CN101812009B - 一种从发酵液中分离提取l-色氨酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的新工艺,包括发酵液预处理,处理液泵入陶瓷微滤膜过滤器,得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白;色氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液;色氨酸超滤液泵入纳滤膜过滤器,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液;过滤废液综合利用制成蛋白饲料;应用工业醋酸促进低温结晶,结晶母液经离子交换法处理套用,晶体经离心脱水烘干后得到成品L-色氨酸。本发明解决了工业醋酸回收的问题,而且大大提高了L-色氨酸的提取收率;过滤液与菌体蛋白综合利用实现了产品利润的最大化。实现了L-色氨酸提取总收率为85.2%,精制产品达到中国药典2005版标准。
Description
技术领域:
本发明涉及生化工程领域,特别是一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺。
背景技术:
根据联合国粮农组织2000年测算,世界市场L-色氨酸年需求量约为120万吨以上,截止到2007年底,全球L-色氨酸产能水平在10000吨以上,随着蛋氨酸、赖氨酸的大量应用,价格一直较高的L-色氨酸更希望有廉价高效的生产及提取方法,以便推进L-色氨酸的应用。所以L-色氨酸的市场缺口很大,前景广阔。L-色氨酸学名β-吲哚基丙氨酸,化学名L-2-氨基-3-吲哚基丙酸,别名L-胰化蛋白氨基酸、L-氨基吲哚丙酸,分子式C11H12O2N2,相对分子质量204.21。L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一,以游离态或结合态存在于生物体中。
当前利用微生物直接发酵法生产L-色氨酸以其原料成本低,来源广泛,产品纯度高,反应条件温和等优点逐渐成为L-色氨酸的主要生产方法,和其他生物工程产品一样,色氨酸工业生产也常常会受到生产成本的制约,而在生产成本的构成中,分离提取等下游工程的成本占有相当的比例。因此,研究L-色氨酸的提取方法具有重要的理论意义和实用价值。
工业化生产中,研究发酵液中L-色氨酸的提取工艺必须考虑其物料性质和提取方法路线。L-色氨酸属于热敏性物质,长时间加热或光照易着色,易分解变质。所以提取工艺研究中在提高收率和产品质量的基础上必须遵守低温快速的原则。现有资料表明目前利用发酵液分离提取色氨酸一般经过两个步骤,即粗品制备和精品制备。
粗品制备过程中一般采用膜过滤或离子交换法,或者二者结合的方法进行。中国专利(公开号:CN101531625A)“生物发酵法工业化生产L-色氨酸的发酵液提取方法”和中国专利(公开号:CN101691349A)“一种从发酵液中提取色氨酸的工艺”均采用微滤超滤纳滤膜系统过滤发酵液,但是前者的过滤液没有循环利用,造成环境污染和资源浪费,后者使用高浓度硫酸调节发酵液pH进行酸化处理,虽然有利于过滤,但是浓硫酸操作危险成本高,且造成发酵液偏离等电点,影响结晶收率;中国专利(公开号:CN101565395A)“一种发酵液中L-色氨酸的提取工艺”和中国专利(公开号CN101376646A)“从发酵液中提取L-色氨酸的新方法”均采用膜过滤与离子交换相结合的方法制备粗品,不足之处是前者陶瓷膜滤液直接进行离子交换,产品处理量大,成本高且污水排放量大,脱色液先纳滤再超滤容易堵塞钠滤膜,造成膜清洗困难,缩短使用寿命;后者利用金属膜过滤造价高,而且金属膜并不能一次有效地去除蛋白、色素跟无机离子,导致料液由于杂质多结晶效果差,并不适合工业化生产。
精品制备一般采用有机溶媒溶解重结晶法或活性炭脱色后重结晶法,或者二者相结合的方法。中国专利(公开号:CN101245047);“色氨酸提纯方法”采用一种表面氧化活性炭脱色,然后经间歇浓缩冷却结晶方式进行精制,该方法对脱色的粗品质量要求较高,纯度要求95%以上,而且间歇浓缩冷却结晶虽然晶型好,但长时间对料液真空浓缩,势必对热敏性的色氨酸产品造成破坏;中国专利(公开号:CN101565396A)“一种L-色氨酸的精制工艺”粗品溶解使用了丙酮作为溶剂,虽然产品质量较好,但是有机溶剂的使用增加了安全隐患且不容易回收,造成环境污染和成本高;中国专利(公开号:CN101550101A)“利用发酵液清洁化提纯L-色氨酸的方法”和中国专利(公开号:CN101531626A)“生物发酵法工业化生产L-色氨酸的精制方法”均采用活性炭脱色和有机溶媒相结合的方法进行精品制备,前者采用活性炭脱色和酒精溶液洗涤的方法,不足之处是酒精溶液易燃,存在安全隐患,且酒精洗涤液进入活性炭脱色工序后由于活性炭在有机溶液中脱色效果很差,并不能有效回收母液中的色氨酸,反而影响其一次料液的脱色;后者的精制过程包括活性炭脱色和加入冰醋酸促进结晶,不足之处是将粗品结晶母液直接浓缩,由于粗品结晶母液含酸高,无机离子和有机色素含量高,直接浓缩后浓缩液液粘稠,不易结晶,而且容易堵塞蒸发器,从而导致收率低,设备维修成本高。
发明内容:
本发明是针对现有发酵法生产L-色氨酸的工业化过程中,产品易变质,提取收率低以及环境污染严重的问题,而提供一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺。
本发明的技术方案是这样实现的:一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺包括以下步骤:
第一步、对直接发酵法产生的含有L-色氨酸发酵液进行预处理:处理方式为分别加入发酵液体积0.1%~1.0%的明矾和发酵液体积0.1%~1.0%的NaHSO3后,搅拌并加热到40~80℃,制为处理液;
第二步、将处理液泵入陶瓷微滤膜过滤器,得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白;
第三步、将色氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液;
第四步、将色氨酸超滤液泵入纳滤膜过滤器,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液;
第五步、将经纳滤的色氨酸浓缩液先减压浓缩,使部分水份蒸发,迅速搅拌冷却,在该溶液中加入1%~20%浓度为98%的工业醋酸,低温结晶,晶体经离心脱水,获得色氨酸粗品;
第六步、将色氨酸粗品用50~80℃的10~40倍体积的纯水溶解,加入粗品质量5%~40%的303#活性炭进行脱色,脱色温度控制在50~80℃保温,脱色10~60min,然后将压滤除炭后的脱色液泵入结晶罐中,迅速搅拌降温至10~20℃,结晶6h,晶体经离心脱水烘干后,得L-色氨酸成品;
第七步、结晶后的母液用离子交换树脂处理后,回流至步骤四循环利用;
第八步、将步骤四的透过液和步骤三的浓缩液再和步骤二的菌体蛋白混合,进入单效蒸发器结晶器,控制温度80℃,真空度为-0.08MPa,浓缩约8h后,进入气流烘干,经粉碎机粉碎后,制成高蛋白饲料,蛋白含量在90%以上。
本发明的技术方案可以是这样实现的:步骤二微滤膜器采用陶瓷管式膜分离系统,其材质可以是Al2O3或TiO2或SiO2或ZrO2,其孔径为20nm~100nm,截留分子尺寸≥1.0μ上m,pH范围1~14,操作温度为0~80℃,进膜压力与出膜压力差为0.1~1.0MPa,滤速控制在2~3m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于1.0g/L后停机,得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白。
本发明的技术方案还可以是这样实现的:步骤三超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统,超滤膜孔径为1~20nm,截留分子量为600~1000KDa,总过滤面积1080m2,其操作条件为pH 2~12,操作温度20~40℃,进膜压力与出膜压力差为0.5~1.5MPa,滤速控制在4~8m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于0.5g/L后停机,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液。
本发明的技术方案还可以是这样实现的:步骤四纳滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统,纳滤膜孔径为0.1~1nm,截留分子量为100~200KDa,总过滤面积810m2,其操作条件为pH 2~12,操作温度20~40℃,进膜压力与出膜压力差为0.5~1.5MPa,滤速控制在2.0~4.0m3/h,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液。
本发明的技术方案还可以是这样实现的:结晶母液进行离子交换所用树脂为强酸型阳离子交换树脂WA-2和/或LH-2和/或732,离子交换柱采用串联方式,洗脱液为0.1~1mol/L氨水。
本发明的积极效果是:本发明采用微滤超滤纳滤集成膜分离系统过滤发酵液,除菌除杂彻底、过滤时间短、温度低,特别适合处理热敏性的色氨酸物料;添加冰醋酸促进低温等电结晶,结晶母液不需要调节pH,可以直接通过离子交换套用回收,解决了冰醋酸回收的问题,而且大大提高L-色氨酸的提取收率;过滤液与菌体蛋白综合利用实现了产品利润的最大化。最终在500吨生产线实现了L-色氨酸提取总收率为87.2%,精制产品达到中国药典2005版标准。
具体实施方式:
以下结合具体的实施例,对本发明作进一步的详细描述。
实施例1:
第一步、对直接发酵法产生的含有L-色氨酸发酵液进行预处理:处理方式为加入发酵液体积0.1%的明矾和0.1%NaHSO3后,搅拌并加热到60℃,持续30min制为处理液;
第二步、将处理液泵入陶瓷微滤膜过滤器,控制温度±45℃,进膜压力与出膜压力差为0.2~0.3MPa,滤速控制在2~3m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于1.0g/L后停机,得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白,除菌率达到99.74%,L-色氨酸收率为99.3%;
第三步、将色氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器,控制温度±35℃,进膜压力与出膜压力差1.0±0.1MPa,滤速控制在4~8m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于0.5g/L后停机,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液,色素去除率达到96.31%,蛋白去除率达到59.67%,L-色氨酸收率为96.1%;
第四步、将色氨酸超滤液泵入纳滤膜过滤器,控制温度±40℃,进膜压力与出膜压力差1.0±0.2MPa,滤速控制在2.0~4.0m3/h,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液,离子去除率达到78.31%,L-色氨酸收率为95.4%;
第五步、将经纳滤的色氨酸浓缩液先减压浓缩,使部分水份蒸发,得到8%浓度的色氨酸溶液,迅速搅拌冷却,在该溶液中加入5%浓度为98%的工业醋酸,慢速搅拌并温度控制在10℃,结晶6h,晶体经离心脱水,获得色氨酸粗品,粗品结晶一次收率达57.5%;
第六步、将色氨酸粗品用50~80℃的10~40倍体积的纯水溶解,再加入30%的303#活性炭进行脱色,脱色温度控制在50~70℃,保温10~60min,经压滤除炭后的脱色液,泵入结晶罐中迅速搅拌降温至10~20℃,结晶6h,晶体经离心脱水烘干后,得L-色氨酸成品,精制收率为75.7%,产品符合中国药典2005版标准;
第七步、结晶母液用离子交换树脂处理后,回流至步骤四循环利用:将处理成H型的LH-2或WA-2阳离子树脂装入Φ2.2×4.0m的离子交换柱中,装柱高3m,两柱串联,操作温度为室温,上柱速度为1BV/h,上柱时及时检查有无漏吸,约上柱量为两倍床体积后,用1倍体积水洗涤树脂,流速为1.5~2BV/h,将洗涤液收集准备再次上柱,用0.5mol/L氨水1.5~2BV/h洗脱,收集液前一倍柱体积的20%,即树脂间隙水分算作前流,因色氨酸含量低回收再上柱,pH=4~11部分的洗脱液进行超滤脱色除蛋白,然后纳滤除盐浓缩,回至结晶罐低温结晶,pH高于11至无色氨酸流出作为下一批配制洗脱液使用,离子交换法总提取收率为73.7%,从发酵液中提取色氨酸的总收率达到83.4%;
第八步、将步骤四的透过液和步骤三的浓缩液再和步骤二的菌体蛋白混合,进入单效蒸发器结晶器,控制温度80℃,真空度为-0.08MPa,浓缩约8h后,进入气流烘干,经粉碎机粉碎后,制成色氨酸提取的副产品-高蛋白饲料,蛋白含量在90%以上。
实施例2:
第一步、在直接发酵法产生的含有L-色氨酸发酵液进行预处理:处理方式为加入发酵液体积0.1%的明矾和0.1%NaHSO3后,搅拌并加热到60℃,持续30min制为处理液;
第二步、将处理液泵入陶瓷微滤膜过滤器,控制温度±45℃,进膜压力与出膜压力差为0.2~0.3MPa,滤速控制在2~3m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于1.0g/L后停机,得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白,除菌率达到99.74%,L-色氨酸收率为99.3%;
第三步、将色氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器,控制温度±35℃,进膜压力与出膜压力差1.0±0.1MPa,滤速控制在4~8m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于0.5g/L后停机,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液,色素去除率达到96.31%,蛋白去除率达到59.67%,L-色氨酸收率为96.1%;
第四步、将色氨酸超滤液泵入纳滤膜过滤器,控制温度±40℃,进膜压力与出膜压力差1.0±0.2MPa,滤速控制在2.0~4.0m3/h,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液;离子去除率达到78.31%,L-色氨酸收率为95.4%;
第五步、将经纳滤的色氨酸浓缩液先减压浓缩,使部分水份蒸发,得到7%浓度的色氨酸溶液,迅速搅拌冷却,在该溶液中加入10%浓度为98%的工业醋酸,慢速搅拌并温度控制在15℃,结晶6h,晶体经离心脱水,获得色氨酸粗品,粗品结晶一次收率达63.7%;
第六步、将色氨酸粗品用50~80℃的10~40倍体积的纯水溶解,再加入20%的303#活性炭进行脱色,脱色温度控制在50~70℃,保温10~60min,经压滤除炭后的脱色液,泵入结晶罐中迅速搅拌降温至10~20℃,结晶6h,晶体经离心脱水烘干后,得L-色氨酸成品,精制收率为82.7%,产品符合中国药典2005版标准;
第七步、结晶母液用离子交换树脂处理后,回流至步骤四循环利用:将处理成H型的LH-2或WA-2阳离子树脂装入Φ2.2×4.0m的离子交换柱中,装柱高3m,两柱串联,操作温度为室温,上柱速度为1BV/h,上柱时及时检查有无漏吸,约上柱量为两倍床体积后,用1倍体积水洗涤树脂,流速为1.5~2BV/h,将洗涤液收集准备再次上柱,用0.5mol/L氨水1.5~2BV/h洗脱,收集液前一倍柱体积的20%,即树脂间隙水分算作前流,因色氨酸含量低回收再上柱,pH=4~11部分的洗脱液进行超滤脱色除蛋白,然后纳滤除盐浓缩,回至结晶罐低温结晶,pH高于11至无色氨酸流出作为下一批配制洗脱液使用,离子交换法总提取收率为73.7%。从发酵液中提取色氨酸的总收率达到85.3%。
第八步、将步骤四的透过液和步骤三的浓缩液再和步骤二的菌体蛋白混合,进入单效蒸发器结晶器,控制温度80℃,真空度为-0.08MPa,浓缩约8h后,进入气流烘干,经粉碎机粉碎后,制成色氨酸提取的副产品-高蛋白饲料,蛋白含量在90%以上。
实施例3:
第一步、在直接发酵法产生的含有L-色氨酸发酵液进行预处理:处理方式为加入发酵液体积0.1%的明矾和0.1%NaHSO3后,搅拌并加热到60℃,持续30min制为处理液;
第二步、将处理液泵入陶瓷微滤膜过滤器,控制温度±45℃,进膜压力与出膜压力差为0.2~0.3MPa,滤速控制在2~3m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于1.0g/L后停机。得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白;除菌率达到99.74%,L-色氨酸收率为99.3%;
第三步、将色氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器,控制温度±35℃,进膜压力与出膜压力差1.0±0.1MPa,滤速控制在4~8m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于0.5g/L后停机,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液;色素去除率达到96.31%,蛋白去除率达到59.67%,L-色氨酸收率为96.1%;
第四步、将色氨酸超滤液泵入纳滤膜过滤器,控制温度±40℃,进膜压力与出膜压力差1.0±0.2MPa,滤速控制在2.0~4.0m3/h,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液;离子去除率达到78.31%,L-色氨酸收率为95.4%;
第五步、将经纳滤的色氨酸浓缩液先减压浓缩,使部分水份蒸发,得到5%浓度的色氨酸溶液,迅速搅拌冷却,在该溶液中加入15%浓度为98%的工业醋酸,慢速搅拌并温度控制在15℃,结晶6h,晶体经离心脱水获得色氨酸粗品,粗品结晶一次收率达71.6%;
第六步、将色氨酸粗品用50~80℃的10~40倍体积的纯水溶解,再加入10%的303#活性炭进行脱色,脱色温度控制在50~70℃,保温10~60min,经压滤除炭后的脱色液,泵入结晶罐中迅速搅拌降温至10~20℃,结晶6h,晶体经离心脱水烘干后,得L-色氨酸成品,精制收率为89.9%,产品符合中国药典2005版标准;
第七步、结晶母液用离子交换树脂处理后,回流至步骤四循环利用:将处理成H型的LH-2或WA-2阳离子树脂装入Φ2.2×4.0m的离子交换柱中,装柱高3m,两柱串联,操作温度为室温,上柱速度为1BV/h,上柱时及时检查有无漏吸,约上柱量为两倍床体积后,用1倍体积水洗涤树脂,流速为1.5~2BV/h,将洗涤液收集准备再次上柱,用0.5mol/L氨水1.5~2BV/h洗脱,收集液前一倍柱体积的20%,即树脂间隙水分算作前流,因色氨酸含量低回收再上柱,pH=4~11部分的洗脱液进行超滤脱色除蛋白,然后纳滤除盐浓缩,回至结晶罐低温结晶,pH高于11至无色氨酸流出作为下一批配制洗脱液使用,离子交换法总提取收率为73.7%,从发酵液中提取色氨酸的总收率达到87.2%;
第八步、将步骤四的透过液和步骤三的浓缩液再和步骤二的菌体蛋白混合,进入单效蒸发器结晶器,控制温度80℃,真空度为-0.08MPa,浓缩约8h后,进入气流烘干,经粉碎机粉碎后,制成色氨酸提取的副产品-高蛋白饲料,蛋白含量在90%以上。
Claims (4)
1.一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺,其特征在于:该工艺包括以下步骤:
第一步、对直接发酵法产生的含有L-色氨酸发酵液进行预处理:处理方式为分别加入发酵液体积0.1%~1.0%的明矾和发酵液体积0.1%~1.0%的NaHSO3后,搅拌并加热到40~80℃,制为处理液;
第二步、将处理液泵入陶瓷微滤膜过滤器,采用陶瓷管式膜分离系统,其材质可以是Al2O3或TiO2或SiO2或ZrO2,其孔径为20nm~100nm,截留分子尺寸≥1.0μm,pH范围1~14,操作温度为0~80℃,进膜压力与出膜压力差为0.1~1.0MPa,滤速控制在2~3m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于1.0g/L后停机,得到除去菌体的色氨酸微滤液以及菌体蛋白;
第三步、将色氨酸微滤液泵入超滤膜过滤器,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液;
第四步、将色氨酸超滤液泵入纳滤膜过滤器,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液;
第五步、将经纳滤的色氨酸浓缩液先减压浓缩,使部分水份蒸发,迅速搅拌冷却,在该溶液中加入1%~20%浓度为98%的工业醋酸,低温结晶,晶体经离心脱水,获得色氨酸粗品;
第六步、将色氨酸粗品用50~80℃的10~40倍体积的纯水溶解,加入粗品质量5%~40%的303#活性炭进行脱色,脱色温度控制在50~80℃保温,脱色10~60min,然后将压滤除炭后的脱色液泵入结晶罐中,迅速搅拌降温至10~20℃,结晶6h,晶体经离心脱水烘干后,得L-色氨酸成品;
第七步、结晶后的母液用离子交换树脂处理后,回流至步骤四循环利用。
2.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺,其特征在于:步骤三超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统,超滤膜孔径为1~20nm,截留分子量为600~1000KDa,总过滤面积1080m2,其操作条件为pH 2~12,操作温度20~40℃,进膜压力与出膜压力差为0.5~1.5MPa,滤速控制在4~8m3/h,当清液流量小于2m3/h时,分多次,每次泵入1.5~3m3的纯化水顶洗,直至浓液中色氨酸含量低于0.5g/L后停机,得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液。
3.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺,其特征在于:步骤四纳滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统,纳滤膜孔径为0.1~1nm,截留分子量为100~200KDa,总过滤面积810m2,其操作条件为pH 2~12,操作温度20~40℃,进膜压力与出膜压力差为0.5~1.5MPa,滤速控制在2.0~4.0m3/h,得到色氨酸浓缩液以及含盐的透过液。
4.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取L-色氨酸的工艺,其特征在于:结晶母液进行离子交换所用树脂为强酸型阳离子交换树脂WA-2和/或LH-2和/或732,离子交换柱采用串联方式,洗脱液为0.1~1mol/L氨水。
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