CN110669697A - 一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用 - Google Patents

一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用。本发明的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌LC89，已于2018年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15409，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。本发明的目的是提供一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌，优于商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG，同时提供其培养方法及其在治疗宿主炎症性肠病方面的应用，既能补充益生菌调节肠道，又具有改善宿主炎症性肠炎的目的。

Description

一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用。
背景技术
炎症性肠病，简称IBD，是一种特殊的慢性肠道炎症性疾病，很多老百姓口中的“慢性肠炎”很可能就是IBD。近30年来，我国IBD发病率有不断攀升的趋势。根据国内文献报道，近5年的病例数已达到上世纪90年代同期的8倍。IBD已逐渐成为我国消化科的常见病。IBD患者肠道不能正常吸收进食的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素及多种微量元素，加上肠道炎症或服用的药物可能造成食欲不佳，因此IBD常伴随着不同程度的腹痛、腹泻、营养不良、消瘦等。患该病的青少年儿童，甚至影响正常的生长发育。
益生菌，通常被定义为通过改善宿主的肠道微生物平衡，而有利于人或动物宿主的活微生物食物增补剂，其对宿主的肠道调节具有重要的作用。其调节功能主要是其在生长过程中代谢所产生的有益代谢产物，其对宿主产生相应的健康作用。
短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)也称作挥发性脂肪酸，是由1-6个碳原子组成的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸及丁酸等。SCFA主要来自结肠内厌氧菌利用碳水化合物发酵的产物，可以直接为肠黏膜细胞提供能量。近几年来，有研究表明，短链脂肪酸还具有调节肠道内pH值，改善机体炎症性肠病等作用。但由于不同菌株之间代谢所产生的短链脂肪酸的量不同，高产短链脂肪酸的菌株成为研究者们关注的对象。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌，同时提供其培养方法及其在治疗宿主炎症性肠病方面的应用，既能补充益生菌调节肠道，又具有改善宿主炎症性肠炎的目的。
本发明第一方面提供一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌，命名为LC89，已于2018年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15409，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步的，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸或已酸。
本发明第二方面提供一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌的培养方法，包括将干酪乳杆菌LC89菌种接种于适用于产短链脂肪酸的培养基内，控制温度25-45℃、pH 5.0-7.0培养8-24h，并最终获得培养液的步骤。
进一步的，所述培养液中短链脂肪酸的含量通过液相色谱仪进行检测。
进一步的，所述培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2.0-10％、牛肉浸粉0.5-5％、蛋白胨0.8-4.5％、酵母浸膏0.5-6.0％、乙酸钠0.2-2.0％、硫酸镁0.02-0.15％、硫酸锰0.01-0.5％、氯化钙0.1-0.9％、柠檬酸氢二铵0.1-0.9％、吐温-80 0.05-0.5％、磷酸氢二钾0.1-1.0％，剩余为水，培养基灭菌条件为：121℃灭菌20min。
进一步的，所述培养基中葡萄糖单独灭菌，其它成份一起灭菌，然后无菌操作混合在一起。
本发明第三方面提供一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌LC89，在治疗炎症性肠病中的应用。
进一步的，所述干酪乳杆菌LC89的剂型为口服粉剂。
进一步的，所述粉剂为高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌LC89菌粉经过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到。
进一步的，所述粉剂还包括辅料。
进一步的，所述辅料为菊粉。
进一步的，所述干酪乳杆菌LC89菌粉为活菌粉，其通过发酵培养物的上清液来进行制备。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明提供的乳酸菌可高产短链脂肪酸，其产量优于普通常用的乳杆菌和商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG，其乳酸菌制剂通过动物试验及人体试验，能有效改善宿主的炎症性肠病，缓解炎症性肠病引起的腹痛、腹泻、食欲减退等症状，并且由于干酪乳杆菌属于益生菌，利用其发酵生产的短链脂肪酸对人体完全无害甚至有益，安全性优异。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
应当说明的是，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明采用的常见试剂的配方如下，在后续实施例中不再赘述。
MRS培养基：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1ml、磷酸氢二钾2.00g、硫酸锰0.58g和硫酸镁0.28g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4。
实施例1产短链脂肪酸菌株的分离、筛选及鉴定
本实施例提供一种产短链脂肪酸菌株的分离、筛选及鉴定方法，包括如下步骤：
从传统发酵食品的若干样品中，用无菌水溶解，梯度稀释，取适宜梯度1ml于无菌培养皿(每个稀释梯度做3个平行)，用MRS-碳酸钙培养基浇注，待凝固后，37℃厌氧倒置培养72h。共选择了100株具溶钙圈(以溶钙圈直径表示，单位mm)的菌株，编号1-100，其中选取溶钙圈较大的前20个菌株编号数据，结果如表1所示：
表1 溶钙圈排名前20的菌株状况表
Figure BDA0002256212440000041
注：数据上标为不同小写字母(ab)的表示存在显著性差异(P<0.05)，只有一个字母(a)表示差异不显著(P>0.05)。
实施例2高产短链脂肪酸的菌株发酵及检测方法
本实施例提供一种高产短链脂肪酸的菌株发酵及检测方法，包括以下步骤：
S1、将筛选所得溶钙圈较大的20株菌株接种到发酵培养基中；
其中，发酵培养基中各组分重量百分比为：葡萄糖2.0-10％、牛肉浸粉0.5-5％、蛋白胨0.8-4.5％、酵母浸膏0.5-6.0％、乙酸钠0.2-2.0％、硫酸镁0.02-0.15％、硫酸锰0.01-0.5％、氯化钙0.1-0.9％、柠檬酸氢二铵0.1-0.9％、吐温-80 0.05-0.5％、磷酸氢二钾0.1-1.0％，余量为水。其中葡萄糖培养基成份单独灭菌，其它成份一起灭菌，之后再无菌操作混合在一起。灭菌条件：121℃灭菌20min；
将灭好的发酵培养基1-5％的接种量进行接种，培养温度为25-45℃，pH控制5.0-7.0,培养时间为8-24h，获得培养液；
S2、将培养好的菌液，在温度为4℃下，6500rpm离心20min，得到的上清液使用孔径为0.22um膜进行过滤，滤液再用无菌水稀释10倍，采用高效液相色谱仪对上清液中的短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)进行检测，色谱条件如下：
仪器：安捷伦1100；色谱柱为C18，46*250mm，50cm；流动相为甲醇/H3PO4/水＝5/0.05/95；流速为1mL/min；柱温为30℃，采用UV210nm进行检测；进样量：5uL。
对实施例1中的20株编号菌株，选取抑菌圈较大的前10株的上清液，采用上述方法进行短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)的检测，结果如表2所示，结果显示编号89菌株的短链脂肪酸的产量最高。
表2 溶钙圈排名前10的菌株的短链脂肪酸产量表
菌株 乙酸(mmol/L) 丙酸(mmol/L) 丁酸(mmol/L) 戊酸(mmol/L) 已酸(mmol/L)
编号3 106.14±0.48<sup>ab</sup> 3.47±0.05<sup>a</sup> 12.15±0.32<sup>ab</sup> 1.72±0.03<sup>ab</sup> 0.31±0.02<sup>ab</sup>
编号17 103.20±0.17<sup>ab</sup> 2.17±0.06<sup>ab</sup> 11.22±0.21<sup>ab</sup> 1.67±0.05<sup>ab</sup> 0.25±0.03<sup>ab</sup>
编号25 98.31±0.45<sup>ab</sup> 2.04±0.04<sup>ab</sup> 9.04±0.45<sup>ab</sup> 1.56±0.03<sup>ab</sup> 0.22±0.01<sup>ab</sup>
编号79 130.14±0.25<sup>a</sup> 3.69±0.02<sup>a</sup> 16.28±0.53<sup>a</sup> 1.88±0.05<sup>a</sup> 0.28±0.02<sup>a</sup>
编号81 128.14±0.25<sup>a</sup> 3.51±0.02<sup>a</sup> 15.05±0.12<sup>a</sup> 1.92±0.04<sup>a</sup> 0.3±0.01<sup>a</sup>
编号82 138.16±0.32<sup>a</sup> 5.79±0.02<sup>ab</sup> 18.05±0.15<sup>ab</sup> 2.12±0.05<sup>ab</sup> 0.34±0.02<sup>ab</sup>
编号84 156.15±0.45<sup>ab</sup> 4.67±0.03<sup>ab</sup> 18.35±0.22<sup>ab</sup> 2.32±0.02<sup>ab</sup> 0.4±0.05<sup>ab</sup>
编号86 168.13±0.35<sup>ab</sup> 5.68±0.05<sup>ab</sup> 21.15±0.25<sup>ab</sup> 2.82±0.01<sup>ab</sup> 1.0±0.02<sup>ab</sup>
编号89 193.00±0.15<sup>ab</sup> 7.85±0.06<sup>ab</sup> 27.42±0.43<sup>ab</sup> 3.12±0.05<sup>ab</sup> 1.5±0.03<sup>ab</sup>
编号91 133.16±0.75<sup>ab</sup> 3.75±0.09<sup>a</sup> 15.93±0.22<sup>a</sup> 1.89±0.02<sup>a</sup> 0.29±0.02<sup>a</sup>
注：数据上标为不同小写字母(ab)的表示存在显著性差异(P<0.05)，只有一个字母(a)表示差异不显著(P>0.05)。
经分离得一株菌溶钙圈较大、短链脂肪酸产量较高的菌株，命名为LC89，该菌株在显微镜下观察呈杆状、短杆状，成对或成链存在，能发酵乳糖、葡萄糖等，产生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等，一种厌氧的革兰氏阳性杆菌。对获得的菌株利用16s rDNA测序鉴定,测序结果如SEQ ID NO.1所示,经过与模式菌株进行Blast对比，鉴定为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LC89(Lactobacillus casei LC89)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15409,保藏日期为2018年3月5日。
所述的干杯乳杆菌LC89具有下述生物学特性：
a、菌体特征：为革兰氏阳性菌，在pH值为4.5-7.5，厌氧环境条件下生长较好，不形成孢子。菌体约(0.6-1.1)μm*(2.5-6.5)μm,成对或链状排列，无鞭毛。
b、菌落特征：在MRS培养基上的菌落呈乳白色，凸起或透镜状，直径在0.2-2.5mm之间，平滑的表面，不形成菌丝体；
c、生物特性：该菌株为兼性厌氧菌，但是在厌氧条件下生长最佳，最适生长温度为35-39℃，30-36℃生长良好，15℃以下基本不生长。最适初始pH值为6.5-7.5。在含有葡萄糖、乳糖、蔗糖的培养基中生长良好。
采用上述同样的培养方法及检测方法，以其它常用的益生菌(鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌等)和商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG为对比，检测其发酵上清液中的短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)的含量。
鼠李糖乳杆菌LGG于1983年由美国北卡罗来纳州立大学两名美国教授(Gorbachand Goldin)自健康人体分离出来，其在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以进入人体肠道定植并保持活性，具有平衡和改善胃肠道功能、增强人体自身免疫能力、预防和帮助治疗腹泻的作用，因此成为全球研究最多的第三代益生菌。
产量对比结果如下表3所示，结果表明其干酪乳杆菌LC89的短链脂肪酸的产量均高于其它常规益生菌以及商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG的产量。
表3 干酪乳杆菌LC89与其它常用益生菌短链脂肪酸产量比较
Figure BDA0002256212440000061
Figure BDA0002256212440000071
注：数据上标为不同小写字母(ab)的表示存在显著性差异(P<0.05)，只有一个字母(a)表示差异不显著(P>0.05)。
实施例3干酪乳杆菌LC89产品的制备。
所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌LC89产品，为实施例2发酵后得到发酵液，经过6500rpm离心20min，得到菌泥，菌泥与保护剂(10-25％海藻糖、1-5％蔗糖、10-15％麦芽糊精)以1：1-3的比例混合乳化后，经过真空冷冻干燥或喷雾干燥、粉碎，加相应的辅料(菊粉)得到。
实施例4高产短链脂肪酸干酪乳杆菌LC89对炎症性肠炎的的应用
通过对大鼠进行构建结肠炎模型，其中未造模大鼠作为正常对照组，正常饮水，进食。造模成功大鼠分为模型对照组(n＝10)、大剂量测试组(将固体调剂稀释成1010CFU/ml，n＝10)、小剂量测试组(将固体调剂稀释成109CFU/ml，n＝10)。各组予1ml/100g体重相应制剂1次/d灌胃，连续21d。其大鼠结肠病变情况结果如下表4所示，直肠和结肠下段组织学评分测试组低于模型对照组，但无统计学意义；而结肠中上段组织学评分、结肠溃疡指数的测试组均低于模型对照组，均有显著性差异，说明干酪乳杆菌LC89对结肠组织的改善有一定的促进作用。
表4 干酪乳杆菌LC89对结肠病的影响
Figure BDA0002256212440000072
Figure BDA0002256212440000081
除此之外，如表5所示，模型对照组T细胞转化率与正常对照组相比明显降低(p<0.05)，测试组中T细胞转化率较模型对照组有一定升高，但不显著。模型对照组血清IL-8水平较正常对照组显著升高。各治疗组血清IL-8、TNF-α水平均较模型对照组显著降低；说明干酪乳杆菌LC89能有效降低大鼠的炎症因子，缓解炎症性肠病。
表5 干酪乳杆菌LC89对淋巴细胞转化率和血清IL-8、TNF-α水平的影响
Figure BDA0002256212440000082
实施例5志愿者测试
志愿者为50名年龄在30-50岁的人群。测试组、对照组各25名。
使用实施例3中的干酪乳杆菌LC89制剂，测试组采用活菌数为1×109-1×1010CFU/g的干酪乳杆菌LC89制剂，对照组用菊粉替代干酪乳杆菌LC89制剂，其它条件相同。
在测试开始前，了解受试人群的初始的基本情况，如炎症性肠炎引起的腹痛程度、腹泻频率、体重等。
受试人群每天早晚使用干酪乳杆菌LC89制剂各一次，使用两周后对腹痛程度、腹泻频率、食欲进行数据汇总。结果如表6所示，采用干酪乳杆菌LC89制剂的试验组能明显改善受试人群的炎症性肠炎引起腹痛程度、腹泻频率及饮食的食欲。
表6 志愿者测试对照表
Figure BDA0002256212440000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏微康生物科技有限公司
<120> 一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌、培养方法及其应用
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1498
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei
<400> 1
tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgagttt tggtcgatga 60
acggtgcttg cactgagatt cgacttaaaa cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg 120
taacctgccc ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg cataaatcca 180
agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg cgcaagctat cgcttttgga tggacccgcg 240
gcgtattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg atgatacgta gccgaactga 300
gaggttgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 360
agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc 420
tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc 480
gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt 600
ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg 660
cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca 720
ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 780
cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag 840
ggtttccgcc cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacgacc 900
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttttgatca cctgagagat 1020
caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgactagttg ccagcattga 1140
gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg 1260
cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa agccattctc agttcggact gtaggctgca 1320
actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccgaagccg 1440
gtggcgtaac ccttttaggg agcgagccgt ctaaggtggg acaaatgatt agggtgaa 1498

Claims (10)

1.一种高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌，其特征在于：命名为LC89，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15409。
2.根据权利要求1所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌，其特征在于：所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸或已酸。
3.根据权利要求1所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌的培养方法，其特征在于：包括将干酪乳杆菌LC89菌种接种于适用于产短链脂肪酸的培养基内，控制温度25-45℃、pH5.0-7.0培养8-24h，并最终获得培养液的步骤。
4.根据权利要求3所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌的培养方法，其特征在于：所述培养液中短链脂肪酸的含量通过液相色谱仪进行检测。
5.根据权利要求3所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌的培养方法，其特征在于：所述培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2.0-10％、牛肉浸粉0.5-5％、蛋白胨0.8-4.5％、酵母浸膏0.5-6.0％、乙酸钠0.2-2.0％、硫酸镁0.02-0.15％、硫酸锰0.01-0.5％、氯化钙0.1-0.9％、柠檬酸氢二铵0.1-0.9％、吐温-80 0.05-0.5％、磷酸氢二钾0.1-1.0％，剩余为水，培养基灭菌条件为：121℃灭菌20min。
6.根据权利要求5所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌的培养方法，其特征在于：所述培养基中葡萄糖单独灭菌，其它成份一起灭菌，然后无菌操作混合在一起。
7.根据权利要求1所述的高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌LC89，在治疗炎症性肠病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述干酪乳杆菌LC89的剂型为口服粉剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述粉剂为高产短链脂肪酸的干酪乳杆菌LC89菌粉经过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述干酪乳杆菌LC89菌粉为活菌粉或死菌粉，其通过发酵培养物的上清液来进行制备。
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