CN112961808A - 一种降脂减肥的乳双岐杆菌制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降脂减肥的乳双岐杆菌制剂及其制备方法，本发明所述的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)为乳双歧杆菌Miuyo‑11菌株，保藏编号为CGMCC 20867。本发明乳双歧杆菌制剂中活菌数量大且活性高，同时含有乳双歧杆菌所产生的具有降脂减肥作用的代谢产物，可作为肥胖病人的辅助调理用品，协助其它降脂减肥药物发挥优异的降脂减肥的作用。

Description

一种降脂减肥的乳双岐杆菌制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于益生菌生产技术领域，具体涉及一种降脂减肥的乳双岐杆菌制剂及其制备方法。
背景技术
肥胖是指身体的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪组织积蓄过剩的状态。造成肥胖的原因主要有：过量摄入高热量的食物、运动过少等。当身体的能量摄入超过能量消耗时，造成身体能量过剩而促进了脂肪的累积，就形成了肥胖；此外，疾病、环境、心理、身体毒素偏多等因素造成身体营养失衡、能量代谢失调等，也会形成肥胖。
肥胖不仅影响形体美，而且会引发多种疾病，如：高血压、冠心病、心绞痛、脑血管疾病、糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、女性月经不调等，还能增加人们患恶性肿瘤的机率，影响消化系统的功能和内分泌系统的功能。
人体脂肪的来源主要有两个：一个是直接摄入食物中的脂肪；另一个是利用过量的糖分在体内转化为脂肪。食物中的脂肪在小肠中经各种酶及胆汁酸盐的作用，被分解成脂肪酸、胆固醇和其它脂肪消化产物后，通过小肠壁被吸收进血流，从而使脂肪被人体消化吸收，在人体内有可能被重新合成脂肪；另一方面,当人体摄入的糖分过量时，糖分(如葡萄糖等)也能通过三羧酸循环系统转化为脂肪。
益生菌在肠道定殖后，在其生长繁殖的过程中,会利用肠道中的脂类(如甘油三酯、胆固醇等)、小分子糖类(如葡萄糖)、氨基酸类或小肽等物质来合成菌体成分，参与营养物质的消化、吸收、代谢功能，充分发挥降低体内脂肪、降低胆固醇的功效，从而降低身体脂肪率，降低体重，降低食物利用率，促进新陈代谢，改善肥胖体质等。多项研究显示：益生菌能通过减少脂肪的合成以及分解多余的油脂，使人体的脂肪不会过度蓄积。益生菌能有效地调节肥胖患者的体质,其作用机理为：
①抑制食欲，增加饱腹感
益生菌及其代谢产物可以通过刺激胆囊收缩素(CCK)、胰高血糖素样肽 -1(GLP-1)等饱腹因子的释放、减少胃促生长激素的分泌，从而减少食物摄入，降低体重和脂肪的蓄积。有研究表明：短链脂肪酸(比如乙酸、丁酸、丙酸) 可以为肠道上皮细胞提供生长所需要的能量，不仅可以促进肠道蠕动、减轻肠道炎症，也可以调节食欲中枢，增加饱腹感。
②降低胆固醇、降低脂肪
益生菌在生长过程中可同化吸收胆固醇，并可通过产生胆盐水解酶等代谢产物，促进胆固醇与胆酸的沉淀，减少了胆固醇进入血液的机会，干扰肠道对胆固醇的吸收。益生菌及其代谢产物还可产生柠檬酸裂解酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等物质，从而影响脂肪代谢和碳水化合物代谢，起到降脂减肥的作用。
③调节肠道菌群
益生菌可通过在肠道内释放消化酶，对消化过程起协同作用，并减缓部分肠道吸收不良的症状。且当益生菌进入肠道后，可通过菌群占位、细菌增殖、杀除有害菌等方式促进失衡的肠道菌群相正常化，恢复肠道的正常功能。
④益生菌能产生重要的营养物质
益生菌能产生重要的营养物质，如：泛酸、尼克酸、B1、B2、B6及维生素K 等维生素，同时能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等。这些代谢产物能加速脂肪燃烧分解转化，同时提高人体新陈代谢，以此达到快速瘦身的目的。
可见，益生菌及其代谢产物在肠道内参与人体的糖-脂代谢、胆固醇-脂肪代谢，阻断脂肪的形成及加速体内蓄积脂肪的氧化分解，发挥长效减肥的作用。
乳双歧杆菌，也被称为动物双歧杆菌，是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一，革兰氏阳性，多形态杆菌，呈Y字形、V字形、弯曲状或刮勺状，其典型的形态特征是有分叉的杆菌。乳双歧杆菌(或动物双歧杆菌)不形成芽孢，无运动性，专性厌氧；最适发酵温度为35～40℃，最适生长pH值为6.7～7.0。主要分布于人体肠道中，部分暖血动物如猪、狗、老鼠和蜜蜂的消化道中也大量存在。该菌是人和动物肠道中重要的生理性细菌，参与免疫、营养、消化和保护等一系列的生理过程。
目前，益生菌生产行业在生产各种益生菌菌粉(包括乳双歧杆菌菌粉)的过程中，几乎全部采用液态发酵，在液态发酵完成后经离心分离或其它的固液分离方法去除水分而得到湿菌体，然后添加干燥保护剂或载体混匀、冷冻干燥、粉碎、包装等。这种生产方法去除了益生菌在液态发酵过程中所产生的对于降脂减肥有助益的代谢产物，在产品中无法体现乳双歧杆菌代谢产物的作用，因此，这种方法所生产的益生菌产品仅仅利用了益生菌本身的效果而未能利用其代谢产物的效果；此外，干燥时菌体应激死亡率高，并且由于在湿菌体中添加适量的干燥保护剂或载体，使得液态发酵的产品在干燥后实际所得到的菌体数量也有所减少。
因此，现有的益生菌生产工艺存在菌种含量低、发酵效果差、干燥时菌体死亡率高因而成品中菌种活力低等缺陷。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种乳双歧杆菌；
本发明的第二目的在于提供上述乳双歧杆菌的应用，尤其是在制备治疗增加降脂减肥效果药物中的应用；
本发明的第三目的在于提供一种包含上述乳双歧杆菌的制剂；
本发明的第四目的在于提供上述乳双歧杆菌的制剂的制备方法,所述方法制备得到的乳双歧杆菌的制剂中活菌数量大，活力高，同时含有益生菌所产生的代谢产物，在人体胃肠道中具有更好地增加降脂减肥的效果。
为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)菌株，所述的乳双歧杆菌菌株为乳双歧杆菌Miuyo-11菌株，于2020年10月12日保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 20867。
本发明还提供前述乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)菌株的应用，尤其是在制备增加降脂减肥效果的药物中的应用。
本发明还提供一种降脂减肥的制剂，所述制剂包含前述乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)菌株。
根据本发明所述的降脂减肥的制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将乳双歧杆菌Miuyo-11菌株活化后，于液体培养基中进行逐级扩大培养，得到液体培养产物；
上述所说的扩大培养方法可按照常规的益生菌液态培养方法进行，作为一种可实施的方案，将乳双歧杆菌经斜面培养或平板培养活化后接种至三角瓶液体培养基中，37℃、厌氧条件下培养24h，得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐液体培养基中进行培养，37℃、厌氧条件下培养24h，得到液体培养产物；优选的，所述斜面培养或平板培养的培养基包含如下浓度的原料组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；所述三角瓶液体培养基和发酵罐液体培养基均包含如下浓度的原料组分：葡萄糖粉 20g/L、蛋白胨粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、 MnS04.4H20 0.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
(2)将所述液体培养产物进行固液分离并除去液体部分，得到乳双歧杆菌湿菌体；
所述固液分离的具体方式可按照常规的益生菌液态培养方法进行，例如可采用管式离心机或碟式离心机在无菌条件下进行，当采用上述两种离心机进行固液分离时，离心的转速可控制在8000-12000r/min，离心的时间控制在 15-25min，优选采用10000r/min的离心转速离心20min。
(3)将所述乳双歧杆菌湿菌体接种至固体发酵培养基中进行培养，优选培养温度为37℃，经低温干燥、粉碎、造粒、包衣，即得所述降脂减肥的制剂。
之所以将乳双歧杆菌湿菌体接种至固体发酵培养基中进行培养，目的在于， (1)使菌体数量和活力均得到大幅提高，高活力的益生菌更容易在肠道中定植, 且在肠道内的生长繁殖过程中,大量消耗葡萄糖、脂肪酸等小分子营养物质来合成菌体，增加大便的体积，降低脂肪的合成和吸收；(2)获得包括柠檬酸裂解酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等具有降脂减肥作用的益生菌代谢产物。其中，柠檬酸裂解酶是人体内过量的糖分通过三羧酸循环系统转化为脂肪的关键酶，抑制柠檬酸裂解酶能减少人体细胞脂肪的合成，从而降低人体的脂肪含量。与传统方法制成的乳双歧杆菌制剂相比，含有本发明降脂减肥代谢产物的乳双歧杆菌制剂在人体胃肠道中具有更好的降脂减肥的效果。
作为一种优选的可实施的方案，还包括调节所述接种后的固体发酵培养基的含水率至45-55％。所述含水率范围远低于液态培养物得到的湿菌体，因此，干燥固态培养物对菌体所造成的损伤和死亡率要远低于干燥液态培养物，从而使最终制备得到的产品的活菌数能达到1011cfu/g以上。具体的，可利用湿菌体、无菌水或步骤(2)分离得到的液体部分等含水物料调节接种后的固体培养基达到所述含水率范围。
作为一种优选的可实施的方案，以湿菌体100重量份计，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、L-半胱氨酸盐酸盐0.5重量份、食品级碳酸钙2重量份。进一步地，本发明人通过大量试验发现，固体发酵培养基中加入适量的乳清粉对于获得更多数量、更高活性的乳双歧杆菌具有一定的助益，因此，更优选的，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10 重量份、乳清粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、L-半胱氨酸盐酸盐0.5重量份、食品级碳酸钙2重量份。
本发明上述所说的固体发酵培养基各原料均优选采用食品级或医药级的粉末原料，且使用前经过粉末高温瞬间灭菌设备(150℃杀菌10s)或高温干热空气灭菌箱等杀菌设备(130℃高温烘箱烘1h)进行高温干热灭菌，并无菌冷却到38℃以下再使用。所述低温干燥指的是-40℃以下冷冻干燥或30℃～40℃条件下真空干燥，优选为-40℃以下冷冻干燥。所述粉碎、造粒、包衣的工序均可参考常规的颗粒剂制剂工艺进行。
本发明的有益效果：
1.本发明分离得到的乳双歧杆菌Miuyo-11菌株，具有如下特性：
(1)在pH6.5-7.5环境下培养生长良好，且最适生长pH为pH7.0；
(2)在34-40℃的温度环境下生长良好，最佳生长温度为37℃；
(3)具有降脂减肥的效果。
2.本发明包括液态培养、固液分离、固态培养相结合的工艺制备方法，充分利用了液态培养速度快，固液分离后的湿菌种菌体数量高，以及固态培养可使乳双歧杆菌的菌种活力和数量有较大的恢复和增长，并且在固态培养过程中还能产生柠檬酸裂解酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等具有降脂减肥作用的代谢产物。此外，固态培养添加的固态培养基及其培养产物还具有干燥保护剂的作用，且固态培养产生的菌体在干燥时应激小，菌体干燥时死亡率低，最终获得的产品菌种活力高，并含有适量的柠檬酸裂解酶抑制剂、α- 葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等具有降脂减肥作用的代谢产物，在实际的使用过程中具有更好的增加降脂减肥的效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1菌株的分离、菌种特性与鉴定
1.1样品采集
选择出生后3个月-1年、近期未使用过抗菌药物的健康婴儿，从其粪便中采集样品，即所采集的菌株来自于健康婴儿的肠道。
1.2菌株的分离
取婴儿粪便样品5-10g，置于无菌的50ml离心管中，加入20ml无菌生理盐水，振荡混匀后置于37℃厌氧培养箱中，静置培养过夜，吸取1ml样液，以无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个梯度分别取100μl菌悬液涂布于改良MRS平板上，放置于37℃厌氧培养箱中倒置培养，48h后，从不同梯度的涂布的培养平板中挑选菌落转接培养，在此基础上，挑取符合乳双岐杆菌典型特征的菌落在改良MRS平板上进行反复划线培养分离，挑取符合乳双歧杆菌菌落生长形态的单菌落接入改良MRS液态培养基中，于37℃厌氧培养箱中培养。最后获得一株具有良好生长性能的菌株。
1.3菌株的鉴定
(1)菌落形态与生理生化实验分析
本菌株的菌落为乳白色，圆形或呈星状，菌落较小，表面光滑，细密，细胞呈分叉的杆状。不运动、H2O2酶活性试验阴性、硫化氢试验阴性；革兰氏染色阳性；
在pH6.5-7.5时生长良好，最适为pH7.0；最适生长温度为34-40℃，最适生长温度为37℃；
能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、棉籽糖、乳糖、半乳糖、木糖、蜜二糖等；发酵葡萄糖时产酸、不产气。
(2)16S rRNA部分序列分析
将筛选菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1％琼脂糖进行凝胶电泳检测。使用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R(5’ GGTTACCTTGTTCGACTT-3’)进行PCR扩增，纯化后测序，得到的PCR产物序列，并进行菌种鉴定。
综合菌落形态分析、生理生化实验分析和16S rRNA部分序列分析的结果，将本发明菌株鉴定为乳双岐杆菌，并命名为“乳双岐杆菌Miuyo-11”。
1.4菌株的特性
1.4.1适合在中性pH环境下生长
乳双岐杆菌Miuyo-11在pH6.5-7.5环境下培养生长良好，且最适生长pH 为pH7.0。
实验方法如下：
将经过活化的乳双岐杆菌Miuyo-11菌种接种于改良MRS液体培养基中(即在MRS液体培养基的基础上加了L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L)，培养后得到菌种种子液，取1ml乳双岐杆菌Miuyo-11种子液接种于19ml pH分别为5.0、5.5、 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的改良MRS液体培养基中，在37℃下厌氧培养24h，测定初始和结束后的OD600值(即在600nm波长处的吸光度值，通常可以用来比较培养液中的菌体细胞密度或菌体生长情况)。
分别测定初始和结束的OD600值，以pH7.0的OD600值作对照(即以pH7.0 培养的菌数为100％计)，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：
菌体生长情况(％)＝(其它pH培养的OD)/pH7.0培养的OD×100％
结果见表1：
表1乳双歧杆菌Miuyo-11在不同pH培养基中的生长情况
Figure BDA0003001161350000081
表1的结果表明：本实验以在初始pH7.0生长的菌液OD值作为对照(即以 100％计)，而在其它pH的培养基中培养得到的菌液，虽然比pH7.0的培养基培养的菌液OD值低，但与不进行培养的空白对照组比较，仍然具有较高的生长速率。
1.4.2适合在37℃左右的温度环境下生长
最佳生长温度为37℃，在34-40℃的温度环境下生长良好。
实验方法如下：
将经过活化的乳双岐杆菌Miuyo-11菌种接种于改良MRS液体培养基中(加 L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L)，培养后得到菌种种子液，取1ml乳双岐杆菌 Miuyo-11种子液接种于19ml pH分别为7.0的改良MRS液体培养基中，分别在 31℃、34℃、37℃、40℃、43℃的温度下厌氧培养24h，测定初始和结束后的 OD600值(即在600nm波长处的吸光度值，通常可以用来比较培养液中的菌体细胞密度或菌体生长情况)。
分别测定初始和结束的OD600值，以37℃的OD600值作对照(即以37℃培养的菌数为100％计)，按照下列公式计算不同pH培养基中的菌体生长情况：
菌体生长情况(％)＝(其它温度培养的菌数)/37℃培养的菌数×100％
结果见表2：
表2乳双歧杆菌Miuyo-11在不同温度下的生长情况
温度(℃) 对照(不培养) 31 34 37 40 43
菌体生长情况(％) 0 73.3 88.6 100 93.3 76.1
表2的结果表明：乳双岐杆菌Miuyo-11在34-40℃的培养温度环境下具有良好的生长能力，其最佳生长温度为37℃。
1.4.3降脂减肥效果
见实施例6。
综上所述，本发明的乳双岐杆菌具有如下的特性：
(1)在pH6.5-7.5环境下培养生长良好，且最适生长pH为pH7.0；
(2)在34-40℃的温度环境下生长良好，最佳生长温度为37℃；
(3)具有降脂减肥的效果。
实施例2制备乳双歧杆菌制剂(液态法对照例)
2.1培养基
(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、 K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H200.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：
葡萄糖粉20g/L、蛋白胨粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、 MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
2.2制剂的制备方法
本实施例的乳双歧杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
使用上述改良MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。
(2)液态培养：
将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h，得到液体培养产物；
(3)固液分离：
将上述液体培养产物用管式离心机或碟式离心机进行固液分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；
(4)干燥：
将湿菌体置于冷冻干燥机中在-40℃冷冻干燥20h，即得到液态法制备的乳双歧杆菌原粉。
产品中活菌数的测定方法为：用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后，采用MRS琼脂培养基平板倾注法，37℃培养48h后计菌落总数。
经测定：本实例所制备的乳双歧杆菌原粉产品，其总菌数为2.18× 1011CFU/g。
(5)造粒、包衣和包装：
向步骤(4)所得乳双歧杆菌原粉中加入适量的辅料(如：海藻糖、脱脂奶粉等)，经造粒，得到液态法制备的乳双歧杆菌制剂。
经测定：本实施例制备所得的乳双歧杆菌制剂产品，其总菌数为1.15× 1011CFU/g。
实施例3制备乳双歧杆菌制剂(固态法1)
3.1培养基
(1)MRS固体培养基(用于斜面培养和平板培养)：
葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、 K2HP042g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H200.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(2)MRS液体培养基(用于三角瓶培养和发酵罐培养)：
葡萄糖粉20g/L、蛋白胨粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用1mol/L NaOH调节pH为7.0，121℃高温杀菌20min。
(3)固体培养的培养基(用于固态培养)：
按照下列配方的比例准备固态培养的原料：
湿菌体100g、葡萄糖粉20g、蛋白胨粉10g、酵母浸出物粉10g、番茄粉 10g、K2HP042g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5重量份、食品级碳酸钙2g。
除了湿菌体外，其余各种原料分别杀菌(分别用高温瞬时杀菌设备在150℃杀菌10s)，冷却后无菌混合均匀，作为固态培养基的原料备用。
3.2制剂的制备方法
本实施例的乳双歧杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
使用上述改良MRS固体培养基进行菌种的斜面培养或平板培养。
(2)液态培养：
将斜面或平板培养得到的菌种接种于三角瓶改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐改良MRS液体培养基中，37℃液态厌氧培养24h，得到液体培养产物；
(3)固液分离：
将液体培养产物用管式离心机或碟式离心机进行固液分离，离心机转速为10000r/min，离心时间为20min，得到湿菌体，水分含量为80％；立即将湿菌体转入固态培养基培养；
(4)固态培养：
在无菌室将湿菌体与无菌的固态培养基混合，调节所得混合物的含水率为 50％。然后置于厌氧固态发酵罐中，在37℃下密封厌氧固态培养72h。
(5)干燥：
将步骤(4)固态培养产物在-40℃下冷冻干燥20h，得到固态法(1)制备的乳双歧杆菌原粉。经测定：本发明制备所得的乳双歧杆菌原粉产品，其总菌数为2.65×1011CFU/g。
(6)造粒、包衣和包装：
将步骤(5)所得乳双歧杆菌原粉造粒，包衣，得到固态法(1)制备的乳双歧杆菌制剂。
经测定：本实例所制备的乳双歧杆菌制剂产品，其总菌数为2.16× 1011CFU/g。
实施例4制备乳双歧杆菌制剂(固态法2)
实施例4的工艺操作与实施例3基本相同，仅更改部分操作参数，用于说明在不同的操作条件下生产的固态培养益生菌产品的效果。
4.1培养基
实施例4的固体培养基与实施例3相同。
4.2制剂的制备方法
与实施例3的不同仅在于，调节所得混合物的含水率为52％。在37℃下密封厌氧固态培养96h。
其他步骤同实施例3，分别制成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的乳双歧杆菌原粉产品总菌数为3.28× 1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为2.83×1011CFU/g。
实施例5制备乳双歧杆菌制剂(固态法3)
实施例5的工艺操作与实施例3基本相同，仅更改部分操作参数，用于说明在不同的操作条件下生产的固态培养益生菌产品的效果。
5.1培养基
与实施例3不同仅在于，实施例5的固体培养基增加乳清粉10g。
5.2制剂的制备方法
与实施例3的不同仅在于，调节所得混合物的含水率为55％。在37℃下密封厌氧固态培养120h。
其他步骤同实施例3，分别制成原粉产品和制剂产品。
经测定：本实施例所制备的乳双歧杆菌原粉产品总菌数为3.49× 1011CFU/g；将其制成制剂所得到的制剂产品的总菌数为2.97×1011CFU/g。
本发明的制备方法中，若发酵罐培养基较大，可将三角瓶液体菌种再接种于1-3级菌种罐中扩大培养，从而获得用于发酵罐的液体菌种，小规模培养则直接只用三角瓶培养的菌种进行接种。
实施例6效果对比试验(乳双歧杆菌对小鼠的降脂减肥效果)
益生菌对小鼠的降脂减肥效果可以通过测定饲喂益生菌的小鼠体重、Lee's 指数和血脂等指标来进行表征。
6.1相同重量浓度下菌剂对小鼠降脂减肥效果的影响
6.1.1材料与试剂：
昆明种小鼠，雌雄各半，4周龄，体重18-22g。
6.1.2试验方法：
动物分组：买来的小鼠用基础饲料经过1周的适应性饲养后测定体重作为初始体重，剔除体重过大过小的小鼠，挑选80只小鼠随机分成8组，每组10 只，雌雄各半。
空白对照组(蒸馏水)、模型对照组(高脂饲料3g)、阳性对照组(奥利司他 400μg)、实施例2(液体法对照组)原粉、实施例2(液体法对照组)制剂、实施例3原粉、实施例3制剂、实施例4制剂、实施例5制剂。
小鼠每日3餐正常饲喂基础饲料。在每餐饲喂基础饲料之后30分钟左右，再用表3各组相应的剂量配成10ml溶液灌胃，然后每周测量1次体重，共进行 4周饲养实验,实验结束时测定最终体重并采血测定血脂含量。
6.1.3观察指标及方法：
①一般情况观察：
活动程度，体毛色泽、体形、饮食、饮水及粪便状况。
②生长指标检测：
生长指标主要检测体重(g)和肥胖指数(Lee's指数)，其中Lee's指数的计算方法为：
Lee's指数＝[体重(g)]1/3/体长(cm)×1000
③血脂检测：
血脂测定(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)，采用全自动生化分析仪测定。
6.1.4实验结果：
①一般情况：
六组小鼠的体毛色泽均无变化。
模型对照组食欲增强，体形变圆，活动较正常对照组迟钝，大便略有增加；
阳性对照组小鼠大便偏稀，益生菌高、中、低剂量组小鼠无腹泻现象。
益生菌高、中、低剂量组小鼠与模型对照组比较，进食量较少，活动较灵活，大便量明显增多。
②体重变化：
实验各组经过1周的适应性饲养后随机分组，各组间小鼠的初始体重差异无统计学意义(P＞0.05)；4周的喂养实验结束时，模型对照组与空白对照组比较，体重显著升高；阳性对照组与空白对照组比较，体重显著降低；不同实施例的益生菌组与空白对照组相比，体重显著降低；与模型对照组比较，体重显著降低，结果见表3：
表3益生菌对小鼠体重的影响
Figure BDA0003001161350000161
4周的饲养实验结束后，采血测定血脂含量，结果见表4：
表4益生菌对小鼠血脂的影响
Figure BDA0003001161350000162
Figure BDA0003001161350000171
由表3、表4的结果可以看出：
与空白对照相比，由实施例2和实施例3生产的乳双岐杆菌杆菌原粉对小鼠降脂减肥具有特别显著的效果。
与空白对照相比，由实施例2、实施例3、实施例4和实施例5等生产的乳双岐杆菌制剂对小鼠降脂减肥效果具有特别显著的效果。
与液态培养法(实施例2)制备的乳双岐杆菌制剂相比，固态培养法(实施例 3-5)制备的乳双岐杆菌制剂对小鼠降脂减肥效果有特别显著的效果。
上述实验结果表明：益生菌对小鼠体重具有一定的降低作用，益生菌在肠道内利用葡萄糖、脂肪酸等小分子营养物质合成肠道菌体成分，增加大便的排出，有助于驱除脂肪；此外，益生菌所产生的代谢产物也有利于降低体内脂肪的合成。因此，益生菌具有抑制小鼠体重增加的作用。益生菌对小鼠血脂影响的实验结果表明：益生菌能降低TG、CHO、LDL-C，增加HDL-C，因此，益生菌有助于改善体内脂肪代谢，具有良好的降脂功能。根据表3和表4的实验结果还发现：本发明的固态法益生菌产品比传统的液态法益生菌产品具有更好的降脂减肥作用。
6.2相同菌数时制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响
试验方法同6.1。
分别称取益生菌制剂成品1g，加入适量无菌水，经菌数测定后，加入无菌水调整益生菌总数浓度为1×1010CFU/ml，每次灌服10ml，故每次服用的干酪乳杆菌总数为10×1010CFU，即1×1011CFU。
按照6.1类似的试验方法，测定相同菌数的实施例制剂样品对小鼠降脂减肥效果的影响，结果以“平均值±标准差”来表示，详见表5：
表5相同菌数时制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响
Figure BDA0003001161350000181
4周的饲养实验结束后，采血测定血脂含量，结果见表6：
表6相同菌数时制剂产品对小鼠血脂的影响
Figure BDA0003001161350000182
Figure BDA0003001161350000191
如表5、表6所示，实施例2为液态法制备的制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响，而实施例3、4、5则分别为3种固态法制备的制剂产品对小鼠降脂减肥效果的影响。
表5、表6的实验结果表明：相同菌数的制剂产品也具有大致相同降脂减肥效果。综合上述表3、表4、表5和表6的实验结果还发现：本发明的固态培养法制备的益生菌产品比传统的液态法制备的益生菌产品具有更好的降脂减肥作用。
益生菌对小鼠降脂减肥效果的影响，如果仅仅是活菌的效果，那么当采用相同的菌数时应该具有大致相同的效果，但上述结果表明：与液态法(实施例 2)所制备的乳双岐杆菌产品相比，本发明的实施例3、4、5采用固态法制备的乳双岐杆菌产品具有更好的降脂减肥效果。液态法制剂在制备过程中由于离心分离去除了液态培养过程所产生的代谢产物，所以其降脂减肥的效果主要来自于菌种本身；而本发明制备所得固态法制剂中除了含有乳双岐杆菌菌体外，还含有固态培养过程中所产生的柠檬酸裂解酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、短链脂肪酸等具有降脂减肥能力的代谢产物，乳双岐杆菌与代谢产物协同增效，提高了菌剂整体对小鼠降脂减肥效果的影响。
综上所述，采用本发明所制备的益生菌制剂，具有良好的降脂减肥作用，其效果优于液态法益生菌制剂，虽然略低于常用的降脂减肥药物奥利司他，但由于其副作用小，且益生菌制剂还具有调节肠道、增加免疫力等其它效果，且不受药品剂量限制。因此，可将益生菌作为肥胖病人的辅助调理用品，协助其它降脂减肥药物发挥优异的降脂减肥的作用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)菌株，其特征在于，所述的乳双歧杆菌菌株为乳双歧杆菌Miuyo-11菌株，保藏编号为CGMCC 20867。
2.权利要求1所述的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)菌株的应用。
3.权利要求1所述的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)菌株在制备增加降脂减肥效果的药物中的应用。
4.一种降脂减肥的制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)菌株。
5.权利要求4所述降脂减肥的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将乳双歧杆菌Miuyo-11菌株活化后，于液体培养基中进行逐级扩大培养，得到液体培养产物；
(2)将所述液体培养产物进行固液分离并除去液体部分，得到乳双歧杆菌湿菌体；
(3)将所述乳双歧杆菌湿菌体接种至固体发酵培养基中进行培养，经低温干燥、粉碎、造粒、包衣，即得所述降脂减肥的制剂。
6.根据权利要求5所述降脂减肥的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将乳双歧杆菌经斜面培养或平板培养活化后接种至三角瓶液体培养基中，37℃、厌氧条件下培养24h，得到三角瓶液体菌种；将所述三角瓶液体菌种接种至发酵罐液体培养基中进行培养，37℃、厌氧条件下培养24h，得到液体培养产物；
所述斜面培养或平板培养的培养基包含如下浓度的原料组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、琼脂15g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H20 0.5g/L、MnS04.4H200.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；
所述三角瓶液体培养基和发酵罐液体培养基均包含如下浓度的原料组分：葡萄糖粉20g/L、蛋白胨粉10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母浸膏5g/L、番茄酱10g/L、K2HP04 2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、Tween-80 1g/L、MgS04.7H200.5g/L、MnS04.4H20 0.05g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
7.根据权利要求5所述降脂减肥的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以湿菌体100重量份计，所述固体发酵培养基包含如下重量份的原料组分：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、L-半胱氨酸盐酸盐0.5重量份、食品级碳酸钙2重量份。
8.权利要求5所述降脂减肥的制剂制备方法，其特征在于，步骤(3)中，固体培养基包含以下重量份的原料：葡萄糖粉20重量份、蛋白胨粉10重量份、酵母浸出物粉10重量份、乳清粉10重量份、番茄粉10重量份、K2HP04 2重量份、L-半胱氨酸盐酸盐0.5重量份、食品级碳酸钙2重量份。
9.根据权利要求5所述降脂减肥的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，还包括调节所述接种后的固体发酵培养基的含水率至45-55％。
10.根据权利要求5所述降脂减肥的制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)中，所述培养的温度均为37℃。
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