CN108753866B - 一种制备低杂质阿卡波糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种发酵制备低杂质阿卡波糖的方法，在种子培养与发酵培养之间引入驯化培养过程。本发明通过改善发酵工艺，使阿卡波糖在发酵生产过程中的杂质C含量明显下降，从而减轻了后序提纯的压力。通过检测发酵液中阿卡波糖的效价浓度和杂质组分C的浓度，发现发酵液中杂质组分C的含量与在相同条件下未使用本发明工艺的对照组发酵液相比下降，获得了高纯度的阿卡波糖。

Description

一种制备低杂质阿卡波糖的方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，更具体地说是涉及通过发酵方法制备低杂质C的阿卡波糖的方法。

背景技术

继肿瘤、心脑血管病之后糖尿病目前已成为严重威胁人类健康的慢性病之一，糖尿病引起的诸如肾功能障碍、四肢缺血性坏死等并发症，更加重了糖尿病患者的病痛。糖尿病是世界性多发疾病，据世界卫生组织预测，到2025年全世界将会有近3亿人患有糖尿病。我国正处于快速发展时期，经济迅猛发展，极大丰富和提高了人们物质需求和生活水平的同时，也使得作为“富贵病”的糖尿病成为我国严重的公共问题之一：我国糖尿病患者数量位居世界第二，仅次于印度，发病率约为5％，我国人口老龄化问题日益突出，导致糖尿病患者人数激增。糖尿病患者中约95％是Ⅱ型糖尿病，此类糖尿病患者患病的环境诱因多为饮食结构不合理、缺乏运动、劳累等。

临床上可以使用α-葡萄糖苷酶抑制剂治疗Ⅱ型糖尿病，以达到降低血糖的目的。其中游动放线菌的次级代谢物阿卡波糖能够与α-葡萄糖苷酶发生竞争性抑制作用，减少或延缓小肠壁细胞对寡糖、多糖的降解，进而延缓小肠对糖类的吸收、降低血糖含量，在治疗Ⅱ型糖尿病领域取得良好效果，此外阿卡波糖还能调节脂类代谢，降低心血管疾病、脑中风等并发症的风险。阿卡波糖以其良好的治疗效用，获得了患者的认可，并成为我国治疗糖尿病一线用药的选择之一。

但因受阿卡波糖生产菌和生产工艺的限制，在阿卡波糖生产过程中容易产生多种杂质，其中在发酵生产后期由TreY酶和葡糖基转移酶(GTase)催化阿卡波糖而产生的杂质组分C的生成量最大，且其与阿卡波糖的分子结构高度相似，互为同分异构体，增加了分离纯化阿卡波糖的难度和生产成本。因此若能有效抑制或降低阿卡波糖发酵生产过程中杂质组分C的生成量，则能大大方便后序的提纯工艺，提高生产效率，降低生产成本，故降低阿卡波糖发酵生产过程中杂质组分C的生成量成为亟待解决的问题。

杂质组分C是在阿卡波糖发酵生产过程中由阿卡波糖直接转化而来，目前降低阿卡波糖发酵生产过程中杂质组分C的方法主要有：调控发酵生产过程相关参数、利用基因工程技术改造阿卡波糖生产菌、添加某些抑制剂抑制杂质组分C相关酶活性等方法。例如姜玮等人就是通过优化阿卡波糖生产工艺中麦芽糖浓度和渗透压的方法，使得杂质组分C含量基本稳定在0.3％以下(姜玮,生英涛,蔡月明,等.麦芽糖浓度和渗透压对游动放线菌生长及阿卡波糖生物合成的综合影响[J].中国医药工业杂志(2010,41(3):178-182.)，但这种方法生产过程中渗透压波动大，不易控制。中国发明专利(申请号：201610962770.3)是利用代谢工程敲除诱导生成杂质组分C的关键酶——麦芽寡聚糖基海藻糖合成酶编码基因的方法，改造阿卡波糖生产菌株，使获得的工程菌不再生成杂质组分C，但新获得的工程菌生长代谢途径会发生明显改变，需要花大量的时间重建生产工艺，且对阿卡波糖的合成产量有较大影响。但目前尚未有通过改进发酵培养基和发酵工艺降低阿卡波糖发酵过程中杂质组分C生成量的方法。

发明内容

本发明的目的是针对阿卡波糖发酵生产过程中杂质组分C含量较高，在分离层析过程中难以分离、增加纯化难度和生产成本的问题，提供一种降低阿卡波糖发酵生产过程中杂质组分C生成量的方法。

本发明提供了一种发酵制备低杂质阿卡波糖的方法，其特征是在种子培养与发酵培养之间引入驯化培养过程。其中所述的杂质为阿卡波糖杂质组分C。

本发明提供了发酵制备低杂质阿卡波糖的方法，包括以下步骤

1.种子培养

2.驯化培养

3.发酵培养

其中所述的

驯化培养：将罐种子液以驯化罐培养基体积10％(v/v)的接种量移入驯化罐，200～250rpm，28～29℃，培养72～96h，得驯化培养液；其中所述的驯化培养的罐压控制为0.05MPa、通气量为1:1.5(v/v)。

本发明提供的发酵制备低杂质阿卡波糖的方法，其中所述的驯化培养过程所用的培养基与种子培养、发酵培养的培养基均不相同。

本发明提供了驯化培养基，其中含有蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、黄豆饼粉、蛋白胨、硫酸铵、谷氨酸钠、氯化铁、氯化钙、碳酸钙。

与种子培养基和发酵培养基相比，驯化培养的培养基不同之处在于以下方面：

在碳源上，可以保留种子培养基的原有碳源蔗糖，为生产菌提供一个过渡生长环境，在此基础上，增加葡萄糖和麦芽糖作为速效碳源，葡萄糖可快速进入糖酵解途径，为菌体快速提供其生长所需的能量，促进菌体快速生长繁殖，增加菌体浓度；麦芽糖是合成阿卡波糖的有效碳源和前提，在驯化培养过程中加入一定浓度的麦芽糖，作为底物诱导有助于阿卡波糖菌丝提前启动次级代谢合成的相关酶系；

在氮源上，在发酵培养基黄豆饼粉和蛋白胨基础上，增加硫酸铵和谷氨酸钠两种速效氮源，硫酸铵作为速效氮源，可以让种子进入驯化培养基后，快速进入对数生产期，菌量快速增加，谷氨酸钠除作为氮源外，还是合成阿卡波糖的前体物质，为阿卡波糖分子结构中提供氮原子；

在无机盐上，在种子培养基上增加氯化钙和氯化铁两种无机盐，在发酵培养基碳酸钙基础上增加氯化钙无机盐。钙离子是初级代谢、次级代谢合成的酶系的催化剂，铁离子是电子呼吸链中硫铁蛋白的重要原子，能够满足驯化培养过程中菌体生长过程中对溶氧的苛刻需求和驯化。经过驯化培养基驯化培养后，可有效减缓菌丝进入发酵培养后的快速生长，加快菌丝合成阿卡波糖的过渡期。菌丝生产减缓后，菌丝对溶氧的需求有所下降，从而有效改善发酵培养过程中菌丝生产环境，从而能够有效抑制阿卡波糖向其同分异构体转变，故而在增加阿卡波糖发酵效价的基础上更能有效降低发酵过程中杂质组分C的生成量。

本发明的驯化培养的培养基可以优选为：每100ml培养基中，蔗糖0.5g，葡萄糖2g，麦芽糖3g，黄豆饼粉2g，蛋白胨0.2g，硫酸铵0.1g，谷氨酸钠0.5g，氯化铁0.3g，氯化钙0.5g，碳酸钙0.5g，其余为水。

其中，种子培养基、发酵培养基可按照中国专利2016102923585(犹他游动放线菌及其在制备阿卡波糖中的应用)所述配置，更可以按照中国专利2016102923585的实施例7配置，比如种子培养的培养基为：每100ml培养基中，蔗糖2％，甘油1％，玉米浆粉4.8％，碳酸钙0.5％。发酵培养的培养基为：麦芽糖7％，黄豆饼粉2.5％，蛋白胨0.5％，氯化铁0.3％，碳酸钙0.5％。

本发明采用的阿卡波糖生产菌犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)MYIH97，于2016年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection，简称CCTCC，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号：CCTCCNO:M 2016237)。

本发明通过改善发酵工艺，使阿卡波糖在发酵生产过程中的杂质C含量明显下降，从而减轻了后序提纯的压力。通过检测发酵液中阿卡波糖的效价浓度和杂质组分C的浓度含量，发现发酵液中杂质组分C的含量与在相同条件下未使用本发明工艺的对照组发酵液相比下降，获得了高纯度的阿卡波糖。

附图说明

图1，本发明实施例1的阿卡波糖发酵液中杂质组分C含量HPLC检测图

图2，按中国专利2016102923585的实施例7制备得到的工艺发酵生产的阿卡波糖发酵液中杂质组分C含量HPLC检测图

图3，本发明实施例6的阿卡波糖发酵液中杂质组分C含量HPLC检测图

具体实施方式

下面通过列举具体实施方式对本发明进行进一步的阐述，但不能因以下实施方案中涉及的技术参数而限制本发明的内容。

实施例1

参照中国专利2016102923585的实施例7的摇瓶培养、种子培养、发酵培养的培养基及工艺，取种子罐培养好的种子以10％(v/v)的接种量接入1m³驯化罐进行驯化培养，驯化罐的培养基如下：每100ml培养基中，蔗糖0.5g，葡萄糖2g，麦芽糖3g，黄豆饼粉2g，蛋白胨0.2g，硫酸铵0.1g，谷氨酸钠0.5g，氯化铁0.3g，氯化钙0.5g，碳酸钙0.5g，其余为水；培养条件控制如下：搅拌转速控制为200rpm、罐压控制在0.05MPa、通气量控制在1:1.5(v/v)、温度为28℃，培养72小时。后续按发酵罐培养基体积的10％(v/v)接入10m³发酵罐进行发酵培养。

取培养好的驯化培养液，进行镜检和HPLC检测，镜检观察菌液中的菌丝生长状况、检测浓度,驯化培养过程中，菌丝生长速度快，菌丝舒展，呈网状。

阿卡波糖效价为7910ug/ml。

发酵罐的料液经过过滤、酸化、层析等过程纯化处理后进行HPLC检测，测得杂质组分C的含量为0.18％(RRT24.7为杂质C)，见附图1。

按中国专利2016102923585的实施例7制得料液经过过滤、酸化、层析等过程纯化处理后进行HPLC检测，测得杂质组分C的含量为0.46％(RRT23.7为杂质C)，见附图2。

实施例2-7

以下实施例除了驯化培养基、驯化培养条件外，其他均与实施例1相同。

取培养好的驯化培养液进行镜检，观察菌丝生长状况和菌丝形态，然后将驯化培养液接入发酵培养基后，HPLC检测阿卡波糖效价。发酵罐的料液经过过滤、酸化、层析等过程纯化处理后进行HPLC检测，测得杂质组分C的含量见表1。

其中实施例6为相同的驯化培养基在不同的驯化条件下培养，发酵液经过纯化后测得杂质组分C为0.53％(RRT24.7为杂质C)，见附图3。

表：不同驯化培养基和驯化条件对发酵液中阿卡波糖效价和杂质组分C的影响

实施例8

按照中国专利2016102923585的实施例7的摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐的培养基及工艺，进行60m³发酵罐放大。

种子培养、发酵培养之间引入驯化培养具体为：

1.种子培养：

培养基：蔗糖2％，甘油1％，玉米浆粉4.8％，碳酸钙0.5％，泡敌0.2％，pH值7.0，经121℃灭菌30min，灭菌后种子培养基体积约500L。

种子培养方法：1m³种子罐，将培养好的摇瓶种子液以0.2％(v/v)的接种量接入1m³种子罐，在搅拌转速为160rpm，罐压为0.05MPa，通气量为1:1.1(v/v)，温度为28℃的条件下恒温培养48h。

2.驯化培养：

培养基：蔗糖0.5％，葡萄糖2％，麦芽糖3％，黄豆饼粉2％，蛋白胨0.2％，硫酸铵0.1％，谷氨酸钠0.5％，氯化铁0.3％，氯化钙0.5％，碳酸钙0.5％，泡敌0.3％，pH值7.2，经121℃灭菌30min，灭菌后种子培养基体积约5m³。

驯化培养方法：10m³驯化罐，将种子罐的种子液以10％(v/v)的接种量移入10m³发酵罐进行驯化培养，驯化培养条件为搅拌转速控制在200rpm，罐压控制在0.05MPa，通气量控制1:1.5(v/v)，温度控制在28℃的条件下恒温培养72h。

3.发酵培养：

培养基：麦芽糖7％，黄豆饼粉2.5％，蛋白胨0.5％，氯化铁0.3％，碳酸钙0.5％，泡敌0.3％，pH值7.2，经121℃灭菌30min，灭菌后种子培养基体积约35m³。

发酵培养方法：60m³发酵罐将驯化培养液以10％(v/v)的接种量移入发酵罐，搅拌转速控制在150rpm，罐压控制在0.03MPa，通气量控制在1:1.3(v/v)，温度控制在27℃的条件下恒温培养214h。

按照上述的发酵条件和工艺，在60m³发酵罐上进行发酵试验，发酵单位为7550ug/ml。发酵罐的料液经过过滤、酸化、层析等过程纯化处理后进行HPLC检测，测得杂质组分C的含量为0.20％。

Claims (5)

1.一种发酵制备低杂质阿卡波糖的方法，其特征是在种子培养与发酵培养之间引入驯化培养过程，所述的驯化培养过程所用的培养基与种子培养、发酵培养的培养基均不相同；

所述的驯化培养：将罐种子液以驯化罐培养基体积10%（v/v）的接种量移入驯化罐，200～250rpm，28～29℃，培养72～96h，得驯化培养液；

且驯化培养基中含有蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、黄豆饼粉、蛋白胨、硫酸铵、谷氨酸钠、氯化铁、氯化钙、碳酸钙；

所述的驯化培养的罐压控制为0.05MPa、通气量为1:1.5（v/v）；

所述的杂质为阿卡波糖杂质C。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

种子培养：将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1-0.5%（v/v）的接种量接种于种子罐，120-200rpm，26～30℃，培养2-3天，得罐种子液；

发酵培养：将驯化培养液按发酵罐培养基体积的10-15%（v/v）的接种量移入发酵罐，150-200rpm，26～30℃，发酵培养214h，收集发酵液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的驯化培养的培养基为：每100ml培养基中，蔗糖0.5g，葡萄糖2g，麦芽糖3g，黄豆饼粉2g，蛋白胨0.2g，硫酸铵0.1g，谷氨酸钠0.5g，氯化铁0.3g，氯化钙0.5g，碳酸钙0.5g，其余为水。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的种子培养的培养基为：每100ml培养基中，蔗糖2g，甘油1g，玉米浆粉4.8g，碳酸钙0.5g，其余为水。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的发酵培养的培养基为：每100ml培养基中，麦芽糖7g，黄豆饼粉2.5g，蛋白胨0.5g，氯化铁0.3g，碳酸钙0.5g，其余为水。

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