CN104788522A - 一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法 - Google Patents

一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，属于生物活性物质提取技术领域，将发酵液加热经膜过滤后获得超滤液，将超滤液pH调节成碱性过炭层析柱吸附，用氨水洗脱，收集洗脱液，将洗脱液调节pH至碱性后，55-60℃抽真空浓缩、抽滤，将滤液pH调节至酸性后流加甲醇结晶，晶体真空干燥后得环磷酸腺苷粗品，将粗品用甲醇重结晶得环磷腺苷成品。本发明所制备的环磷酸腺苷品质稳定，纯度最高可达99%，收率最高可达75%，采用炭层析方法取代传统的离子交换和树脂层析工艺，降低了生产成本，氨水洗脱利于废水处理。

Description

一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵产物提取技术领域，特别涉及一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法。
背景技术
环磷酸腺苷即腺嘌呤核苷3’,5’-环磷酸酯，简称 cAMP，它是一种人体内广泛存在的、具有重要生理活性的物质，在人体中环磷腺苷可由三环磷腺苷经腺苷活化酶催化生成。作为参与调节细胞功能的第二信使物质，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢的作用，对糖、脂肪代谢、核酸蛋白质的合成、调节等起着重要作用。能使心肌收缩力增强， 引起血压升高，心输出量增高。并能舒张平滑肌、扩张冠状动脉血管、改善肝功能、促进神 经再生、抑制皮肤外层上皮细胞分裂及转化异常细胞的功能、促进呼吸链氧化酶的活性及改 善心肌缺氧等。近年来，环磷酸腺苷成为许多疾病，如心血管疾病、类风湿性关节炎和老年痴呆症的治疗目标。
目前，环磷酸腺苷的主要生产方法是化学合成法，存在工艺复杂，原料昂贵且不易获得，副产物多，收率低，成本高，产量小，会导致污染环境，以及不利于工业化生产等缺点。
利用微生物发酵技术生产环磷酸腺苷，成本低、废水易于处理，有利于环境保护，现有微生物生产环磷酸腺苷技术主要是采用离子交换和树脂层析工艺，成本高，用水量大，采用甲酸洗脱，再经NH4OH中和，直接排放既浪费又造成环境污染，采用薄层色谱纯化cAMP，需要将硅胶板上cAMP区带刮下后再行分离出cAMP，不但操作繁琐，而且不适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，该方法从发酵液中提取的环磷酸腺苷纯度高、适合工业化生产，且生产效率高，生产成本低、废水易于处理，有利于环境保护。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的，一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，所述发酵液为节杆菌发酵液，包括以下操作步骤：
1）除菌体：将发酵液加热至60—80℃，过陶瓷膜，收集超滤液；
2）上柱：将获得的超滤液加氨水调节pH至7.05—7.95，过炭层析柱；
3）解析：用氨水进行洗脱解析，得到洗脱液；
4）浓缩：将步骤3）获得的洗脱液加氨水调节pH至7.05—7.95，进行真空浓缩，收集浓缩液；
5）抽滤：将步骤4）所收集的浓缩液，经真空抽滤去除次黄嘌呤，收集滤液；
6）结晶：将步骤5）获得的滤液pH调节至2-3，然后流加1-3倍所述滤液体积的甲醇进行结晶，抽滤后得环磷酸腺苷粗品；
7）重结晶：将步骤6）所获得的环磷酸腺苷粗品用纯化水溶解后，流加1-3倍所述滤液体积的甲醇进行结晶，抽滤真空干燥后得环磷酸腺苷成品。
本发明的进一步技术方案还具有以下特征：
所述陶瓷膜的孔径为0.02--0.05μm。
所述炭层析柱使用的活性炭为果壳型活性炭。
步骤4）所述浓缩为减压浓缩，真空度为 0.075---0.1MPa，浓缩温度为60-70℃，将洗脱液体积浓缩至洗脱液初始体积的1/5—1/8，浓缩液效价在20-30g/L。
所述纯化水为二级反渗透水，电导率＜2.0μS/cm。
步骤7）所述真空干燥，真空度为 0.075---0.1MPa，干燥温度为45--65℃，干燥时间8--10h。
本发明的有益效果：1、本发明采用炭层析方法，取代传统的离子交换和树脂层析工艺，降低了生产成本；2、陶瓷膜过滤，除菌体效果好，产品品质稳定，收率最高可达75%，纯度不低于97.5%；3、本工艺采用氨水洗脱，利于废水处理，有利于环境保护。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
发酵液的制备
本发明所用发酵液为节杆菌发酵液，其中菌种编号为cAMP091015，为本公司菌种室保藏。
本实施例所用培养基具体组成如下：
斜面培养基（g/100ml）：土豆汁10，蛋白胨1.0，硫酸镁0.001，鸟嘌呤0.05，琼脂2.0，pH7.0。
种子培养基（g/100ml）：葡萄糖1.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，牛肉膏1.0，尿素0.6，氯化钠0.2，pH7.0。
发酵培养基（g/100ml）：葡萄糖4.5，磷酸氢二钾1.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，生物素0.005，氯化钴0.001，次黄嘌呤0.006等，pH7.0。
发酵条件如下：
将在1-4℃冰箱保存菌种接种于斜面培养基活化，30℃培养24h。斜面培养基上的菌苔接种于种子培养基，30℃、220rpm培养16h；将培养好的种子以10%的接种量接种于发酵罐。
实施例2
本实施例提供一种从发酵液中提取环磷腺苷的方法，操作步骤如下：
1.采用本实施例1所制备的发酵液1L，发酵液单位4g/L，将发酵液加热到70℃后过孔径为0.02--0.05μm的陶瓷膜，获得超滤液；
2．收集步骤1所制备的超滤液，用氨水调节pH至7.05，过炭层析柱吸附后加氨水进行洗脱解析，获得洗脱液，所述炭层析柱使用的活性炭为果壳型活性炭；
3. 将步骤2所得洗脱液用氨水调节pH至7.05，在真空度0.075-0.1Mpa,浓缩温度50-60℃的条件下浓缩至初始体积的五分之一，向浓缩液加入浓缩液体积1%的针剂活性炭，在60℃脱色处理15min，抽滤后获得第一脱色液；
4.向步骤3所得第一脱色液中加入盐酸调节pH至2，以流加的方式加入等体积的甲醇进行结晶，抽滤后的环磷腺苷粗品；
5.步骤4所得粗品加入3倍体积的纯化水溶解后，再加入粗品重量2%的针剂活性炭，在60℃脱色处理15min，抽滤后得第二脱色液，所述纯化水为二级反渗透水，电导率＜2.0μS/cm；
6.将步骤5所得滤液的体积浓缩至原体积的五分之一，再加入等体积的甲醇结晶，真空干燥得环磷腺苷成品，收率为72%，纯度为97.5%。
实施例3
本实施例提供了一种从发酵液中提取环磷腺苷的方法，操作步骤如下：
1.采用本实施例1所制备的发酵液1L，发酵液单位4g/L，将发酵液加热到70℃后过孔径为0.02--0.05μm的陶瓷膜，获得超滤液；
2．收集步骤1所制备的超滤液，用氨水调节pH至7.5，过炭层析柱吸附后加氨水进行洗脱解析获得洗脱液，所述炭层析柱使用的活性炭为果壳型活性炭；
3. 将步骤2所得洗脱液用氨水调节pH至7.5，在真空度0.075-0.1Mpa,浓缩温度50-60℃的条件下浓缩至初始体积的六分之一，向浓缩液加入浓缩液体积1%的针剂活性炭，在60℃脱色处理15min，抽滤后获得第一脱色液；
4.向步骤3所得第一脱色液中加入盐酸调节pH至2.5，以流加的方式加入2倍体积的甲醇进行结晶，抽滤后的环磷腺苷粗品；
5.步骤4所得粗品加入3倍体积的纯化水溶解后，再加入粗品重量2%的针剂活性炭，在60℃脱色处理15min，抽滤后得第二脱色液，所述纯化水为二级反渗透水，电导率＜2.0μS/cm；
6.将步骤5所得滤液的体积浓缩至原体积的六分之一，再加入2倍体积的甲醇结晶，真空干燥得环磷腺苷成品，收率为75%，纯度为99%。
实施例4
本实施例提供了一种从发酵液中提取环磷腺苷的方法，操作步骤如下：
1.采用本实施例1所制备的发酵液1L，发酵液单位4g/L，将发酵液加热到70℃后过孔径为0.02--0.05μm的陶瓷膜，获得超滤液；
2．收集步骤1所制备的超滤液，用氨水调节pH至7.95，过炭层析柱吸附后加氨水进行洗脱解析获得洗脱液，所述炭层析柱使用的活性炭为果壳型活性炭；
3. 将步骤2所得洗脱液用氨水调节pH至7.95，在真空度0.075-0.1Mpa,浓缩温度50-60℃的条件下浓缩至初始体积的八分之一，向浓缩液加入浓缩液体积1%的针剂活性炭，在60℃脱色处理15min，抽滤后获得第一脱色液；
4.向步骤3所得第一脱色液中加入盐酸调节pH至2.5，以流加的方式加入3倍体积的甲醇进行结晶，抽滤后的环磷腺苷粗品；
5.步骤4所得粗品加入3倍体积的纯化水溶解后，再加入粗品重量2%的针剂活性炭，在60℃脱色处理15min，抽滤后得第二脱色液，所述纯化水为二级反渗透水，电导率＜2.0μS/cm；
6.将步骤5所得滤液的体积浓缩至原体积的八分之一，再加入3倍体积的甲醇结晶，真空干燥得环磷腺苷成品，收率为73%，纯度为98%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (6)

1.一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，所述发酵液为节杆菌发酵液，其特征在于，包括以下操作步骤：
1）除菌体：将发酵液加热至60—80℃，过陶瓷膜，收集超滤液；
2）上柱：将获得的超滤液加氨水调节pH至7.05—7.95，过炭层析柱；
3）解析：用氨水进行洗脱解析，得到洗脱液；
4）浓缩：将步骤3）获得的洗脱液加氨水调节pH至7.05—7.95，进行真空浓缩，收集浓缩液；
5）抽滤：将步骤4）所收集的浓缩液，经真空抽滤去除次黄嘌呤，收集滤液；
6）结晶：将步骤5）获得的滤液pH调节至2-3，然后流加1-3倍所述滤液体积的甲醇进行结晶，抽滤后得环磷酸腺苷粗品；
7）重结晶：将步骤6）所获得的环磷酸腺苷粗品用纯化水溶解后，流加1-3倍所述滤液体积的甲醇进行结晶，抽滤真空干燥后得环磷酸腺苷成品。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为0.02--0.05μm。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述炭层析柱使用的活性炭为果壳型活性炭。
4.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）所述浓缩为减压浓缩，真空度为 0.075---0.1MPa，浓缩温度为60-70℃，将洗脱液体积浓缩至洗脱液初始体积的1/5—1/8，浓缩液效价在20-30g/L。
5.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述纯化水为二级反渗透水，电导率＜2.0μS/cm。
6.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7）所述真空干燥，真空度为 0.075---0.1MPa，干燥温度为45--65℃，干燥时间8--10h。
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