的梯度降温结晶处理优选在结晶罐中结晶；
步骤(3)中所述的离心优选采用平板刮刀卸料自动离心机；
步骤(3)中所述的湿晶体的水分选为20～30％；
步骤(4)中所述的色氨酸晶体的含水率优选＜0.5％；
步骤(4)中所述的一次母液脱色的条件：活性炭添加量为一次母液中总酸质量的15～25％，60～70℃脱色40～60min；
步骤(4)中所述的减压浓缩的条件优选为压力-0.08MPa，温度60～80℃；
步骤(4)中所述的减压浓缩进一步优选在二效升膜式蒸发器中进行，其中，进料流速15～20m3/h，二效出料4～6m3/h，一效温度60～70℃，二效温度70～80℃；
步骤(4)中所述的梯度降温结晶处理的条件优选为：每小时降温15～20℃，结晶时间为4～5h，出料温度优选为18～25℃；
步骤(4)中所述的梯度降温结晶处理优选在结晶罐中结晶；
步骤(4)中所述的离心优选采用平板刮刀卸料自动离心机；
步骤(4)中所述的湿晶体的水分选为20～30％；
步骤(5)中所述的二次母液脱色的条件：活性炭添加量为二次母液中总酸质量的15～25％，60～70℃脱色40～60min；
步骤(4)和步骤(5)中所述的干燥处理优选为闪蒸干燥处理；
步骤(5)中所述的色氨酸晶体的含水率优选＜0.5％；
所述的提取分离L-色氨酸的方法，还包含如下步骤：
将步骤(1)制得的菌体蛋白和步骤(2)中色谱分离后的色谱残液混合制备成高蛋白饲料；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用陶瓷微滤膜分离工艺过滤调pH预处理及升温预处理的发酵液，与普通陶瓷微滤膜相比其除菌及除杂更彻底，料液质量更好；与有机材质的超滤纳滤膜相比，其易清洗，且耐酸碱耐高温，使用周期更长。
(2)本发明采用Na+型均孔强酸性阳离子树脂进行柱分离纯化，且无需对料液进行脱气处理，降低能耗；采用色谱树脂代替离子交换树脂和离子交换工艺相比，树脂无需酸碱再生，用质量分数为0.15％～0.2％的氨水解析避免高氨氮废水排放；采用活性炭脱色后的料液进色谱柱，降低了色谱树脂的污染，增加了色谱树脂的使用寿命。
(3)本发明采用膜分离和色谱分离相结合的工艺，大大提高了操作效率，L-色氨酸提取收率从原来70％提升到85％以上，色氨酸得到高效分离回收，能够提高产品纯度和等级，实现了清洁生产。
(4)色谱残液与菌体蛋白综合利用制备成高蛋白饲料，实现了产品利润的最大化。
(5)该方法具有条件温和、操作简便、分离步骤少、选择性好，清洁生产等特点，克服了现有技术存在的收率不高、污水排量大及生产强度大的缺点，并且使L-色氨酸的收率和质量显著提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《生物工程下游技术》(科学出版社)、以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1
(1)以大肠杆菌JLTrP为生产菌株，采用斜面固体培养基(蛋白胨1g/L，酵母粉1.0g/L，NaCl 0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0)活化菌种，用生理盐水制备菌悬液接种至种子培养基(葡萄糖30g/L，磷酸氢二钾3.0g/L，硫酸铵2.0g/L，酵母粉6g/L，氯化钾1.5g/L，硫酸镁1.6g/L，柠檬酸1.6g/L，VB1 0.0013g/L，生物素0.0003g/L，硫酸亚铁0.0028g/L，硫酸锰0.0012g/L，消泡剂0.2mL/L)中，36℃，通过调整转速(80～150rpm)、风量、罐压控制溶氧20～30％，培养9h，得到种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比10％(v/v)的接种量转接至装有色氨酸发酵培养基(葡萄糖8g/L，柠檬酸2.0g/L，硫酸亚铁0.0756g/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钾3g/L，酵母粉3.0g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸锰0.0035g/L，硫酸铜0.0001g/L，硫酸锌0.00032g/L，生物素0.3mg/L，消泡剂0.2mL/L)的50m3发酵罐中，在35℃，溶氧量25～30％，pH7.0(NH3·H2O调节)的条件下，发酵培养36h；
(3)将步骤(2)制得的含色氨酸的发酵液(色氨酸含量为35g/L)用质量分数为98％的硫酸调pH至4，并加热至65℃；然后过陶瓷微滤膜(进料流速5L/h，进料压力0.5MPa，出料压力0.3MPa)，得到色氨酸陶瓷清液和菌体蛋白；
(4)采用活性炭对步骤(3)制得的色氨酸陶瓷清液进行脱色处理，其中，活性炭用量为色氨酸陶瓷清液中总酸质量的15％，脱色温度60℃，脱色时间40min，然后经板框过滤器过滤，得到含色氨酸的脱色清液；然后将含色氨酸的脱色清液进行色谱分离，其中，固定相为Na+型均孔强酸性阳离子树脂，柱温60℃，进料量为2倍柱体积，进料流速每小时2倍柱体积，进料结束后用0.5倍柱体积的质量分数为0.20％的氨水顶洗，顶洗出料为色谱残液；顶洗结束后用2倍柱体积的质量分数为0.20％的氨水洗脱，得到色氨酸提取液；
(5)将步骤(4)制得的色氨酸提取液泵入三效升膜式蒸发器进行减压浓缩至色氨酸浓度为70g/L，得到色氨酸结晶浆料1，其中，操作压力-0.08MPa，进料流速20m3/h，三效出料4m3/h，一效温度50℃，二效温度60℃，三效温度70℃；然后将色氨酸结晶浆料1在结晶罐中进行梯度降温结晶处理(每小时降温15℃，结晶时间为4h，出料温度为18℃)，采用平板刮刀卸料自动离心机离心分离，得到含水量为25％的湿晶体和一次母液；
(6)对步骤(5)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为75℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；对步骤(5)制得的的一次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，得到脱色液；将脱色液泵入二效升膜式蒸发器进行减压浓缩至65g/L，得到色氨酸结晶浆料2，其中，压力-0.08MPa，进料流速20m3/h，二效出料5m3/h，一效温度65℃，二效温度75℃；将色氨酸结晶浆料2进行梯度降温结晶处理(同步骤(5))，离心分离，得到含水量为25％的湿晶体和二次母液；
(7)对步骤(6)制得的二次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，过滤后转入步骤(2)陶瓷微滤膜出料(色氨酸陶瓷清液)进行循环；将步骤(6)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为75℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；
(8)将步骤(3)制得的菌体蛋白和步骤(4)中色谱分离后的色谱残液(经五效蒸发器浓缩)混合制备成高蛋白饲料。
最后经物料衡算，色氨酸的收率为87.85％，色氨酸纯度及各项指标均符合饲料级色氨酸国标要求。
实施例2
(1)以大肠杆菌JLTrP为生产菌株，采用斜面固体培养基(蛋白胨1g/L，酵母粉1.0g/L，NaCl 0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0)活化菌种，用生理盐水制备菌悬液接种至种子培养基(葡萄糖30g/L，磷酸氢二钾3.0g/L，硫酸铵2.0g/L，酵母粉6g/L，氯化钾1.5g/L，硫酸镁1.6g/L，柠檬酸1.6g/L，VB1 0.0013g/L，生物素0.0003g/L，硫酸亚铁0.0028g/L，硫酸锰0.0012g/L，消泡剂0.2mL/L)中，36℃，通过调整转速(80～150rpm)、风量、罐压控制溶氧20～30％，培养9h，得到种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比10％(v/v)的接种量转接至装有色氨酸发酵培养基(葡萄糖8g/L，柠檬酸2.0g/L，硫酸亚铁0.0756g/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钾3g/L，酵母粉3.0g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸锰0.0035g/L，硫酸铜0.0001g/L，硫酸锌0.00032g/L，生物素0.3mg/L，消泡剂0.2mL/L)的50m3发酵罐中，在35℃，溶氧量25～30％，pH7.0(NH3·H2O调节)的条件下，发酵培养36h；
(3)将步骤(2)制得的含色氨酸的发酵液(色氨酸含量为35g/L)用质量分数为98％的硫酸调pH至3.0，并加热至60℃；然后过陶瓷微滤膜(进料流速5L/h，进料压力0.5MPa，出料压力0.3MPa)，得到色氨酸陶瓷清液和菌体蛋白；
(4)采用活性炭对步骤(3)制得的色氨酸陶瓷清液进行脱色处理，其中，活性炭用量为色氨酸陶瓷清液中总酸质量的20％，脱色温度60℃，脱色时间60min，然后经板框过滤器过滤，得到含色氨酸的脱色清液；然后将含色氨酸的脱色清液进行色谱分离，其中，固定相为Na+型均孔强酸性阳离子树脂，柱温55℃，进料量为2.5倍柱体积，进料流速每小时2.5倍柱体积，进料结束后用0.5倍柱体积的质量分数为0.18％的氨水顶洗，顶洗出料为色谱残液；顶洗结束后用2.5倍柱体积的质量分数为0.18％的氨水洗脱，得到色氨酸提取液；
(5)将步骤(4)制得的色氨酸提取液泵入三效升膜式蒸发器进行减压浓缩至色氨酸浓度为75g/L，得到色氨酸结晶浆料1，其中，操作压力-0.08MPa，进料流速30m3/h，三效出料6m3/h，一效温度60℃，二效温度70℃，三效温度80℃；然后将色氨酸结晶浆料1在结晶罐中进行梯度降温结晶处理(每小时降温20℃，结晶时间为5h，出料温度为20℃)，采用平板刮刀卸料自动离心机离心分离，得到含水量为20％的湿晶体和一次母液；
(6)对步骤(5)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为70℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；对步骤(5)制得的的一次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，得到脱色液；将脱色液泵入二效升膜式蒸发器进行减压浓缩至60g/L，得到色氨酸结晶浆料2，其中，压力-0.08MPa，进料流速15m3/h，二效出料4m3/h，一效温度60℃，二效温度70℃；将色氨酸结晶浆料2进行梯度降温结晶处理(同步骤(5))，离心分离，得到含水量为20％的湿晶体和二次母液；
(7)对步骤(6)制得的二次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，过滤后转入步骤(2)陶瓷微滤膜出料(色氨酸陶瓷清液)进行循环；将步骤(6)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为70℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；
(8)将步骤(3)制得的菌体蛋白和步骤(4)中色谱分离后的色谱残液(经五效蒸发器浓缩)混合制备成高蛋白饲料。
最后经物料衡算，色氨酸的收率为86.47％，色氨酸纯度及各项指标均符合饲料级色氨酸国标要求。
实施例3
(1)以大肠杆菌JLTrP为生产菌株，采用斜面固体培养基(蛋白胨1g/L，酵母粉1.0g/L，NaCl 0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0)活化菌种，用生理盐水制备菌悬液接种至种子培养基(葡萄糖30g/L，磷酸氢二钾3.0g/L，硫酸铵2.0g/L，酵母粉6g/L，氯化钾1.5g/L，硫酸镁1.6g/L，柠檬酸1.6g/L，VB1 0.0013g/L，生物素0.0003g/L，硫酸亚铁0.0028g/L，硫酸锰0.0012g/L，消泡剂0.2mL/L)中，36℃，通过调整转速(80～150rpm)、风量、罐压控制溶氧20～30％，培养9h，得到种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比10％(v/v)的接种量转接至装有色氨酸发酵培养基(葡萄糖8g/L，柠檬酸2.0g/L，硫酸亚铁0.0756g/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钾3g/L，酵母粉3.0g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸锰0.0035g/L，硫酸铜0.0001g/L，硫酸锌0.00032g/L，生物素0.3mg/L，消泡剂0.2mL/L)的50m3发酵罐中，在35℃，溶氧量25～30％，pH7.0(NH3·H2O调节)的条件下，发酵培养36h；
(3)将步骤(2)制得的含色氨酸的发酵液(色氨酸含量为35g/L)用质量分数为98％的硫酸调pH至4.5，并加热至70℃；然后过陶瓷微滤膜(进料流速5L/h，进料压力0.5MPa，出料压力0.3MPa)，得到色氨酸陶瓷清液和菌体蛋白；
(4)采用活性炭对步骤(3)制得的色氨酸陶瓷清液进行脱色处理，其中，活性炭用量为色氨酸陶瓷清液中总酸质量的25％，脱色温度70℃，脱色时间40min，然后经板框过滤器过滤，得到含色氨酸的脱色清液；然后将含色氨酸的脱色清液进行色谱分离，其中，固定相为Na+型均孔强酸性阳离子树脂，柱温50℃，进料量为3倍柱体积，进料流速每小时3倍柱体积，进料结束后用0.5倍柱体积的质量分数为0.15％的氨水顶洗，顶洗出料为色谱残液；顶洗结束后用3倍柱体积的质量分数为0.15％的氨水洗脱，得到色氨酸提取液；
(5)将步骤(4)制得的色氨酸提取液泵入三效升膜式蒸发器进行减压浓缩至色氨酸浓度为80g/L，得到色氨酸结晶浆料1，其中，操作压力-0.08MPa，进料流速25m3/h，三效出料5m3/h，一效温度55℃，二效温度65℃，三效温度75℃；然后将色氨酸结晶浆料1在结晶罐中进行梯度降温结晶处理(每小时降温18℃，结晶时间为4.5h，出料温度为25℃)，采用平板刮刀卸料自动离心机离心分离，得到含水量为30％的湿晶体和一次母液；
(6)对步骤(5)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为80℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；对步骤(5)制得的的一次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，得到脱色液；将脱色液泵入二效升膜式蒸发器进行减压浓缩至67g/L，得到色氨酸结晶浆料2，其中，压力-0.08MPa，进料流速20m3/h，二效出料6m3/h，一效温度70℃，二效温度80℃；将色氨酸结晶浆料2进行梯度降温结晶处理(同步骤(5))，离心分离，得到含水量为30％的湿晶体和二次母液；
(7)对步骤(6)制得的二次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，过滤后转入步骤(2)陶瓷微滤膜出料(色氨酸陶瓷清液)进行循环；将步骤(6)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为80℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；
(8)将步骤(3)制得的菌体蛋白和步骤(4)中色谱分离后的色谱残液(经五效蒸发器浓缩)混合制备成高蛋白饲料。
最后经物料衡算，色氨酸的收率为85.36％，色氨酸纯度及各项指标均符合饲料级色氨酸国标要求。
实施例4
(1)以大肠杆菌JLTrP为生产菌株，采用斜面固体培养基(蛋白胨1g/L，酵母粉1.0g/L，NaCl 0.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0)活化菌种，用生理盐水制备菌悬液接种至种子培养基(葡萄糖30g/L，磷酸氢二钾3.0g/L，硫酸铵2.0g/L，酵母粉6g/L，氯化钾1.5g/L，硫酸镁1.6g/L，柠檬酸1.6g/L，VB1 0.0013g/L，生物素0.0003g/L，硫酸亚铁0.0028g/L，硫酸锰0.0012g/L，消泡剂0.2mL/L)中，36℃，通过调整转速(80～150rpm)、风量、罐压控制溶氧20～30％，培养9h，得到种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按照体积百分比10％(v/v)的接种量转接至装有色氨酸发酵培养基(葡萄糖8g/L，柠檬酸2.0g/L，硫酸亚铁0.0756g/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钾3g/L，酵母粉3.0g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸锰0.0035g/L，硫酸铜0.0001g/L，硫酸锌0.00032g/L，生物素0.3mg/L，消泡剂0.2mL/L)的50m3发酵罐中，在35℃，溶氧量25～30％，pH7.0(NH3·H2O调节)的条件下，发酵培养36h；
(3)将步骤(2)制得的含色氨酸的发酵液(色氨酸含量为35g/L)用质量分数为98％的硫酸调pH至4，并加热至65℃；然后过陶瓷微滤膜(进料流速5L/h，进料压力0.5MPa，出料压力0.3MPa)，得到色氨酸陶瓷清液和菌体蛋白；
(4)采用活性炭对步骤(3)制得的色氨酸陶瓷清液进行脱色处理，其中，活性炭用量为色氨酸陶瓷清液中总酸质量的20％，脱色温度65℃，脱色时间50min，然后经板框过滤器过滤，得到含色氨酸的脱色清液；然后将含色氨酸的脱色清液进行色谱分离，其中，固定相为Na+型均孔强酸性阳离子树脂，柱温50℃，进料量为2倍柱体积，进料流速每小时2倍柱体积，进料结束后用0.5倍柱体积质量分数为0.18％的氨水顶洗，顶洗出料为色谱残液；顶洗结束后用2.5倍柱体积的质量分数为0.18％的氨水洗脱，得到色氨酸提取液；
(5)将步骤(4)制得的色氨酸提取液泵入三效升膜式蒸发器进行减压浓缩至色氨酸浓度为80g/L，得到色氨酸结晶浆料1，其中，操作压力-0.08MPa，进料流速28m3/h，三效出料5m3/h，一效温度55℃，二效温度65℃，三效温度75℃；然后将色氨酸结晶浆料1在结晶罐中进行梯度降温结晶处理(每小时降温18℃，结晶时间为4h，出料温度为18℃)，采用平板刮刀卸料自动离心机离心分离，得到含水量为25％的湿晶体和一次母液；
(6)对步骤(5)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为75℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；对步骤(5)制得的的一次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，得到脱色液；将脱色液泵入二效升膜式蒸发器进行减压浓缩至70g/L，得到色氨酸结晶浆料2，其中，压力-0.08MPa，进料流速18m3/h，二效出料5.5m3/h，一效温度65℃，二效温度75℃；将色氨酸结晶浆料2进行梯度降温结晶处理(同步骤(5))，离心分离，得到含水量为25％的湿晶体和二次母液；
(7)对步骤(6)制得的二次母液采用活性炭进行脱色处理(同步骤(4))，然后经板框过滤器过滤，过滤后转入步骤(2)陶瓷微滤膜出料(色氨酸陶瓷清液)进行循环；将步骤(6)制得的湿晶体进行闪蒸干燥处理，处理温度为75℃，得到含水率＜0.5％的色氨酸晶体；
(8)将步骤(3)制得的菌体蛋白和步骤(4)中色谱分离后的色谱残液(经五效蒸发器浓缩)混合制备成高蛋白饲料。
最后经物料衡算，色氨酸的收率为88.42％，色氨酸纯度及各项指标均符合饲料级色氨酸国标要求。
Claims (9)
1.一种提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)调整含有L-色氨酸的发酵液pH至3.0～4.5，并加热至60～70℃；然后采用陶瓷微滤膜进行微滤，得到色氨酸陶瓷清液和菌体蛋白；
(2)采用活性炭对步骤(1)制得的色氨酸陶瓷清液进行脱色处理，过滤，得到含色氨酸的脱色清液；然后将含色氨酸的脱色清液进行色谱分离，其中，固定相为Na+型均孔强酸性阳离子树脂，得到色氨酸提取液；
(3)将步骤(2)制得的色氨酸提取液减压浓缩至色氨酸浓度为70～80g/L，得到色氨酸结晶浆料1；将色氨酸结晶浆料1进行梯度降温结晶处理，离心分离，得到湿晶体和一次母液；
(4)对步骤(3)制得的湿晶体进行干燥处理，得到色氨酸晶体；对步骤(3)制得的的一次母液采用活性炭进行脱色处理，过滤，得到脱色液；将脱色液减压浓缩至60～70g/L，得到色氨酸结晶浆料2；将色氨酸结晶浆料2进行梯度降温结晶处理，离心分离，得到湿晶体和二次母液；
(5)对步骤(4)制得的二次母液采用活性炭进行脱色处理，过滤后转入步骤(1)陶瓷微滤膜出料进行循环；将步骤(4)制得的湿晶体进行干燥处理，得到色氨酸晶体；
步骤(2)中所述的色谱分离的条件为：柱温50～60℃，含色氨酸的脱色清液进料流量2～3倍柱体积，进料流速每小时2～3倍柱体积；然后用质量分数为0.15～0.2％的氨水顶洗0.5～1倍柱体积，顶洗出料为色谱残液；顶洗结束后用2～3倍柱体积的质量分数为0.15～0.2％的氨水洗脱，得到色氨酸提取液。
2.根据权利要求1所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的微滤的条件为进料压力0.5Mpa，出料压力0.3Mpa。
3.根据权利要求1所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的脱色的条件为：活性炭添加量为色氨酸陶瓷清液中总酸质量的15～25％，60～70℃脱色40～60min。
4.根据权利要求1所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的减压浓缩的条件为压力-0.08MPa，温度50～80℃。
5.根据权利要求4所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的减压浓缩在三效升膜式蒸发器中进行，其中，进料流速20～30m3/h，三效出料4～6m3/h，一效温度50～60℃，二效温度60～70℃，三效温度70～80℃。
6.根据权利要求1所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的梯度降温结晶处理的条件为：每小时降温15～20℃，结晶时间为4～5h，出料温度为18～25℃。
7.根据权利要求1所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的减压浓缩的条件为压力-0.08MPa，温度60～80℃。
8.根据权利要求7所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的减压浓缩在二效升膜式蒸发器中进行，其中，进料流速15～20m3/h，二效出料4～6m3/h，一效温度60～70℃，二效温度70～80℃。
9.根据权利要求1所述的提取分离L-色氨酸的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的梯度降温结晶处理的条件为：每小时降温15～20℃，结晶时间为4～5h，出料温度为18～25℃。
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