CN109517858A - 一种生产和提取l-色氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种生产和提取L‑色氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）菌株发酵，步骤2）微滤膜过滤，步骤3）脱色，步骤4）树脂吸附，步骤5）蒸发、结晶和干燥。本发明生产和提取L‑色氨酸工艺，其简洁可行，发酵效率高，便于操作和维护，占地面积小，可连续性工业生产。

Description

一种生产和提取L-色氨酸的方法
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种生产和提取L-色氨酸的方法。
背景技术
L-色氨酸的分子式为C11H12O2N2，分子量为204.21，含氮13.72％。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈绢丝光泽、六角片状自色晶体，无臭，有甜味。在水中溶解度1.14g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸，广泛应用于饲料行业中。
L-色氨酸的生产最早主要依靠蛋白质水解法和化学合成法，但是随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法又可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法，目前L-色氨酸生产主要以微生物发酵法生产为主。微生物发酵法具有原料价格低廉、工艺控制简单、产品质量可靠等优点。但随着发酵工业的快速发展，发酵法生产L-色氨酸对培养基营养成分和发酵调控的合理性提出了更高的要求。优良的L-色氨酸生产菌株、合理的培养基组成和适当的发酵调控策略有利于提高L-色氨酸的产酸水平。
近年来，L-色氨酸作为必需氨基酸，价格一直较高，L-色氨酸更希望有廉价高效的生产及提取方法，以便推进L-色氨酸的应用。和其他生物工程产品一样，L-色氨酸工业生产也常常会受到生产成本的制约，而在生产成本的构成中，分离提取等下游工程的成本占有相当的比例。因此研究提高L-色氨酸发酵和提取收率的方法具有重要的理论意义和实用价值。申请人之前的专利技术“CN104694614A” 公开了一种L-色氨酸的提取新工艺，包括：菌液发酵、L-色氨酸微膜过滤、三柱串联离交柱离交、超滤脱色、反渗透、双效浓缩、结晶、干燥、包装等工艺得到精品L-色氨酸产品。本发明采用三柱串联离交柱离交、超滤膜脱色和一次结晶得到L-色氨酸产品，工艺简单且可连续化生产，工艺废料经过综合处理可以生产蛋白饲料，绿色环保；该方法采用混合发酵的方式，提高了产酸效率，但是存在发酵工艺相对复杂、发酵参数难以控制等问题。针对上述缺陷，申请人的专利技术“CN201711289822”公开了采用单一菌株发酵的方式，通过添加电气石以及使用透析培养基来提高发酵产酸量。在上述专利技术的基础上，申请人继续对单一菌株发酵和提取条件进行了改进和优化。
发明内容
为解决上述问题，克服现有技术的不足之处，本发明提供了一种生产和提取L-色氨酸的方法，该方法通过合理配伍培养基，提高了发酵效率，并且对提取方法进行了优化。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
一种生产和提取L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）菌株发酵，步骤2）微滤膜过滤，步骤3）脱色，步骤4）树脂吸附，步骤5）蒸发、结晶和干燥。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）菌株发酵：以10%的接种量将产L-色氨酸大肠杆菌种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L，直至发酵结束，总发酵时间为42-48h，得到L-色氨酸发酵液；
步骤2）微滤膜过滤：将L-色氨酸发酵液加热至100℃，保温3min进行灭菌，然后采用微滤膜过滤除去菌体，收集滤液；
步骤3）脱色：往步骤2）所得滤液加入活性炭，温度40-50℃，脱色15-30min，抽滤获得脱色液；
步骤4）树脂吸附：将步骤3）所得脱色液通入大孔交换树脂，上柱吸附速率为1-3BV/h；用清水清洗树脂，然后用体积分数为60%的乙醇溶液对树脂进行洗脱，洗脱速率为1-3BV/h，得到L-色氨酸洗脱液；
步骤5）蒸发、结晶和干燥：将步骤4）获得的洗脱液打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进入低温密闭结晶罐中结晶，收集沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品。
进一步地，所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.4-0.6g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。
进一步地，所述营养液为：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1-1.5g/L，肌醇的浓度为0.5-1g/L，115℃下灭菌15min。
优选地，所述氯化胆碱为0.4-0.5g/L。
优选地，所述吲哚的浓度为1g/L，肌醇的浓度为0.5g/L。
优选地，所述微滤膜截留分子量为2000-10000Da，微滤温度为30-40℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。
优选地，所述结晶温度为16-20℃，pH为6.3-6.4，结晶时间10-12小时。
优选地，所述干燥时间15-30s，温度为：进料温度110-120℃，出料温度60-80℃。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性 ：
1、本发明生产和提取L-色氨酸工艺，其简洁可行，发酵效率高，便于操作和维护，占地面积小，可连续性工业生产。
2、本发明工艺大大提高了L-色氨酸的成品收率和纯度，有利于工业化，实现了利益的最大化和对环境污染的最小化。
3、色氨酸合成途径复杂，受较多因素的影响，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累色氨酸时，往往会出现生长问题，本研究通过优化营养物质改善了细胞代谢途径，色氨酸积累得到提升；为避免菌株因氮源切换而出现的细胞生长停滞期，在培养基中添加氯化胆碱，以刺激菌体生长；为解决菌体早衰和产酸效率低，提高中后期菌体活力，选择流加葡萄糖、吲哚和肌醇，并对添加时间进行了摸索，提高后期细胞产酸能力，进一步提高色氨酸产量。随着发酵时间的增加，大肠杆菌能够产生部分丝氨酸，通过流加吲哚，从而可以利用大肠杆菌色氨酸合成酶催化丝氨酸和吲哚合成色氨酸，提高色氨酸的产量；适量的肌醇可以强化CO2 固定反应, 促进氨基酸的积累，提高发酵转化率；多种因素相互协同，提高了色氨酸的发酵产量。
4、本发明工艺省去了超滤膜过滤和反渗透等操作操作，降低了设备成本和维护成本，换用脱色树脂对色素蛋白截留效果好，减少了酸碱用量和工业用水量，工艺操作简单，成本较低。
说明书附图
图1：氯化胆碱添加量对发酵液中菌体生物量和色氨酸产量的影响；
图2：吲哚添加量对发酵液中色氨酸产量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种生产和提取L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：
配制发酵培养基：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.4g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.8，在115℃下灭菌15min；
配制流加营养液：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1g/L，肌醇的浓度为0.5g/L，115℃下灭菌15min；
步骤1）大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例，以10%的接种量将种子液（OD600值为10.8）接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L；直至发酵结束，总发酵时间为42h，即得富含L-色氨酸发酵液。
步骤2）将发酵液加热至100℃，保温3min进行灭菌，然后采用微滤膜过滤除去菌体，收集滤液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；
步骤3）将步骤2）所得滤液加入0.5%的活性炭，温度45℃，脱色15min，抽滤获得脱色液；
步骤4）将步骤3）所得脱色液流通入大孔交换树脂，上柱吸附速率为2BV/h。取吸附液进行色氨酸含测定，实验测定后的残余色氨酸含量为1.2g/L，计算得树脂对色氨酸吸附率为97.4%。
步骤5）用清水清洗两次经步骤4）得到的吸附树脂，用体积分数为60%的乙醇溶液对吸附树脂进行洗脱，洗脱速率为2BV/h，流出液体积达到脱色液体积的五分之一之后，开始接受洗脱液，接受洗脱液体积为脱色液的三分之二，得到进一步纯化的L-色氨酸洗脱液；测得洗脱液中色氨酸含量19.9g/L，洗脱液透光率为76.2%；
步骤6）将步骤5）获得的洗脱液打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进入低温密闭结晶罐中结晶，收集沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；所述结晶温度为18℃，pH为6.3，结晶时间10小时；干燥时间20s，温度为进料温度110℃，出料温度70℃。经检测产品纯度为99.7%，产品收率为90.1%。
实施例2
一种生产和提取L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：
配制发酵培养基：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.5g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.6，在115℃下灭菌15min；
配制流加营养液：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1.5g/L，肌醇的浓度为0.8g/L，115℃下灭菌15min；
步骤1）大肠杆菌菌株E.coli TRTH为例，以10%的接种量将种子液（OD600值为10.7）接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，溶氧量为20%，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L；直至发酵结束，总发酵时间为48h，即得富含L-色氨酸发酵液。
步骤2）将发酵液加热至100℃，保温3min进行灭菌，然后采用微滤膜过滤除去菌体，收集滤液；所述微滤膜截留分子量为2000Da，微滤温度为30℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar；
步骤3）将步骤2）所得滤液加入0.5%的活性炭，温度45℃，脱色15min，抽滤获得脱色液；
步骤4）将步骤3）所得脱色液通入大孔交换树脂，上柱吸附速率为1.5BV/h。取吸附液进行色氨酸含测定，实验测定后的残余色氨酸含量为1.3g/L，计算得树脂对色氨酸吸附率为97.1%。
步骤5）用清水清洗两次经步骤4）得到的吸附树脂，用体积分数为60%的乙醇溶液对吸附树脂进行洗脱，洗脱速率为1.5BV/h，流出液体积达到脱色液体积的四分之一之后，开始接受洗脱液，接受洗脱液体积为脱色液的三分之二，得到进一步纯化的L-色氨酸洗脱液；测得洗脱液中色氨酸含量19.3g/L，洗脱液透光率为76.4%；
步骤6）将步骤5）获得的洗脱液打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进入低温密闭结晶罐中结晶，收集沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品；所述结晶温度为18℃，pH为6.4，结晶时间12小时；干燥时间20s，温度为进料温度110℃，出料温度70℃。经检测产品纯度为99.8%，产品收率为89.3%。
实施例3
一、氯化胆碱添加量对发酵液中菌体生物量和色氨酸产量的影响。
操作方式参照实施例1，选择氯化胆碱的添加量为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1（g/L）；如图1-2所示，随着氯化胆碱添加量的增加，菌体生物量逐步增加，当当氯化胆碱添加浓度提升至0.4 g/L时，细胞生长情况得到明显改善，细胞快速生长，色氨酸积累速率也得到快递提升，继续增加氯化胆碱的添加量，菌体生物量和色氨酸产量没有明显提升，选择0.4-0.6g/L的添加量较为合适。
二、吲哚和肌醇对发酵液中菌体生物量、色氨酸产量、糖酸转化率以及发酵产酸速率的影响。
设置对照组，其中，对照组1：不添加吲哚和肌醇，其余同实施例1；对照组2：不添加吲哚，其余同实施例1；对照组3：不添加肌醇，其余同实施例1；实验组为实施例1。具体见表1：
表1
组别 实验组 对照组1 对照组2 对照组3
菌体生物量g/L 44.9 41.1 44.7 41.5
色氨酸产量g/L 50.3 38.6 44.8 42.9
糖酸转化率% 22.6 18.7 20.3 19.8
发酵产酸速率g/L·h 1.19 0.92 1.07 1.02
结论：色氨酸合成途径复杂，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累色氨酸时，往往会出现生长问题，本研究通过优化营养因子，逐步改善了细胞代谢途径，色氨酸积累得到提升。在发酵24 h添加吲哚和肌醇，两种组分相互协同，与对照组1相比，菌体生物量有所提高，色氨酸生产速率维持在1.19g/L·h，最终色氨酸产量在50. 3 g/L，较对照组1提高30.3%；综合对照组2和对照组3的实验结果可知，吲哚对菌体生物量影响并不大，对色氨酸的产量有所提高，而肌醇对菌体生物量和色氨酸产量均起到正向调节作用。
本发明还检测了吲哚添加量对色氨酸产量的影响，设置吲哚的添加量分别为0,0.5,1, 1.5, 2, 2.5（g/L），如图2所示，随着吲哚添加量的增加，色氨酸的产量迅速增加，当增大1g/L后，增幅放缓，然后趋于平稳，因此，选择吲哚的浓度为1-1.5g/L。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种生产和提取L-色氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）菌株发酵，步骤2）微滤膜过滤，步骤3）脱色，步骤4）树脂吸附，步骤5）蒸发、结晶和干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）菌株发酵：以10%的接种量将产L-色氨酸大肠杆菌种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0℃，溶氧量为20%，通过流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当发酵至24h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L，直至发酵结束，总发酵时间为42-48h，得到L-色氨酸发酵液；
步骤2）微滤膜过滤：将L-色氨酸发酵液加热至100℃，保温3min进行灭菌，然后采用微滤膜过滤除去菌体，收集滤液；
步骤3）脱色：往步骤2）所得滤液加入活性炭，温度40-50℃，脱色15-30min，抽滤获得脱色液；
步骤4）树脂吸附：将步骤3）所得脱色液通入大孔交换树脂，上柱吸附速率为1-3BV/h；用清水清洗树脂，然后用体积分数为60%的乙醇溶液对树脂进行洗脱，洗脱速率为1-3BV/h，得到L-色氨酸洗脱液；
步骤5）蒸发、结晶和干燥：将步骤4）获得的洗脱液打入四效蒸发器，真空浓缩为原体积的四分之一，所得浓缩液进入低温密闭结晶罐中结晶，收集沉淀，最后对沉淀进行干燥得到L-色氨酸产品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾9g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、硫酸镁1.6g/L、氯化胆碱0.4-0.6g/L、硫酸亚铁65mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述营养液为：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1-1.5g/L，肌醇的浓度为0.5-1g/L，115℃下灭菌15min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氯化胆碱为0.4-0.5g/L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述吲哚的浓度为1g/L，肌醇的浓度为0.5g/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微滤膜截留分子量为2000-10000Da，微滤温度为30-40℃，工作压力：进压为3bar，出压为1bar。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述结晶温度为16-20℃，pH为6.3-6.4，结晶时间10-12小时。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述干燥时间15-30s，温度为：进料温度110-120℃，出料温度60-80℃。
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