CN104694612B - 一种工业化发酵高产l‑色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸领域，公开了一种工业化发酵高产L‑色氨酸的方法，包括如下步骤：步骤1)发酵、步骤2)微滤、步骤3)离交和超滤、步骤4)浓缩、步骤5)结晶以及步骤6)制备菌体蛋白粉。本发明方法具有发酵周期短、产酸率高及生产成本低等特点，同时工艺稳定、实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法，属于氨基酸发酵领域。
背景技术
L-色氨酸别名L-胰化蛋白氨基酸、L-β-(3-吲哚基)-α-丙氨酸，是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等行业。目前，世界市场色氨酸年需求量在万吨以上，并且以每年10％的速度增长，市场前景非常广阔。
L-色氨酸的生产方法有蛋白水解法、化学合成法、酶转化法及微生物发酵法。由于蛋白水解法、化学合成法和酶转化法在工业生产上存在很多问题，应用受到限制。近来，主要通过微生物发酵法进行L-色氨酸的生产。
现阶段的首要问题是，如何提高L-色氨酸的生产效率，国内外研究者利用基因重组技术，对L-色氨酸产生菌进行代谢工程育种，逐渐选育出一批高产的L-Trp生产菌株。目前，在国外，Aiba等通过在trpR.tnaA双基因失活的大肠杆菌中表达色氨酸操纵子(TrpE、TrpD解除反馈调控)，并结合多轮化学诱变的方法获得了L-Trp产量为30g/L的工程菌。1993年Katsumata等通过在L-Phe和L-Tyr缺陷型的谷氨酸棒杆菌中，共表达已解除反馈调控作用的DAHP合酶基因和色氨酸操纵子，辅以化学诱变后L-Trp产量达到40g/L。而在国内，利用代谢工程手段选育L-Trp生产菌株的研究在2000年以后逐渐得到展开，但目前已构建菌株的L-Trp生产能力与国外同类菌株相差较大。2007年，李剑欣等将抗反馈调控的aroG和trpED基因克隆至质粒pBV220，并转化至trpR.tnaA的双基因敲除菌中，摇瓶发酵后产L-Trp产量为0.168g/L，在此基础上，王静等利用大肠杆菌双质粒系统进一步共表达了ppsA和tktA基因，使L-Trp产量提高至1.3g/L。目前，采用生物法发酵生产L-色氨酸的工艺中主要存在以下三个方面的问题。第一方面：菌株产色基酸效率低，发酵时间长，糖转化率低下；第二方面：传统的提取工艺主要采用粗品制备精品，在制备过程中需要两次结晶，耗费大量的试剂，并需要增加工序去除这些试剂；这不仅增加了工艺的复杂性和工作量，还会造成不必要的生产浪费。第三方面：产生的大量发酵废弃物无法正确利用，导致环境污染。
发明内容
本发明为解决生物发酵工业化生产生产L-色氨酸产酸率低的问题，本发明的目的是提供一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法，该方法具有发酵周期短、产酸率高及生产成本低等特点，同时工艺稳定、实用性强。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法，所述工艺包括如下步骤：步骤1)发酵、步骤2)微滤、步骤3)离交和超滤、步骤4)浓缩、步骤5)结晶以及步骤6)制备菌体蛋白粉。
所述工艺具体包括如下步骤：
步骤1)发酵：将大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别培养至浓度为1×107个/mL的菌液，按照1∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％接种量接种到发酵培养基中，发酵30小时得到发酵液；
步骤2)微滤：将步骤1)所得发酵液送入提取储料罐，加热至65℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；
步骤3)离交和超滤：步骤2)所得滤过液进入三柱串联离交柱进行离子交换得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节L-色氨酸高浓液的pH值为3，超滤膜过滤得到超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；
步骤4)浓缩：将步骤3)得到的超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；将上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅浓缩得到L-色氨酸浓缩液；
步骤5)结晶：将步骤4)所得L-色氨酸浓缩液进行结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；
步骤6)制备菌体蛋白粉：将步骤2)所得截留物和步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液加入搅拌反应器，调整酶解反应温度55℃，加少许硫酸调整pH6.0，分别加入溶菌酶10kg/m3，酸性蛋白酶25Kg/m3，酶解时间为6小时，然后采用碟片分离机分离去除细胞壁，所得上清液经过低温蒸发得到膏状物，喷雾造粒干燥制成菌体蛋白粉。
优选地，所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L。
所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。
所述大肠杆菌(Escherichia coli)为CCTCC M 2011316，或者tnaA、trpR和tyrR基因失活的ATCC 27325；所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为ATCC13032。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
本发明在现有技术的基础上，通过大量试验发现，采用两种菌液按照一定比例混合，各菌株之间具备一定的协同作用，比常规的单一菌株发酵方法，能够大大提高色氨酸的发酵产量；
本发明采用三柱串联离交柱提取L-色氨酸，其生产工艺简洁，便于操作和维护，占地面积少，可连续工业化生产。
本发明采用超滤脱色技术，脱色过程简单，脱色效果明显；与传统活性炭脱色所产生大量工业废水和活性炭废料相比，减轻废水处理负担，节省了工业成本。
本发明在提取色氨酸过程中，对菌体蛋白进行了回收利用，获得了营养丰富的菌体蛋白培养基组份，变废为宝，增加了经济效益。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：
步骤1)发酵：将tnaA、trpR和tyrR基因敲除或失活的大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 27325(可参见Appl.Environ.Microbiol.October 1994vol.60no.10，3724-3731)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032(Journal ofBiotechnology，V104，September 2003，Pages5-25)分别培养至浓度为1×107个/mL的菌液，按照1∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，温度37℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，pH7.0，当发酵培养基中葡萄糖耗完后，进入补糖生产L-色氨酸阶段，流加葡萄糖液浓度为600g/L，液氨调节pH控制在7.0，色氨酸浓度可以达到53g/L，葡萄糖转化率为19.1％。待色氨酸生成速率明显下降，残糖浓度上升为1.0g/L时，结束发酵；整个发酵过程时间为30小时；
发酵液中色氨酸含量采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典(Ph Eurmonograph 1272)；同时在其他条件不变的前提下，检测了单一大肠杆菌发酵色氨酸浓度，仅为41g/L，葡萄糖转化率为17.8％。
步骤2)微滤：将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至65℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；
步骤3)离交和超滤：步骤2)滤过液进入三柱串联离交柱，柱中填充阳离子交换树脂柱(001×7)，吸附温度为30℃，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节上述L-色氨酸高浓液的pH值为3，超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，超滤膜孔径为5nm，截留分子量为600KDa，操作温度50℃，压力为0.25Mpa，滤速控制在60L/m2·h；
步骤4)：浓缩：将步骤3)得到的超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；所述反渗透膜为聚酰胺复合膜，脱水浓缩条件：压力0.55MPa，温度55℃；上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅53℃浓缩得到L-色氨酸浓缩液，真空度-0.1MPa；
步骤5)：结晶：将L-色氨酸浓缩液打入低温密闭结晶罐中结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品。所述结晶温度为18℃，pH为6.4，结晶时间10小时；干燥时间15s，温度为进入温度120℃，出去温度80℃。经检测产品纯度为99.7％，产品收率为93.6％。
步骤6)制备菌体蛋白粉：将步骤2)所得截留物和步骤3)所得浓缩液加入搅拌反应器，调整酶解反应温度55℃，加少许硫酸调整pH6.5，分别加入溶菌酶10kg/m3，酸性蛋白酶25Kg/m3，缓慢搅拌酶解时间为6小时，然后采用碟片分离机分离去除细胞壁，所得上清液经过低温蒸发得到膏状物，喷雾造粒干燥制成菌体蛋白粉。所述溶菌酶的活性为8000U/mg，酸性蛋白酶的活性为1000U/mg。
实施例2
一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：
步骤1)发酵：将大肠杆菌(Escherichia coli)CCTCC M 2011316(参见CN201110400855X)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032分别培养至浓度为1×107个/mL的菌液，按照1∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％(v/v)接种量接种到发酵培养基(葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L)中，温度37℃，溶氧控制20％，罐压0.05MPa，pH7.0，当发酵培养基中葡萄糖耗完后，进入补糖生产L-色氨酸阶段，流加葡萄糖液浓度为600g/L，液氨调节pH控制在7.0，色氨酸浓度可以达到54g/L，葡萄糖转化率为19.2％；待色氨酸生成速率明显下降，残糖浓度上升为1.0g/L时，结束发酵；整个发酵过程时间为30小时；
发酵液中色氨酸含量检测采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典(Ph Eurmonograph 1272)；而采用单一大肠杆菌株发酵产色氨酸浓度为43g/L，葡萄糖转化率为18.2％。
步骤2)微滤：将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至65℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；
步骤3)离交和超滤：步骤2)滤过液进入三柱串联离交柱，柱中填充阳离子交换树脂柱(001×7)，吸附温度为30℃，得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节上述L-色氨酸高浓液的pH值为3，超滤膜过滤得到色氨酸超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；所述超滤膜器采用聚酰胺管式膜分离系统，超滤膜孔径为10nm，截留分子量为800KDa，操作温度50℃，压力为0.25Mpa，滤速控制在60L/m2·h；
步骤4)浓缩：将步骤3)得到的超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；所述反渗透膜为聚酰胺复合膜，脱水浓缩条件：压力0.55MPa，温度55℃；上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅53℃浓缩得到L-色氨酸浓缩液，真空度-0.1MPa；
步骤5)结晶：将L-色氨酸浓缩液打入低温密闭结晶罐中结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品。所述结晶温度为18℃，pH为6.4，结晶时间10小时；干燥时间15s，温度为进入温度120℃，出去温度80℃。经检测产品纯度为99.6％，产品收率为93.5％。
步骤6)制备菌体蛋白粉：将步骤2)所得截留物和步骤3)所得浓缩液加入搅拌反应器，调整酶解反应温度55℃，加少许硫酸调整pH6.0，分别加入溶菌酶10kg/m3，酸性蛋白酶25Kg/m3，缓慢搅拌酶解时间为6小时，然后采用碟片分离机分离去除细胞壁，所得上清液经过低温蒸发得到膏状物，喷雾造粒干燥制成菌体蛋白粉。所述溶菌酶的活性为5000U/mg，酸性蛋白酶的活性为800U/mg。
实施例3
用实施例1制备的菌体蛋白粉替代标准YPD培养基中的酵母粉，其余成分不变，在相同条件下培养酿酒酵母和毕赤酵母，通过比较细胞的生长情况评价产品的培养效果，见表1。
表1
结论：利用比浊法测定OD600表征细胞的生长情况，表明以本产品可以替代市售酵母粉产品，并取得类似的培养效果。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (2)
1.一种工业化发酵高产L-色氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1)发酵：将大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别培养至浓度为1×107个/mL的菌液，按照1∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％接种量接种到发酵培养基中，发酵30小时得到发酵液；
步骤2)微滤：将步骤1)所得发酵液送入提取储料罐，加热至65℃，用盐酸调节调pH值为4，经微滤膜过滤得到截留物和滤过液；
步骤3)离交和超滤：步骤2)所得滤过液进入三柱串联离交柱进行离子交换得到L-色氨酸高浓液；然后用盐酸调节L-色氨酸高浓液的pH值为3，超滤膜过滤得到超滤液和含有色素及蛋白的浓缩液；
步骤4)浓缩：将步骤3)得到的超滤液利用反渗透膜脱水浓缩，得到纯水和L-色氨酸料液；将上述L-色氨酸料液打入双效低温浓缩锅浓缩得到L-色氨酸浓缩液；
步骤5)结晶：将步骤4)所得L-色氨酸浓缩液进行结晶，分别收集上清液和沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；
步骤6)制备菌体蛋白粉：将步骤2)所得截留物和步骤3)所得含有色素及蛋白的浓缩液加入搅拌反应器，调整酶解反应温度55℃，加少许硫酸调整pH6.0，分别加入溶菌酶10kg/m3，酸性蛋白酶25Kg/m3，酶解时间为6小时，然后采用碟片分离机分离去除细胞壁，所得上清液经过低温蒸发得到膏状物，喷雾造粒干燥制成菌体蛋白粉；
所述大肠杆菌(Escherichia coli)为CCTCC M 2011316，或者tnaA、trpR和tyrR基因失活的ATCC 27325；所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为ATCC13032；
所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L、酵母粉15g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸2.5g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁76mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸钠20mg/L、硫酸锌7mg/L、氯化钴6mg/L、硫酸铜0.9mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。
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