CN110604749B

CN110604749B - 动物双歧杆菌a12及其在控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖中的应用

Info

Publication number: CN110604749B
Application number: CN201910818555.XA
Authority: CN
Inventors: 金君华; 李桐; 杨建珺; 张红星; 谢远红; 刘慧�
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing Beinong Hongze Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: NL2026360A; NL2026360B1; CN110604749A

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株动物双歧杆菌及其在控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖中的应用。所述动物双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.17308。本发明还公开了一种产品组合物，该产品组合物含有所述动物双歧杆菌的菌体物质和/或代谢产物。本发明提供的动物双歧杆菌适合中国人特定生理体质，并且在抑制α‑葡萄糖苷酶活性、抑制葡萄糖转运、提高机体糖耐量水平、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗、用于提高胰高血糖素样肽‑1分泌水平或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量等方面具有较强的优势，从而能够更好的控制糖尿病或高血脂症的发展，特别是控制机体的体重增加和肥胖。

Description

动物双歧杆菌A12及其在控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株动物双歧杆菌A12及其在控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖中的应用。

背景技术

随着经济的发展，人民生活水平的提高，摄入高热量及结构不合理的膳食(高脂肪，高蛋白，低碳水化合物)导致的肥胖，胰岛素抵抗和糖耐量受损等症状引起了人们的关注和研究，并且长期的不良饮食习惯最终会导致糖尿病的产生。近年来，糖尿病在全世界广泛流行，已成为继肿瘤、心血管疾病之后第三位严重危害人类健康的慢性疾病，而我国仅次于印度，为全球糖尿病患者人数第二大国，所以发展改善血糖水平的相关预防措施的应用刻不容缓。

从功能食品角度出发，益生菌已被证实具有一定的改善作用，但是目前的应用几乎很少，关于其作用机理并未阐述明确，而且许多功能性益生菌的菌株，发酵剂以及关键技术被国外垄断。还有研究显示，外来益生菌不一定非常适合中国人的生理特征和体质。所以，研究适合中国人特定生理体质的益生菌成为一个重要的内容。

发明内容

本发明的目的是为了从益生菌的角度出发，提供一种适合中国人特定生理体质的具有控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖功效的动物双歧杆菌及其应用。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)在制备用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的产品、抑制葡萄糖转运的产品、提高机体糖耐量水平的产品、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗的产品、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平的产品或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的产品中的应用。

第二方面，本发明提供了一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，所述动物双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.17308。

第三方面，本发明提供了一种产品组合物，该产品组合物含有如上所述的动物双歧杆菌的菌体物质和/或代谢产物。

第四方面，本发明提供了如上所述的动物双歧杆菌或如上所述的产品组合物在制备用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的产品、抑制葡萄糖转运的产品、提高机体糖耐量水平的产品、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗的产品、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平的产品或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的产品中的应用。

第五方面，本发明提供了如上所述的动物双歧杆菌或如上所述的产品组合物在制备用于预防和/或治疗糖尿病或高血脂症的产品中的应用。

本发明可取得如下的有益效果：

1)本发明提出了动物双歧杆菌在抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制葡萄糖转运、提高机体糖耐量水平、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量等方面的应用；

2)本发明提供了一株具体的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，保藏编号为CGMCC No.17308，其在抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制葡萄糖转运、提高机体糖耐量水平、缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗、提高胰高血糖素样肽-1分泌水平或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量等方面表现尤为突出；

3)本发明提供的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CGMCC No.17308具有预防和/或治疗糖尿病或高血脂症的功效，特别是在控制机体的体重增加和肥胖方面；

4)本发明的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CGMCC No.17308分离自中国母乳喂养的婴儿粪便，适合中国人特定生理体质，对于扩大具有我国自主知识产权的益生菌菌库，增强发酵食品的功能性具有重要的意义。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

动物双歧杆菌

本发明的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，于2019年3月6日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17308，简称A12。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

图1为Caco-2细胞在培养过程中的跨膜电阻值(TEER)的变化曲线；

图2为Caco-2细胞培养第21天的倒置显微镜(A：×100)和扫描电镜(B：×7,000；C：×10,000)图；

图3为transwell模型中各组处理对葡萄糖转运能力的影响；

图4A为各菌株模拟胃液的耐受性评价；

图4B为各菌株模拟肠液的耐受性评价；

图5A为各组处理的小鼠体重随时间的变化图；

图5B为各组处理的小鼠血清胰岛素水平；

图5C为各组处理的小鼠血清瘦素水平；

图6为各组处理的小鼠胰腺组织免疫荧光染色图，细胞核(蓝色)，胰岛素(绿色)，胰高血糖素(红色)；

图7为各组处理的小鼠胰岛组织中β细胞与α细胞的比值；

图8为各组处理的小鼠灌胃葡萄糖溶液后血糖值随时间的变化图；

图9为各组处理的小鼠灌灌胃葡萄糖溶液120min内葡萄糖耐量峰曲线下面积图；

图10为各组处理的小鼠血清GLP-1含量；

图11各组处理的小鼠中小肠中S-1，SGLT-1，GLUT-2，GCG和PC3的相对转录水平。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物，通过竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使碳水化合物分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收和转运，降低餐后高血糖，提高糖耐量水平，本发明的发明人在研究中发现，动物双歧杆菌可以作为α-葡萄糖苷酶抑制剂使用。

肠道中的L细胞能够分泌胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，其可以促进胰岛β细胞产生胰岛素，抑制胰岛α细胞产生胰高血糖素，进而调节机体的血糖平衡，提高糖耐量水平。本发明的发明人发现，动物双歧杆菌具有提高胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的分泌。

此外，本发明的发明人在研究中还发现，双歧杆菌还具有增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的作用，以及缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗作用，从而进一步提高糖耐量水平。

基于如上的发现，第一方面，本发明提供了动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)在制备用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的产品、抑制葡萄糖转运的产品、提高机体糖耐量水平的产品、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗的产品、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平的产品或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的产品中的应用。

本发明的发明人在研究的过程中进一步发现，动物双歧杆菌的菌体物质或其代谢产物均具有如上的作用。因此，在如上应用的过程中，可以使用双歧杆菌的菌体物质和/或其代谢产物。

其中，所述菌体物质可以为动物双歧杆菌的活菌体。

第二方面，本发明提供了一种动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，其中，所述动物双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.17308。

本发明的动物双歧杆菌从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到。

本发明提供的动物双歧杆菌经过液体培养能够产生大量动物双歧杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述动物双歧杆菌增殖即可，例如可以按照10⁷CFU/mL的接种量将所述动物双歧杆菌的活菌体接种于乳杆菌培养基中，并且在厌氧或好氧的条件下，在15-38℃的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述乳杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合乳杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌——生物学基础及应用》(杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版)中所述的乳酸菌(MRS)培养基。

本发明的发明人发现，本发明提供的双歧杆菌A12在改良的MRS液体培养基中具有更佳的生长优势，且由此培养的菌体物质或代谢产物在如上的效果上更佳，所述改良的MRS液体培养基的配方为K₂PO₄ 1-3g/L、无水乙酸钠4-6g/L、麦芽浸粉4-6g/L、硫酸镁0.4-0.6g/L、牛肉膏8-12g/L、柠檬酸铵1-3g/L、麦芽糖15-25g/L、大豆蛋白胨4-6g/L、一水合硫酸锰0.2-0.3g/L、吐温-80 0.5-1.5ml/L、半胱氨酸盐酸盐0.4-0.6g/L、菊粉4-6g/L。

本发明可以进一步分离上述培养液中的动物双歧杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

本发明的发明人在研究的过程中发现，本发明提供的动物双歧杆菌CGMCCNo.17308的活菌体、以及其代谢产物均可制备成产品组合物，从而实现抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制葡萄糖转运、提高机体糖耐量水平、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的作用，进而实现预防和/或治疗糖尿病和/或高血脂症的作用。

因此，所述产品组合物可以含有动物双歧杆菌CGMCC No.17308的活菌体，可以含有动物双歧杆菌CGMCC No.17308的代谢产物，可以含有动物双歧杆菌CGMCC No.17308的活菌体和代谢产物。

公知的，菌体的代谢产物一般存在于菌体的培养液中，因此，可以通过将菌体的培养液进行固液分离，获得清液的方式来获得代谢产物。其中，所述菌体的培养液可以通过在厌氧条件下，在35-37℃的温度下将本发明的动物双歧杆菌CGMCC No.17308培养12-72小时后获得。其中，所述固液分离的方法，例如，可以为离心和/或过滤。

根据本发明，尽管将菌体物质添加到产品基质中，即可实现本发明的目的，但优选情况下，当所述产品组合物含有所述动物双歧杆菌的代谢产物时，相对于100重量份的产品组合物，所述动物双歧杆菌的代谢产物的含量为10-70重量份，优选为30-50重量份；当所述产品组合物含有动物双歧杆菌的菌体物质时，相对于每克所述产品组合物，所述动物双歧杆菌的菌体物质的含量为10⁵-10¹⁰CFU，优选为10⁷-10⁹CFU。在上述优选情况下，所述产品组合物的防治高血脂症的作用更显著。其中，所述代谢产物的含量以培养液固液分离后的清液计。

其中，CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表示活菌的数量。可以将培养后的培养液稀释至合适的水平并涂布平板培养后获得。

根据本发明，所述产品组合物可以为食品组合物，所述食品组合物还含有食物作为产品基质，所述食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。食物也可以根据食用对象的不同而有所不同。所述食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。

此外，符合上述要求的食品组合物可以包括动物双歧杆菌的培养液(例如经该动物双歧杆菌发酵制得的发酵乳制品)、分离的动物双歧杆菌的活菌体等。

根据本发明中，所述产物组合物可以为药物组合物，所述药物组合物可以制备成任意的类型，例如片剂、乳剂、胶囊剂、栓剂等，也可以根据用药对象的不同而有所不同。所述药物组合物中还可以含有药学上可接受的辅剂作为产品基质，例如赋形剂、润滑剂、调味剂、稳定剂、增稠剂、防腐剂等，可以根据具体的剂型进行选择，此为本领域技术人员所公知。

根据本发明，可以通过将如上所述的动物双歧杆菌的菌体物质和/或代谢产物添加到产品基质中，来制备所述产品组合物。

根据本发明，将所述菌体物质和/或代谢产物添加到产品基质中的方法没有特别的限制，例如，可以直接将所述菌体物质和/或代谢产物与所述产品基质按照预定的比例进行混合，然后再制备成相应的产品。

第四方面，本发明提供了动物双歧杆菌CGMCC No.17308或如上所述的产品组合物在制备用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的产品、抑制葡萄糖转运的产品、提高机体糖耐量水平的产品、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗的产品、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平的产品或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的产品中的应用。

本发明的发明人，相比于其他的动物双歧杆菌，本发明提供的动物双歧杆菌CGMCCNo.17308在实现如上方面上的效果更为突出。

根据本发明，所述高血脂症为动脉粥样硬化、冠心病、非酒精性脂肪肝、肥胖、高血脂、体重增加或肥胖。

以下的制备例、实施例和对比例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

在下述制备例、实施例和对比例中：

实验菌株：本发明的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，于2019年3月6日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.17308，简称A12。

参比菌株：动物双歧杆菌BB12(Bifidobacterium animalis BB12)，简称BB12。

改良的MRS液体培养基配方：(K₂PO₄ 2g/L、无水乙酸钠5g/L、麦芽浸粉5g/L、硫酸镁0.5g/L、牛肉膏10g/L、柠檬酸铵2g/L、麦芽糖20g/L、大豆蛋白胨5g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、吐温-80 1ml/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、菊粉5g/L，蒸馏水补齐1000mL(固体培养基加15g琼脂)，pH6.5，121℃灭菌15min后备用，以上试剂均购自科百奥生物技术公司；

Caco-2细胞(human colon carcinoma cell lines)，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0050，来源于人的结肠腺癌细胞，在Transwell小室中，Caco-2细胞可以形成致密的单细胞层组织，分化出与小肠细胞类似的细胞绒毛面(apical，相当于肠腔一侧)和基底面(basolateral，相当于肠内壁一侧)，并可以分化出各种酶类，包括α-葡萄糖苷酶。Caco-2细胞构建的Transwell模型已被广泛应用于生化、毒理及营养素的摄取和转运研究等方面。

制备例

菌液制备

1、将已活化2代的动物双歧杆菌A12接种到改良MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，培养结束后将培养体系8,000g，4℃离心10min收集上清液，上清液经0.22μm滤膜过滤，调pH至6.5，得到发酵上清液。

2、将已活化2代的动物双歧杆菌A12和动物双歧杆菌BB12接种到改良MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，培养结束后将培养体系8,000g，4℃离心10min收集菌体。无菌PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，重悬于PBS溶液中，调整细胞数为10⁹/mL，获得A12和BB12活菌悬液。

实施例1

本实施例用于说明Transwell细胞模型的建立和动物双歧杆菌A12发酵上清液对葡萄糖转运的抑制作用

1、将Caco-2细胞接种于12孔Transwell小室上(膜孔径0.4μm，生长面积1.12cm²)，转运槽肠腔侧(上室，AP侧)加入2×10⁵个细胞/mL的悬液500μL，基底侧(下室，BL侧)加入1.5mL细胞培养液，每天换液1次。当细胞生长分化长达21天，跨膜电阻值(TEER)超过500Ω·cm²时，认为细胞融合完成，Transwell细胞模型可用于转运实验。

结果如图1所示。TEER在前11天迅速增加，在第12天达到最大值(1300±110.82Ω·cm²)，表明Caco-2细胞已形成致密的单层结构。细胞接种后12-21天，TEER小幅增加，此后细胞数量趋于稳定，说明细胞停止增殖并开始分化。用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞第21天的紧密连接结构和微绒毛结构(图2)，可观察到Caco-2单层细胞(图2A光学倒置显微镜细胞形态(×100)，2B扫描电镜(×7,000))和分化的Caco-2单层顶端微绒毛(图2C扫描电镜(×10,000))。

2、用PBS冲洗Transwell小室2次去除葡萄糖。加入475μL浓度为20mmol/L的麦芽糖(过滤除菌)作为底物，和如上制备的动物双歧杆菌A12发酵上清液(CFS-A12组)或作为阴性对照的改良MRS液体空白培养基(空白对照组)各25μL(底物和样品共0.5mL)一起到粘膜层，然后将1.5mL PBS加入到下层，37℃培养2h，检测上下室葡萄糖的含量，以此分别按照如下的计算公式计算对葡萄糖转运的抑制率(％)。

抑制率(％)＝[1-(A/B)]×100

其中，A＝下室(实验组)/[上室(实验组)+下室(实验组)],B＝下室(空白组)/[上室(实验组)+下室(空白组)]。

经计算，动物双歧杆菌A12的葡萄糖转运抑制率为25.93±0.003％，动物双歧杆菌BB12对葡萄糖的转运无抑制作用。由此可知，动物双歧杆菌A12的上清液表现出优良的抑制活性和潜在抗糖尿病的能力。

结果如图3所示。在Transwell上下室中，动物双歧杆菌A12葡萄糖浓度均显著高于空白对照组(0.611±0.002,0.140±0.001；0.091±0.002,0.141±0.004，p<0.01)。

实施例2

本实施例用于说明动物双歧杆菌的体外α-葡萄糖苷酶和模拟消化道效果

1)细胞内容物的制备

将菌株(A12和BB12)以2体积％的接种量接种于改良MRS肉汤中，37℃厌氧培养12h，并传至三代备用。将活化好的菌液，6 000×g，4℃离心10min，收集上清液，调pH6.0，经0.22μm滤膜过滤所得滤液即为发酵上清液；菌体沉淀用无菌PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3次，重悬于PBS溶液中，调整细菌的浓度约为1×10⁹CFU/mL，并用beadbeater破碎30s后，12 000×g离心10min，收集上清即为细胞内容物。

2)α-葡萄糖苷酶的测定

在96孔板210μL的反应体系中，依次加入50μL浓度为0.1mol/L的PBS溶液(pH6.8)、50μL浓度为20mmol/L的PNPG溶液(α-葡萄糖苷酶的底物)和30μL样品溶液(A12细胞内容物或BB12细胞内容物)或30μL PBS溶液(0.1mol/L，pH6.8)作为空白对照，37℃孵育10min。然后加入30μL浓度为0.4U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液或等体积的PBS溶液(0.1mol/L，pH6.8)作为空白对照，37℃继续反应30min，最后加入50μL浓度为1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应。反应完成后，于酶标仪405nm处测定吸光值，每组设定3个平行，并按如下公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率(％)。

α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％

公式中：A为样品组，含有样品溶液和α-葡萄糖苷酶溶液；

B为样品空白组，含有样品溶液，不含α-葡萄糖苷酶溶液(含与α-葡萄糖苷酶溶液等体积的PBS溶液)；

C为对照组，不含样品溶液(含与样品溶液等体积的PBS溶液)，含α-葡萄糖苷酶溶液；

D为空白组，不含样品溶液(含与样品溶液等体积的PBS溶液)，不含α-葡萄糖苷酶溶液(含与α-葡萄糖苷酶溶液等体积的PBS溶液)。

其中，A12细胞内容物α-葡萄糖苷酶抑制率为18.57±1.90，而BB12细胞内容物不具备α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

3)模拟胃肠道的耐受性评价

将菌株(A12和BB12)以2体积％接种量接入pH为3的人工胃液(胃蛋白酶1:10,000,Sigma,USA，终浓度3g/L)和pH为6.98的人工肠液(胰蛋白酶1:250,Sigma,USA，终浓度1g/L)中，37℃培养。取培养时间为0h、1h、2h、3h、4h进行梯度稀释，选取合适的梯度进行平板计数，每组三个平行，其中，人工胃液中的耐受性如图4A所示，人工肠液中的耐受性如图4B所示。

由图4A和4B可以看出，相比于BB12，A12表现出了良好的胃肠道耐受性。

实施例3

本实施例用于说明双歧杆菌对肥胖小鼠体重的影响

实验小鼠：60只健康3-5周龄雄性C57BL/6J小鼠。小鼠在实验标准笼中喂养(每笼3只)，可自由进食水和食物。动物实验房温度保持在22℃-25℃，湿度维持在40％-60％，严格遵循12h光照/12h黑暗循环。在研究开始前，给小鼠饲喂基础饲料7天以适应新环境。

将实验小鼠随机分成4组(每组n＝15)，如下：

(1)LFD组(饲喂基础饲料+PBS 0.2mL)；

(2)HFD组(饲喂高脂饲料+PBS 0.2mL)；

(3)CFS-A12组(饲喂高脂饲料和动物双歧杆菌A12发酵上清液0.2mL)；

(4)A12活菌组(饲喂高脂饲料和动物双歧杆菌A12活菌(10⁹CFU/ml)0.2mL)。

喂养10周。使用数字秤测量大鼠的每周体重及其每日食物摄入量。

结果如图5A所示，可以看出，进食高脂饲料而导致小鼠不良病症的发展，主要表现为体重增加。在第10周，LFD组和CFS-A12组体重显著减少(LFD：25.40±1.42，CFS-A12：26.35±1.31；HFD：29.85±1.01，p<0.05)，可知，CFS-A12组则显著缓解了由进食高脂饲料而引发不良病症，主要表现为体重减少(p<0.05)。而A12活菌组在前期(0-7天)对于体重的减少基本没有效果，但在第10周，也表现出了良好的体重减少效果(27.61±1.53)。

实施例4

本实施例用于说明动物双歧杆菌对肥胖小鼠胰岛素和瘦素抵抗的缓解效果

实验小鼠：75只健康3-5周龄雄性C57BL/6J小鼠。小鼠在实验标准笼中喂养(每笼3只)，可自由进食水和食物。动物实验房温度保持在22℃-25℃，湿度维持在40％-60％，严格遵循12h光照/12h黑暗循环。在研究开始前，给小鼠饲喂基础饲料7天以适应新环境。

将实验小鼠随机分成5组(每组n＝15)，如下：

(1)LFD组(饲喂基础饲料+PBS 0.2mL)；

(2)HFD组(饲喂高脂饲料+PBS 0.2mL)；

(4)A12活菌组(饲喂高脂饲料和动物双歧杆菌A12活菌(10⁹CFU/ml)0.2mL)；

(5)BB12活菌组(饲喂高脂饲料和动物双歧杆菌A12活菌(10⁹CFU/ml)0.2mL)；

喂养10周，然后所有小鼠禁食不禁水12h，按2.5g/kg体重灌胃葡萄糖溶液，2h后将小鼠处死，取新鲜血液样品室温静置30min，在4℃下3000g离心5min，并将血清储存在-80℃直至测定。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量血清胰岛素和瘦素水平。

结果如图5B和图5C所示。与LFD组相比，进食高脂饲料而导致不良病症的发展，主要表现为胰岛素和瘦素水平升高，产生了胰岛素和瘦素抵抗。而与HFD组相比，其他组血清胰岛素水平显著降低，相比于BB12活菌组，A12活菌组和CFS-A12组效果更佳。这些结果表明，通过每日进食动物双歧杆菌A12可有效改善葡萄糖耐受不良小鼠的代谢紊乱，缓解了胰岛素和瘦素抵抗。

实施例5

本实施例用于说明动物双歧杆菌对肥胖小鼠胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的影响

将实验小鼠随机分成4组(每组n＝15)，如下：

(1)LFD组(饲喂基础饲料+PBS 0.2mL)；

(2)HFD组(饲喂高脂饲料+PBS 0.2mL)；

(3)A12活菌组(饲喂高脂饲料和动物双歧杆菌A12活菌(10⁹CFU/ml)0.2mL)；

(4)BB12活菌组(饲喂高脂饲料和动物双歧杆菌A12活菌(10⁹CFU/ml)0.2mL)；

喂养10周，然后所有小鼠禁食不禁水12h，按2.5g/kg体重灌胃葡萄糖溶液，2h后将小鼠处死，取新鲜胰腺组织，将胰腺切片(每组n＝3)用针对于胰岛素和胰高血糖素的抗体进行免疫染色，细胞核用DAPI标记。自动图像采集使用FITC(536/40)、Texas Red(624/40)和DAPI(447/60)的发射滤光片捕获整个胰腺切片，使用荧光显微镜观察获得图像，如图6所示(细胞核蓝色，胰岛素绿色，可反映胰岛β细胞的数量，胰高血糖素红色，可反映胰岛α细胞的数量)，β细胞与α细胞的比值如图7所示。

如结果所示，A12活菌和BB12活菌具有增大胰岛β细胞的作用。此外，HFD组与LFD组相比，胰岛β细胞与α细胞的比例显着降低(HFD：1.01±0.85，LFD：2.74±0.57，p<0.05)。与HFD组相比，A12活菌组和BB12活菌组中β细胞与α细胞的比例较高(A12活菌组：3.65±0.94，BB12活菌组：2.33±0.83，p>0.05)。结果表明，动物双歧杆菌A12可以保护胰岛，增加胰岛β细胞的数量。

实施例6

本实施例用于说明动物双歧杆菌对肥胖小鼠对糖耐量水平的影响

将实验小鼠随机分成4组(每组n＝15)，如下：

(1)LFD组(饲喂基础饲料+PBS 0.2mL)；

(2)HFD组(饲喂高脂饲料+PBS 0.2mL)；

喂养10周，然后所有小鼠禁食不禁水12h，按2.5g/kg体重灌胃葡萄糖溶液，并用血糖仪测定第0min，30min，60min和120min鼠尾静脉血糖值(如图8所示)。绘制血糖变化曲线，并计算葡萄糖耐量曲线下面积(Area Under Curve,AUC)(如图9所示)。

结果显示，在灌胃葡萄糖后的30min内，各组小鼠血糖均呈上升趋势，正常组小鼠表现出正常的耐糖现象，正常组小鼠的血糖在30min内上升幅度平缓，30min后逐渐降低，2h后回到空腹水平。HFD组的AUC显著高于LFD组、CFS-A12组和A12活菌组(P＜0.05)，说明仅喂食高脂饲料会使小鼠AUC水平升高，表明造模成功。而CFS-A12组和A12活菌组显著缓解了此种病症，说明动物双歧杆菌A12有效改善血糖升高，提高了糖耐量水平，主要表现为AUC水平降低。

实施例7

本实施例用于说明动物双歧杆菌对肥胖小鼠GLP-1分泌量的影响

将实施例6制备的血清样品取出，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测GLP-1的分泌，从而进一步探究动物双歧杆菌A12是否调节GLP-1分泌。

结果如图10所示，同LFD和HFD组相比，CFS-A12组，A12活菌组小鼠的GLP-1水平显著升高。而LFD和HFD组小鼠的GLP-1水平无显著变化。结果表明，动物双歧杆菌A12可通过增加GLP-1的分泌发挥降糖作用。

实施例8

本实施例用于说明动物双歧杆菌对肥胖小鼠葡萄糖苷酶的表达和的合成的影响

完成实施例6后，通过RT-PCR分析各试验组的S-1(α-葡萄糖苷酶)，SGLT-1(钠葡萄糖共转运载体l)，GLUT-2(葡萄糖协助扩散转运载体2)，GCG(胰高血糖素原)和PC3(激素原转化酶3)的相对转录水平。根据说明，使用Trizol(Ambion，USA)从胰腺组织中提取总RNA。在NanoDrop Lite(Thermo Scienti fi c，USA)上测定各个样品的浓度和纯度。使用PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，Japan)通过逆转录获得cDNA。引物序列如表1所示。循环条件为95℃，5min；95℃，10s，58℃，30s和72℃，30s，循环40次。以β-actin作为对照(内参基因)，根据2-^ΔΔCt方法计算mRNA倍数。结果如图11所示。

表1

由图11A可知，CFS组显著降低了小鼠小肠中的S-1mRNA的表达(p<0.05)，表明，动物双歧杆菌A12的发酵上清液可以降低小鼠小肠中α-葡萄糖苷酶的表达，而从阻断了碳水化合物分解为葡萄糖，减少了小肠吸收葡萄糖的含量。由图11B，图11C可知，与HFD组相比，A12活菌组显著降低了与葡萄糖吸收和转运相关基因(SGLT-1和GLUT-2)的表达(p<0.05)，表明动物双歧杆菌A12活菌是通过阻断葡萄糖的吸收与转运，从而发挥的降糖效果。由图11D、图11E所示，与HFD组相比，其他所有组的GCG mRNA水平均显著升高(p<0.05)，而在PC3mRNA水平上，CFS-A12组和A12活菌组与HFD组相比均无显著变化。结果表明，动物双歧A12可以刺激GLP-1的合成，从而发挥降糖效果。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京农学院

<120> 动物双歧杆菌及其在控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖中的应用

<130> 快I59083NXY

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> β-actin正向引物

<400> 1

tgagagggaa atcgtgcgtg ac 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> β-actin反向引物

<400> 2

gctcgttgcc aatagtgatg acc 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> S-I正向引物

<400> 3

gccgctgatt gggaaggtt 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> S-I反向引物

<400> 4

gcctctaacg aagttggacg gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> SGLT-1正向引物

<400> 5

gtttgcctat ggaactggga gc 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> SGLT-1反向引物

<400> 6

gtctggaatg ggcttggtga g 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> GLUT-2正向引物

<400> 7

tgccatcttc ctctttgtca gttt 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> GLUT-2反向引物

<400> 8

gaagcagagg gcgatgacaa 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> GCG正向引物

<400> 9

gcttataatg ctggtgcaag g 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> GCG反向引物

<400> 10

ctgggaagct gggaatgat 19

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> PC3正向引物

<400> 11

tggagttgca tataattcca aagtt 25

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> PC3反向引物

<400> 12

agcctcaatg gcatcagtta c 21

Claims

1.一株动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis），其特征在于，所述动物双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No. 17308。

2.一种产品组合物，其特征在于，该产品组合物含有权利要求1所述的动物双歧杆菌的菌体物质和/或代谢产物；

其中，所述代谢产物以所述双歧杆菌的菌体培养液的形式提供。

3.根据权利要求2所述的产品组合物，其中，所述代谢产物以所述双歧杆菌的活菌悬液或发酵上清液的形式提供。

4.根据权利要求2或3所述的产品组合物，其中，当所述产品组合物含有所述动物双歧杆菌的代谢产物时，相对于100重量份的产品组合物，所述动物双歧杆菌的代谢产物的含量为10-70重量份；

当所述产品组合物含有动物双歧杆菌的菌体物质时，相对于每克所述产品组合物，所述动物双歧杆菌的菌体物质的含量为10⁵-10¹⁰CFU。

5.根据权利要求4所述的产品组合物，其中，当所述产品组合物含有所述动物双歧杆菌的代谢产物时，相对于100重量份的产品组合物，所述动物双歧杆菌的代谢产物的含量为30-50重量份；

当所述产品组合物含有动物双歧杆菌的菌体物质时，相对于每克所述产品组合物，所述动物双歧杆菌的菌体物质的含量为10⁷-10⁹CFU。

6.根据权利要求2所述的产品组合物，其中，所述动物双歧杆菌的菌体物质为动物双歧杆菌的活菌体。

7.根据权利要求2所述的产品组合物，其中，所述产品组合物为药物组合物，所述药物组合物还含有药学上可接受的辅剂。

8.权利要求1所述的动物双歧杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的产品组合物在制备用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的产品、抑制葡萄糖转运的产品、提高机体糖耐量水平的产品、用于缓解胰岛素抵抗和瘦素抵抗的产品、用于提高胰高血糖素样肽-1分泌水平的产品或增加胰岛细胞大小和胰岛β细胞数量的产品中的应用。

9.权利要求1所述的动物双歧杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的产品组合物在制备用于预防和/或治疗糖尿病的产品中的应用。

10.权利要求1所述的动物双歧杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的产品组合物在制备用于预防和/或治疗体重增加或肥胖的产品中的应用。