CN115484968A - 肠道双歧杆菌的生长的刺激 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了组合物，其用于刺激肠道双歧杆菌的生长，从而维持/改善肠道健康。特别感兴趣的是包含发酵乳杆菌的细胞的组合物，包括产品
Description
发明背景
本公开涉及能够刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长的药剂。
肠道微生物群组成可能在宿主健康状况中发挥重要作用。特别地，微生物群破坏已经与腹泻、肠易激综合征(IBS)、肥胖症、变态反应以及行为和发育病症(包括孤独症)有关。设计为影响微生物群组成的策略包括摄入益生菌、益生元和合生元(益生细菌和刺激此种和其他细菌的增殖的益生元的组合)。更激烈但不太可预测的微生物群调节方法包括补充抗细菌剂(诸如抗生素或细菌素)或粪便微生物群转移(FMT)。微生物代谢物水平的改变也与病况诸如抑郁、结直肠癌、心血管疾病、肥胖症和2型糖尿病相关联。因此，微生物衍生的分子，诸如神经递质、短链脂肪酸(SCFA)、吲哚、胆汁酸、胆碱代谢物、乳酸和维生素的作用在健康和幸福中发挥着重要作用。
SCFA是在非消化性膳食碳水化合物的微生物发酵过程中产生的。SCFA的产生可以直接促进宿主能量代谢，其中乙酸盐和丙酸盐被肝脏和周围器官吸收和代谢，而丁酸盐主要被结肠上皮利用，并且可以被某些细菌用作能量来源。此外，SCFA通过调节细胞分化、抗致癌和抗炎作用，或通过增强饱腹感和抑制食欲，对宿主的生理学具有有益的影响。已经提出双歧杆菌产生丙酸盐和乙酸盐是其对宿主健康的有益效果的一个原因。
双歧杆菌是经常在人胃肠道中发现的厌氧的革兰氏阳性细菌。在健康的成人中，总粪便微生物群的4.4％至17.9％是双歧杆菌。一般来说，较高的双歧杆菌水平与有益的作用相关联，包括肠道中降低的内毒素水平、降低的肠道渗透性、降低的细菌转移率和代谢改善。同时，双歧杆菌的数量减少与各种病症相关联，包括抗生素相关性腹泻、IBS、炎性肠病(IBD)、肥胖症、变态反应和退行性孤独症。因此，刺激双歧杆菌属(Bifidobacterium)是预防和/或减少许多病症的程度并改善生活质量的有效策略。刺激内在的双歧杆菌属种是特别令人感兴趣的。
乳杆菌属(Lactobacillus)是革兰氏阳性、兼性厌氧或微需氧、杆状、无芽孢形成细菌的属。它们是乳酸细菌群(即它们将糖类转化为乳酸)的主要部分。在人中，它们构成许多身体部位的微生物群的重要组成部分。乳杆菌属目前含有超过180个物种，并且涵盖各种各样的生物体。为了本公开的目的，提及乳杆菌属包括发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，它最近被重新命名为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)。因此，发酵乳杆菌和发酵粘液乳杆菌在本公开中可互换使用。
我们现在惊奇地发现，包含乳杆菌株的细胞(例如死细胞)和/或已培养此类细胞的培养基，以及其上清液(即无细胞上清液)和细胞级分的组合物，能够刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。这些组合物和级分对于维持哺乳动物(如人)肠道的健康，以及治疗可能因增加肠道中双歧杆菌的量而有所帮助的病症，包括抗生素相关性腹泻、生态失调、肠易激综合征(IBS)和炎性肠病(IBD)特别有用。汇总本公开方面的报告可以在Appliedand Environmental Microbiology,doi:10.1128/AEM.02459-20(Warda等人)，2021年2月12日在线发布(http://aem.asm.org)中找到。该文章及其具体内容通过引用并入本文。
如本文所用，“培养基”优选为MRS肉汤(即不含琼脂组分的传统MRS产品)，其包括由一种或多种乳杆菌株的细胞生长产生的材料。
能够刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌生长的本公开的一种特定产品是
作为成人和儿童腹泻的对症治疗而销售，是再水合(rehydration)和/或饮食措施的补充。然而，以前没有报道过它刺激哺乳动物(如人)肠道中双歧杆菌的生长。
能够刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌生长的本公开的另一种特定产品是低乳糖
(以下简称LLL)。LLL是在添加乳糖以形成出售的
成品之前的
生产产品。LLL含有
中的低于10％w/w的乳糖。
能够刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌生长的本公开的另一种特定产品是
的组分，即发酵乳杆菌。
同样特别感兴趣的是
LLL和发酵乳杆菌的上清液和细胞(例如死细胞)的级分，包括
上清液的级分，称为级分52，其能够刺激哺乳动物(例如人)肠道内双歧杆菌的生长。
本公开进一步涉及包含在级分52中的一种或多种化合物，其负责刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
发明内容
在本文中，术语“治疗”旨在也涵盖本公开的组合物针对所述病况或病症的预防和保护用途。
本公开的一个方面提供了包含发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)的组合物，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的另一个方面提供了包含发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)的组合物，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的进一步的方面提供了组合物，其包含培养发酵乳杆菌的细胞或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞的培养基，所述组合物用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的另一个方面提供了组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)以及培养发酵乳杆菌的细胞的培养基，所述组合物用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的又一个方面提供了组合物，其包含发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)以及培养发酵乳杆菌和德氏乳杆菌细胞的培养基，所述组合物用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的进一步的方面提供了
其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的另一个方面提供了LLL，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌生长。
本公开的又一个方面提供了
或LLL的上清液级分或细胞级分，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的特定方面提供了
或LLL的上清液部分，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的进一步特定方面提供了级分52(如本文所定义)，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的另一个特定方面提供了级分52内的一种或多种化合物，其用于刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长。
本公开的一个方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的进一步的方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)，包括LB乳杆菌的细胞(例如死细胞)以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的另一个方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的培养基，以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量，在所述培养基中培养了发酵乳杆菌的细胞或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞。
本公开的进一步的方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)以及培养了发酵乳杆菌的细胞的培养基，以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的又一个方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)，以及培养了发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞的培养基，以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的另一个方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的
以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的进一步的方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的LLL以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的另一个方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的
或LLL的上清液级分或细胞级分，以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的特定方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的
或LLL的上清液级分，以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的进一步的方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的级分52以增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量。
本公开的另一个方面提供了改善动物(包括人)患者的肠道健康的方法，其包括向患者施用有效量的级分52内的一种或多种化合物，其表现出增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量的能力。
如本文所用，术语“改善肠道健康”包括：(1)防治性使用本公开的产品来刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长，以预防或减轻肠道病症如生态失调的发生，以及(2)使用本公开的产品来刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长，以治疗肠道和GI道的病症，包括抗生素相关性腹泻、生态失调、肠易激综合征(IBS)和炎性肠病(IBD)。
本公开的一个方面提供了药物组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的进一步的方面提供了药物组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)，包括LB乳杆菌的细胞(例如死细胞)，以及一种或多种药学上可接受的载体或辅料，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的另一个方面提供了药物组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞或培养了发酵乳杆菌的细胞和德氏乳杆菌的细胞的培养基，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的另一个方面提供了药物组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)和培养了发酵乳杆菌的细胞的培养基，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(如人)肠道中双歧杆菌的量改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的又一个方面提供了药物组合物，其包含发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(例如，死细胞)，以及培养了发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞的培养基，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的另一个方面提供了药物组合物，其包含有效量的
所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的又一个方面提供了药物组合物，其包含有效量的LLL，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的另一个方面提供了药物组合物，其包含有效量的
或LLL的上清液级分或细胞级分，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的特定方面提供了药物组合物，其包含有效量的
或LLL的上清液级分，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的进一步的方面提供了药物组合物，其包含有效量的级分52，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
本公开的另一个方面提供了药物组合物，其包含有效量的级分52内的一种或多种化合物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物用于通过增加哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的量来改善动物(包括人)患者的肠道健康。
附图说明
图1显示了在补充有水、乳酸、乳糖或
的容器中24小时粪便发酵之前和之后的双歧杆菌负载和总计数当量(equivalent)。
图2A显示了
对10x稀释培养基中一系列婴儿和成人相关性双歧杆菌株的生长的影响。图2B显示了
组分[上清液，细胞和低乳糖
(LLL)]对在10x稀释培养基中的生长的影响。图2C显示了
剂量对在10x稀释培养基中的生长的影响。图2D和图2E显示了酶处理或物理处理的
对在10x稀释培养基中的生长的影响。图2F显示了
样制剂对在10x稀释培养基中的生长的影响。图2G显示了LLL和发酵乳杆菌(Lb.fermentum)组分[上清液，细胞和透析]对在15x稀释培养基中的生长的影响。
图3A和3B显示了益生菌对长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)ATCC15697(B1)在15倍稀释培养基中的24小时生长的影响。
图4A、4B和4C显示了在长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的24小时生长上的
发酵乳杆菌、发酵乳杆菌APC249和LLL的SPE C18纯化。
图5显示了铵沉淀级分d C18纯化对在10x稀释培养基中的双歧杆菌生长的影响。
图6显示了通过尺寸排阻柱的
及其级分的UV吸收色谱图。
图7显示了响应于C-18纯化的1/2强度
的PHPLC级分的双歧杆菌生长(15x稀释培养基)。
图8显示了对C18纯化的
的级分52和周围级分的MALDI TOF质谱法结果。
图9显示了
样制剂对双歧杆菌的24小时生长(15x稀释培养基)的浓度影响。图9A显示了在
重量当量的整个和一半时发酵乳杆菌株的上清液的作用。图9B显示了在
重量当量的整个和一半时细胞和上清液的组合的作用。
图10显示了浓缩的MRS制剂(cMRS；3.4g/10ml水)对10x稀释培养基(图10A)和15x稀释培养基(图10B)中双歧杆菌的生长的影响。
发明详述
本公开涉及刺激哺乳动物(例如人)肠道中双歧杆菌的生长，从而帮助维持和改善肠道健康的微生物组合物。
在一个方面，本公开的合适组合物包括发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)，或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌，包括LB乳杆菌的细胞(例如死细胞)的混合物。
本公开的特定组合物包括
在另一个方面，本公开的合适组合物包括
LLL或发酵乳杆菌的组分。
在特定方面，合适的组合物包括
LLL或发酵乳杆菌的上清液和/或细胞。
本公开的特定组合物包括
或LLL的上清液的级分。特别感兴趣的一个此类级分是级分52。
在另一个方面，本公开的合适组合物包括级分52内的一种或多种化合物，其负责刺激哺乳动物(例如人)肠道中有益双歧杆菌的生长。
在进一步的方面，本公开的合适组合物包括培养了发酵乳杆菌的细胞或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)的培养基。
在另一个方面，本公开的合适的组合物包括发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)以及培养了发酵乳杆菌的细胞的培养基。
在又一个方面，本公开的合适组合物包括发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)，以及培养了发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞的培养基。
本文提到的生物保藏被保藏于法国国家微生物保藏中心(Collection Nationalede Cultures de Microorganismes，CNCM)，位于巴斯德研究所(Institut Pasteur),25-28rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15。发酵培养基中的LB乳杆菌以参考代码MA65/4E保藏于CNCM(MA65/4E-1b：发酵乳杆菌，MA65/4E-2z：德氏乳杆菌)。MA65/4E于1991年8月26日保藏。根据《布达佩斯条约》，LB乳杆菌的两个个体细菌株被记录为发酵乳杆菌CNCMI-2998(参考：MA65/4E-1b；初始保藏日期：1992年8月26日；为符合布达佩斯条约的转换日期：2003年3月27日)和德氏乳杆菌CNCMI-4831(参考：MA65/4E-2z；初始保藏日期：1992年8月26日；要求转换初始保藏以符合布达佩斯条约：2013年12月20日；2014年1月9日签发转换收据)。
死的LB乳杆菌细胞可以通过将发酵培养基中的活细胞在约110℃下加热约1小时而获得。发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或其混合物的死细胞可以通过类似的方式通过热杀伤过程获得。
当作为混合物使用时，发酵乳杆菌与德氏乳杆菌的重量比可以是约99:1至约1:99的任何合适比率，例如约9:1至1:9，包括9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9。发酵乳杆菌与德氏乳杆菌的重量比可以特别地是约9:1。
发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或其混合物(包括LB乳杆菌)的死细胞也可以通过省略干燥步骤或用适当的液体(如水)重构干燥产品，以液体形式使用，含或不含乳糖。
级分52是通过尺寸排阻HPLC获得并用C18进行多次运行纯化的
或LLC的上清液的级分；在MALDI TOF质谱法上，级分52具有在5200m/z左右的单峰(如在5237.08m/z)。
在一个方面，发酵乳杆菌、德氏乳杆菌或其混合物(包括LB乳杆菌)的细胞(例如死细胞)以足以实现期望效果的量存在于本公开的组合物中。在本公开的一个示例性实施方案中，LB乳杆菌株的死细胞以约10亿或更多个细胞/g，例如约100亿至约1000亿个细胞/g，包括约400亿至约800亿个细胞/g(例如约600亿个细胞/g)的比例存在于本公开的组合物中。
本公开的组合物可以口服施用，并且以合适的剂量，这将根据受试者的年龄、体重和性别、待治疗的疾病以及施用持续时间和施用途径等因素而变化。经过正常培训的医生或兽医可以很容易地确定并为各自的人或非人动物患者开出本公开的药物组合物的有效剂量。本公开的药物组合物在合适的剂型下可以方便地每日一次或两次施用于患者。在婴儿或较年幼的儿童中，基于20至40公斤的体重，可以施用为成人剂量的大约1/2，并且基于小于20公斤的体重，可施用为成人剂量的大约1/4。
本公开的组合物的方便单位剂量，例如以标准药物剂型，如胶囊、或片剂、或小袋，可以是高达约2000mg的任何有效剂量，每日一次或两次施用于成年患者。
本公开的组合物也可作为食物或营养补充剂或在食物，例如酸奶中施用。在这种情况下，可以摄取高达约100g的极高的剂量。
本公开的药物组合物可以使用药学上可用的载体和/或赋形剂配制，并根据本领域普通技术人员可以轻松执行的方法制备成单位容量或包含在高剂量容器中。这里，剂型可以是片剂、胶囊、颗粒、粉末、含有粉末的小袋，或液体如含有水性介质的溶液、悬浮剂或乳剂。
例如，在一个方面，为了将药物组合物配制成胶囊，发酵乳杆菌的干燥(例如冻干)细胞，或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞的混合物，包括LB乳杆菌，(任选地连同发酵培养基和/或冻干添加剂)可以与一种或多种合适的、无毒的药学上可用的非活性载体和赋形剂混合。实例包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、稀释剂、着色剂和干燥剂。合适的粘合剂可以是但不限于天然糖，如淀粉、明胶、葡萄糖或β-乳糖，天然或合成胶，如玉米甜味剂、阿拉伯胶、西黄蓍胶或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠或氯化钠。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土或黄原胶。合适的润滑剂包括滑石粉和硬脂酸镁。合适的干燥剂包括硅酸，合适的稀释剂包括乳糖，如无水乳糖。合适的冻干添加剂包括乳糖一水合物和金属碳酸盐，如碳酸钙。该产品混合物可以包含在任何标准的胶囊壳中，如明胶胶囊中。
在另一个方面，本公开的药物组合物，为用于口服悬浮剂的粉末形式，可以通过将发酵乳杆菌的干燥(例如冻干)细胞，或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞(任选地连同发酵培养基和/或冻干添加剂)与一种或多种合适的、无毒的药学上可用的非活性载体和赋形剂混合制备。实例包括稀释剂、调味剂、甜味剂和干燥剂。合适的干燥剂包括硅酸，合适的稀释剂包括乳糖，如无水乳糖或蔗糖，后者也可以作为甜味剂。合适的冻干添加剂包括乳糖一水合物和金属碳酸盐，如碳酸钙。粉末产品可以包含在任何标准的小袋中，准备与可饮用液体混合。
用于口服施用的组合物也可以是液体或固体食物或营养产品(例如营养补充剂)的一部分。实例包括乳、酸奶或酸奶式产品、奶酪、冰淇淋、基于谷类的产品、基于乳的粉末、营养配方奶(formula)、婴儿配方奶、营养配方奶、干燥口服粗粉(grit)或粉末、湿口服糊剂或果冻、用于干管喂养的粗粉或粉末或用于湿管喂养的液体。
此外，任选的额外活性成分也可以存在用于本公开的组合物中。任选的活性成分包括，例如，维生素、抗生素、益生菌或益生元。额外的活性成分和本公开的组合物可以共同施用或作为个体组合物分别施用(例如按顺序)。或者，可以将活性成分与发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)或发酵乳杆菌和德氏乳杆菌(包括LB乳杆菌)的细胞(例如死细胞)的混合物，任选地连同发酵培养基和/或冻干添加剂掺入到相同的组合物中。
本公开的组合物及其级分对于维持健康的哺乳动物(例如人)肠道，以及对于治疗可以通过增加肠道中双歧杆菌的量而有帮助的病症，包括抗生素相关性腹泻、生态失调、肠易激综合症(IBS)和炎性肠病(IBD)特别有用。
以下是本公开的具体实施方案。
实施方案1：保护人或非人动物受试者免于肠道病症发展的方法，包括向所述受试者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案2：保护人或非人动物受试者免于肠道病症发展的方法，包括向所述受试者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞和德氏乳杆菌的细胞，以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案3：根据实施方案1或2的方法，其中所述发酵乳杆菌和/或德氏乳杆菌的细胞是死细胞。
实施方案4：保护人或非人动物受试者免于肠道病症发展的方法，包括向所述受试者施用有效量的产品
以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案5：保护人或非人动物受试者免于肠道病症发展的方法，包括向所述受试者施用有效量的已经培养发酵乳杆菌的细胞(如死细胞)和德氏乳杆菌的细胞(如死细胞)的培养基的上清液，以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案6：保护人或非人动物受试者免于肠道病症发展的方法，包括向所述受试者施用有效量的实施方案5的上清液的级分52，以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案7：根据实施方案1-6中任一项的方法，其中所述受试者是健康人。
实施方案8：治疗人或非人动物受试者中的肠道病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案9：治疗人或非人动物受试者中的肠道病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的发酵乳杆菌的细胞和德氏乳杆菌的细胞，以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案10：根据实施方案8或9的方法，其中所述发酵乳杆菌和/或德氏乳杆菌的细胞是死细胞。
实施方案11：治疗人或非人动物受试者中的肠道病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的产品
以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案12：治疗人或非人动物受试者中的肠道病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的已经培养发酵乳杆菌的细胞(例如死细胞)和德氏乳杆菌的细胞(例如死细胞)的培养基的上清液，以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长。
实施方案13：治疗人或非人动物受试者中的肠道病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的实施方案12的上清液的级分52，以刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长，其中级分52是通过尺寸排阻HPLC获得并用C18多次运行纯化的
或LLC的上清液的级分；于MALDI TOF质谱法，它具有在5200m/z左右的单峰(如在5237.08m/z)。
实施方案14：根据实施方案8-13中任一项的方法，其中所述受试者是人。
实施方案15：根据实施方案8-14中任一项的方法，其中所述肠道病症选自抗生素相关性腹泻、生态失调、肠易激综合征(IBS)和炎性肠病(IBD)。
实施方案16：组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案17：根据实施方案15的组合物，还包含德氏乳杆菌的细胞。
实施方案18：组合物，其包含已经培养发酵乳杆菌的细胞生长的培养基，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案19：组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞和已经培养发酵乳杆菌的细胞的培养基，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案20：组合物，其包含发酵乳杆菌的细胞和德氏乳杆菌的细胞，以及已经培养发酵乳杆菌的细胞和德氏乳杆菌的细胞的培养基，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案21：根据实施方案16-20中任一项的组合物，其中所述发酵乳杆菌和/或德氏乳杆菌的细胞是死细胞。
实施方案22：组合物，其包含
所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案23：组合物，其包含已经培养发酵乳杆菌的细胞(如死细胞)和德氏乳杆菌的细胞(如死细胞)的培养基的上清液，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案24：组合物，其包含实施方案22的上清液的级分52，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善人或非人动物受试者的肠道健康。
实施方案25：根据实施方案16-24中任一项使用的组合物，其中所述受试者是健康人。
实施方案26：根据实施方案16-24中任一项使用的组合物，所述组合物用于治疗肠道病症。
实施方案27：根据实施方案16-24中任一项使用的组合物，所述组合物用于治疗人受试者的肠道病症。
实施方案28：根据实施方案26或27使用的组合物，其中所述肠道病症选自抗生素相关腹泻、生态失调、肠易激综合征(IBS)和炎性肠病(IBD)。
实施方案29：根据实施方案16-28中任一项使用的组合物，其中所述组合物是药物组合物、食物补充剂或营养补充剂的形式。
实施方案30：根据实施方案29使用的组合物，其中所述食物补充剂或营养补充剂包含在选自以下的食物内：乳、酸奶或酸奶式产品、奶酪、冰淇淋、基于谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方奶、营养配方奶、干燥口服粗粉或粉末、湿口服糊剂或果冻、用于干管喂养(dry tube feeding)的粗粉或粉末或用于湿管喂养(wet tube feeding)的流体。
虽然本文已参照某些示例性实施方案和具体实施例对本公开进行了描述，但本领域技术人员将理解，可以对其中的形式和细节进行修改而不背离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1
粪便发酵-冷冻标准化接种物(FSI)的制备
以与O'Donell MM等人，在Journal of Microbiological Methods.(2016)第9卷,第9-16页中描述的方法类似的方式制备冷冻标准化接种物。简而言之，志愿者/捐赠者(n＝5)遵守严格的标准：所有捐赠者均是健康成人，并且在捐赠前的六个月没有服用抗生素。将捐赠者的粪便样品收集到塑料容器中，放置在装有厌氧条件发生器(GENbox anaer,BioMerieux,France)的拉链袋中，并在4℃下贮存。在平均9小时内，将粪便样品转移到缺氧气氛(10％H2,0％O2,0％N2)下的厌氧室(Don Whitley,West Yorkshire,UK)。将粪便合并到厌氧室中的带有70μm过滤器挿入物的Stomacher大袋中(Sparkslabsupplies,Ireland)。向Stomacher袋中添加400毫升的具有0.05％(w/v)l-半胱氨酸盐酸盐(Sigma Aldrich,Ireland)的50mM磷酸盐缓冲液pH 6.8(进一步称为磷酸盐缓冲液)，然后手动均质化样品。然后将过滤后的浆液在Sorvall SLA-3000离心机中以4000x g离心25分钟，并再次在厌氧柜中在400ml磷酸盐缓冲液中重悬浮。接下来，进行第二次离心(4000x g，25分钟)，然后在400ml磷酸盐缓冲液中重悬浮。然后将所得粪便细菌悬浮液用200ml甘油补充，等分并在-80℃下冷冻1-9周直至使用(以下称为FSI)。除离心步骤外，所有处理均在厌氧柜中进行。在使用FSI之前，在接种到发酵容器之前，将等分试样在37℃下解冻0.5-1小时。
粪便发酵-远端结肠模型
按照Fooks LJ和Gibson GR在Anaerobe(2003)第9(5)卷,第231-42页中的描述制备补充有淀粉的粪便培养基，发酵容器中的最终浓度(总体积200ml)为每升：2g蛋白胨、2g酵母提取物、0.76g NaCl、0.04g K2HPO4、0.04g KH2PO4、0.007g CaCl2·2H2O、0.01gMgSO4·7H2O、2g NaHCO3、2ml Tween 80、0.5g L-半胱氨酸-HCl、0.5g胆盐、10g可溶性淀粉、0.05g氯化血红素(溶于三滴1M NaOH)和10μl维生素K1(Sigma Aldrich)。180ml基础培养基补充有3.4g/100ml
(对应于10袋/胶囊的
100ml中340mg)，或等量的乳酸(30mM)、乳糖(36mM)或水作为对照。需要时添加水，使体积达到187.5ml。将培养基添加到MultiFors系统(Infors，UK)的发酵容器中，将其pH调整到6.8，并且每个容器用无氧N2喷洒至少120分钟以确保建立厌氧条件。用12.5ml FSI来接种每个容器。发酵在37℃下进行24小时，通过自动添加1M NaOH或1M HCl维持恒定的pH；用无氧N2喷洒，并以200rpm持续搅动。在T0、发酵1小时(T1)、2小时(T2)、3小时(T3)、4小时(T4)、5小时(T5)、6小时(T6)、22小时(T22)和24小时(T24)后从每个容器中提取样品，并在-80℃下贮存直到处理。每种条件至少一式三份测试。
DNA分离
根据制造商的建议并稍作修改，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini试剂盒(Qiagen,Germany)从粪便发酵样品进行DNA分离，将使用的珠磨(FastPrep-24,MPBiomedicals,United States)溶液的体积增加到600μl，并将最终洗脱体积减少到30μlTAE。通过使用Qubit dsDNA BR Assay Kit测量DNA浓度和在凝胶上运行5μl样品进行质量评估，来评估DNA的数量和质量。
16S宏基因组学-微生物群分析
DNA扩增、索引、标准化和测序
按照Warda AK等人，在Behavioural brain research(2018)第362卷,第213-23页中的描述进行文库制备。使用Phusion Polymerase Master Mix和V3和V4(正向5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’(SEQ ID NO:1)；反向5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’(SEQ ID NO:2))引物扩增16S基因的V3-V4区域(98℃30s；98℃10s，55℃15s，72℃20s的25个循环；72℃5min)。通过QubitdsDNA HS Assay Kit和在凝胶上运行来检查扩增子的质量和数量，并用Ampure XP磁珠进行清洗。使用Phusion Polymerase Master Mix和Nextera XT Index Kit将5μl经清洗的扩增子作为模板进行索引PCR(95℃30s；95℃30s，55℃30s，72℃30s的8个循环；72℃5min)。带索引的扩增子用Ampure XP磁珠清洗，并通过Qubit dsDNA HS Assay Kit和在凝胶上运行来检查质量和数量。所有样品在水中标准化至4nM，然后将每个样品的5μl合并在一起，送往GTAC(Germany)进行Illumina MiSeq测序。
16S数据分析
用FastQC v0.11.3对原始读段的质量进行可视化。然后根据Callahan BJ等人，在Nat Methods(2016)第13(7)卷,第581-3页中，将读段输入R v3.3.0用于用DADA2包(v1.03)进行分析。对测序过程中引入的错误进行校正，以生成核糖体序列变体(RibosomalSequence Variant，RSV)。将这些变体导出，并使用具有ChimeraSlayer黄金数据库v20110519的USEARCH v8.1.1861中实现的从头和基于参考的嵌合体过滤法进行进一步的嵌合体过滤。剩余的RSV用mothur v1.38[参见Schloss PD等人，在Applied andenvironmental microbiology(2009)第75(23)卷,第7537-41页中]针对RDP数据库版本11.4进行分类，以及用SPINGO分类到种水平[参见Allard G等人，在BMC bioinformatics(2015)第16卷,第324页中]。仅将具有细菌或古细菌的域分类的RSV保留下来用于进一步分析。用FastTree[参见PriceMN等人，在Molecular biology and evolution(2009)第26(7)卷,第1641-50页中]生成以中点为根的RSV序列的系统发育树。α多样性和β多样性使用PhyloSeq v1.16.2生成，所述PhyloSeq v1.16.2也用于主坐标分析，如Ape v3.5中实现的。使用用于RSV水平的DESeq2 v1.12.4[见Love MI等人，在Genome Biol.(2014)第15(12)卷,第550页中]和用于门到属的Wilcoxon检验进行差异丰度分析。必要时使用benjaminihochberg方法调整P值。R中的所有可视化均用ggplot2v2.2.1进行。本公开文本中讨论的测序数据已保藏于序列读段档案(Sequence Read Archive，SRA)中，并且可通过登录号PRJNA545405获取。
qPCR
使用分离的DNA来相对地量化微生物总负载和双歧杆菌负载。使用LightCycler480板和黏性盖(Roche)，在384孔LightCycler 480PCR(Roche)上运行反应物。每个15μl反应物含有6.5μl水、7.5μl 2X SensiFASTTM SYBR No-ROX Master Mix(Bioline)、每种10μM引物(正向和反向)0.3μl和1μl DNA样品。使用水代替DNA来制备无模板对照(NTC)。在使用前稀释样品100倍。每个反应物均一式四份运行。用于总计数的引物U16SRT-F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3(SEQ ID NO:3)、U16SRT-R(5-TATTACCGCGGCTGCTGGC-3(SEQ IDNO:4))，以及用于双歧杆菌定量的引物Bif-xfp-F1(5-CGTCCGTTCTACCCGATG-3(SEQ ID NO:5))、Bif-xfp-R1(5-GGTCTTCTTGCCGTCGAT-3(SEQ ID NO:6))。循环参数为95℃5分钟，然后是45个循环的95℃10秒，60℃30秒，72℃30秒。在每个程序结束时都包括熔解曲线分析(60至97℃)以消除非特异性扩增。使用仪器软件自动计算交叉点(Cp)值和熔化温度。使用10倍稀释的从10ml过夜培养的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697培养物中分离的DNA检查引物的效率，导致U16SRT和Bif-xfp引物的E分别等于95.7％和95.5％。使用相同的稀释范围作为两组微生物的标准曲线，以使CFU/ml与Cp值相关联。同时，根据长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697基因组中的4个16S基因拷贝计算16S rRNA拷贝/ml[根据rrnDB数据库，细菌基因组的平均拷贝数为4.9(https://rrndb.umms.med.umich.edu/；2018年12月12日录入)]。
代谢物分析
样品在冰上解冻，并以最大速度离心1分钟。将上清液通过0.2μm过滤器过滤，转移到HPLC容器中并在-20℃下贮存直到测量。样品分析通过MS-Omics如下进行：对于SCFA分析，样品用盐酸进行酸化，并在此添加氘标记的内部标准品。所有的样品以随机的顺序进行分析。使用安装在与四极检测器(5977B,Agilent)耦合的GC(7890B,Agilent)上的高极性色谱柱(ZebronTMZB-FFAP,GC Cap.Column 30m x 0.25mm x 0.25μm)进行分析。对于突出的代谢物分析，使用Smart等人(DOI:10.1038/nprot.2010.108)描述的方案，用氯甲酸甲酯对样品进行衍生化。所有的样品以随机的顺序进行分析。使用与四极质谱检测器(5977B,Agilent)耦合的气相色谱法(7890B,Agilent)进行分析。在这两种情况下，系统都是由ChemStation(Agilent)控制。在使用Chemstation(Agilent)将原始数据转换为netCDF格式，然后使用Johnsen等人，在Journal of chromatography A.(2017)第1503卷,第57-64页中描述的PARADISe软件，在Matlab R2014b(Mathworks,Inc.)中对数据进行导入和处理。
结果
微生物变化-16S rRNA基因宏基因组学
从发酵期间收集的样品中分离DNA，并进行16S rRNA基因扩增子测序。在属水平上，观察到所有实验容器中在发酵开始时的高多样性，代表了人肠道微生物组的高多样性。在时间上，所有容器中的组分逐渐变化，其中水容器中的变化最慢，而乳酸和
容器中的变化最快。事实上，在埃希氏菌属/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)最初增加后，双歧杆菌的相对丰度在
容器中发生急剧增加，并且在其他容器中程度较小。虽然观察到的变化在重复的容器中是可重现的，但无法检测到科水平(family level)的显著变化(Wilcoxon检验)，这可能是由于每组的样品数量有限。在属水平上，观察到水容器中24小时内的一些统计学上显著的变化(Wilcoxon检验)，对于这个条件，进行了四次重复，并且这最可能增加了该组的效能(power)。类似地，如通过Chao1和Shannon指数测量，α-多样性也在时间上明显下降。这种α-多样性的下降最可能反映了封闭系统中发生的物种的自然损失。然而，在选定的分类群的显著过度生长的情况下，也可以观察到α-多样性的下降，因为剩余分类群的水平可能落到低于检测水平。尽管如此，未观察到在0、6和24小时测试的条件之间α-多样性的统计学上显著的变化，以及个体条件在时间上的变化。除了具有四次重复的水容器外，每个条件的重复数有限可能也是原因。
为了进一步研究个体之间的微生物群多样性(β多样性)，使用了主坐标分析(PCoA)方法。它显示在实验的24小时期间微生物群组成发生了明显的转变，表明发酵的长度对多样性有重大影响，PC1解释了66.07％的变异，正如在封闭系统中所预期的。在开始时，所有的容器均牢固地聚簇在一起，再次表明开始的条件是良好标准化的。在发酵结束时，微生物群沿着PC2扩散(解释了12.44％的变异)。特别是，来自
容器的微生物群连同来自乳糖容器的微生物群聚簇在PC2轴的顶部，而来自乳酸容器的微生物群连同来自水容器的微生物群聚簇在PC2轴的下部(图2)。观察到在0、6和24小时测试的条件之间β-多样性的无统计学显著的变化，以及对于个体条件在时间上的变化。再一次，每个条件的重复数有限可能是原因。
最后，在RSV水平的分析允许评估更具体的分类学差异。与水容器相比，
容器中26种RSV的丰度增加，而33种RSV的丰度减少。同时，与水容器相比，乳酸和乳糖容器中分别仅3种和14种RSV的丰度变化。特别是，在
容器中增加的6种RSV分配到双歧杆菌属，并且仅其中一个，即长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，可以分配到种水平。与水容器相比，在乳糖容器中分配到双歧杆菌属的五种RSV的水平增加，它们中仅三种与
容器重叠。
在时间上分析丰度变化导致在至少一个条件下丰度不同的302种RSV。特别是，在所有条件下，36种RSV随时间增加，而108种RSV减少。8种RSV在
容器中特异性变化，20种RSV在乳糖中特异性变化，在乳酸中4种RSV特异性变化并且在水容器中19种RSV特异性变化。
在发酵开始时，任何容器之间的双歧杆菌水平(One-way ANOVA；F3,8＝0.912,p＝0.477)和总细菌负载(One-way ANOVA；F3,8＝0.074,p＝0.972)没有差异(图1)。24小时发酵后，容器之间的双歧杆菌水平存在差异(Kruskal-Wallis检验，p＝0.031)(图1)。补充有水的和补充有
的容器中的双歧杆菌水平有明显的差异(手动事后分析，多重比较的P值受控，P＝0.007<α/k)，而所有其他容器之间的其他差异不明显。另外，在时间上，每个容器中的双歧杆菌增加不显著(Related Samples Wilcoxon signed Rank Test，p＝0.109)。同时，容器补充对24小时发酵时的总细菌负载没有明显影响(Welch检验，p＝0.108；Brown-Forsythe，p＝0.285)(图1)。随时间也没有变化(Related Samples Wilcoxonsigned Rank Test，p≥0.109)。
代谢物的变化
对发酵过程的监测显示，与乳酸或水对照相比，在
存在下，控制pH所需的NaOH量(以及延长的要求)大约高出四倍。这表明，在
存在下，发酵过程导致产生更多的酸，而且将这个过程维持更长的时间。为了阐明发酵之前和之后存在于容器中的化合物的性质，进行了代谢组学分析。发酵开始时从补充有水、乳酸和乳糖的容器中收集的样品紧密地聚簇在一起，而来自
容器的样品产生单独的聚簇。特别是，最初，与水容器相比，33种注释的化合物在
容器中的水平升高。24小时发酵后，所有容器中的代谢组成均发生变化，
容器中的变化最明显。在这个阶段，与水容器相比，39种注释的化合物在
容器中的含量显著更高。
短链脂肪酸(SCFA)
为了确定所产生的代谢物的性质，我们专注于SCFA，且特别是丁酸，丁酸以其有益作用而著称。在发酵开始之前，个别的SCFA的水平较低，并且我们观察到容器之间的乙酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.037；事后Bonferroni p>0.05)、异丁酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.023；事后Bonferroni p>0.05)和戊酸(Kruskal-Wallis检验p＝1.000)水平没有差异。与乳酸容器相比，在
容器中我们检测到的丁酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.030；事后Bonferroni p＝0.050)和丙酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.026；事后Bonferroni p＝0.016)的水平略高，但与水或乳糖容器相比没有差异(Kruskal-Wallis检验p<0.05；事后Bonferroni p>0.05)。甲酸的水平仅在乳酸和乳糖容器之间有差异(Kruskal-Wallis检验p＝0.012；事后Bonferroni p＝0.013)。24小时发酵后，与所有其他容器相比，我们观察到
容器中的乙酸水平升高。此外，24小时发酵后，与水和乳糖容器相比，
容器中的甲酸水平显著更高。发酵后，容器之间的丙酸(F(3,9)＝0.382，p＝0.769)、丁酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.401)、异丁酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.094)和戊酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.205)水平没有显著差异。所有样品中的异戊酸、己酸和庚酸的水平均低于检测下限(LOD)。此外，发酵前的戊酸浓度也低于LOD。
TCA循环
发酵前，与水相比，在
容器中检测到琥珀酸水平升高(Kruskal-Wallis检验p＝0.018，事后Bonferroni p＝0.010)，在乳糖容器中检测到富马酸水平升高(F(3,9)＝5.599，p＝0.019；事后Bonferroni p＝0.017)。正如预期的那样，与水相比，乳酸容器中的乳酸水平更高(Kruskal-Wallis检验p＝0.010，事后Bonferroni p＝0.008)。乳酸水平在
容器中有所增加，但没有通过多重比较标准(Kruskal-Wallis检验p＝0.010，成对比较事后Bonferroni p＝0.028，多重比较调整事后Bonferroni p＝0.171)。在乳酸和乳糖容器之间检测到丙酮酸的差异(Kruskal-Wallis检验p＝0.013，事后Bonferroni p＝0.019)。24小时发酵后，与水相比，在
容器中的富马酸(Kruskal-Wallis检验p＝0.025，事后Bonferroni p＝0.035)、琥珀酸(F(3,9)＝22.239，p<0.0005；事后Bonferroni p<0.0005)和乳酸(F(3,9)＝120.294，p<0.0005；事后Bonferronip<0.0005)的水平升高。与水相比，乳酸(F(3,9)＝120.294，p<0.0005；事后Bonferroni p＝0.001)和乳糖(F(3,9)＝120.294，p<0.0005；事后Bonferroni p<0.0005)容器中的乳酸水平也升高，但没有达到
容器中的水平(事后Bonferroni p<0.0005)。在发酵前和/或发酵后，对剩余六种TCA循环化合物的测量在各容器之间没有差异(Kruskal-Wallis检验p>0.05)。
氨基酸
发酵前，与水容器相比，19种测试的氨基酸中的12种在
容器中具有升高的水平。特别是，与所有其他容器相比，
容器中的色氨酸水平更高(F(3,9)＝17.431，p<0.0005；事后Bonferroni p≤0.006)。发酵后，与水容器相比，19种测试的氨基酸中的10种在
容器中具有升高的水平。
其他代谢物
发酵前，与水容器相比，61种测试的鉴定和注释的化合物中的20种在
容器中具有升高的水平。发酵后，与水容器相比，61种测试的鉴定和注释的化合物中的26种在
容器中具有升高的水平。
结论
实施例1研究了
对接种有人粪便样品的厌氧批量培养物中微生物群组成的影响。已知
含有乳酸(其由发酵乳杆菌和德式乳杆菌在初始发酵过程中生成)以及乳糖(其在生产后添加以促进冻干过程)。因此，作为除水之外的额外对照，我们包括了分别用乳酸和乳糖的补充。微生物组和代谢物分析两者指示，发酵前收集的样品的紧密聚簇，一方面证实了制剂的可重现性，另一方面也证实了人肠道微生物组的高组成多样性。正如预期，我们看到容器之间在微生物组方面没有差异。然而，
容器显示出代谢物谱的改变，主要是就氨基酸水平的升高而言，使这种情况与对照分开。
在时间上，所有容器中的微生物组和代谢物谱均发生变化，其中
容器的变化最为明显。在24小时发酵过程中，
补充增加双歧杆菌的相对丰度和绝对丰度两者。与
容器中的这种扩增相一致，我们观察到先前显示由双歧杆菌产生的醋酸、甲酸和乳酸的水平增加。双歧杆菌或SCFA的存在通常被认为是有益的。
实施例2
在生长实验中，使用重构的
粉末(0.34g/ml)。或者，使用低乳糖
(LLL)。除非另有说明，每个制剂含有每ml溶液5x109至1x1010个细胞体。
双歧杆菌接种物的制备
将100μl的-80℃的双歧杆菌株(表1)的原液注入含有10ml补充有L-半胱氨酸(终浓度为0.6g/L)和rezuzarin(终浓度为1mg/L)的MRS肉汤(Difco,BD)的厌氧Hungate管中。在37℃将管温育过夜。除非另有说明，否则使用100μl的100倍稀释的过夜培养物作为接种物。对于两歧双歧杆菌LMG 11041株和高卢双歧杆菌(B.gallicum)APC 838株，由于过夜生长不良，使用100μl的10倍稀释的过夜培养物。
表1：本研究所使用的株
双歧杆菌生成测定(bifidogenic assay)
在厌氧Hungate管中的9ml补充有L-半胱氨酸(终浓度0.6g/L)和刃天青(resazurin)(终浓度1mg/L)的基础培养基(10倍或15倍稀释；当补充水时，对于双歧杆菌不生长或最小生长所需要的每批粉状培养基，设定稀释因子)MRS肉汤补充有1ml测试溶液(
制剂)或对照之一(主要是水)。接着，在对Hungate管接种，并用注射器和针头收集T0样品，以限制氧气的进入。Hungate管在37℃下温育，并定期取样。收集的样品在PBS中连续稀释，并将100μl一式两份铺板在补充有L-半胱氨酸(最终浓度为0.6g/L)的新鲜MRS琼脂板上。在菌落计数之前，将板在37℃在具有厌氧发生器(BioMerieux)的罐中培养至少48小时。
(a)酶处理
对5ml
溶液补充10mg蛋白酶K(添加1mM CaCl2·2H2O)、胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、溶菌酶或α-胰凝乳蛋白酶。
溶液的5ml细胞和上清液级分补充有1000单位纤维素酶、25单位α-葡萄糖苷酶、1000单位α-淀粉酶和125单位β-半乳糖苷酶。在37℃下将管摇动温育4小时，然后在92℃下1小时。经酶处理的
细胞和上清液级分贮存在4℃，直到在双歧杆菌生成测定中测试。用α-淀粉酶和β-半乳糖苷酶处理的上清液的pH在添加酶前提高到7.16，并温育后调整回原pH并过滤。将1ml经酶处理的细胞或上清液用于双歧杆菌生成测定(10倍稀释的培养基)。
(b)物理处理
透析
将5.1g重悬浮于15ml水中的
转移到经清洗的1kDa透析管中(Pur-A-Lyser Magna 1000,Sigma)。然后将该管置于4.5L去离子水中，并在4℃下转向温育4天。每天换水。将管中的内容转移到Hungate管中，并在4℃下贮存，直到用于双歧杆菌生成测定(10倍稀释的培养基)。
声处理
对
溶液进行离心，过滤上清液，并对细胞颗粒进行两次清洗。将上清液和细胞级分进行声处理4小时，并在4℃下贮存，直到用于双歧杆菌生成测定(10倍稀释的培养基)。
替代处理-益生菌
实验室制作的乳杆菌制剂的制备
将乳杆菌菌株(表1)从-80℃的原液中划线到MRS板上。用单个菌落接种10ml MRS肉汤，并在37℃下厌氧温育过夜。将1％的接种物用于具有补充有L-半胱氨酸(终浓度为0.6g/L)的MRS肉汤的烧瓶。用于德氏乳杆菌2z生长的培养基补充有1％来自酪蛋白的胃蛋白酶，以促进其生长需求。在37℃厌氧过夜温育后，将烧瓶的内容物分配到大的培养皿中，并放置在-80℃直到冻干。从板上刮下冻干的内容物，并重悬浮到0.34g/ml的水中，然后在110℃下热处理1小时(在
制备过程中应用热处理)，并在4℃下贮存直到使用。
市场产品对双歧杆菌的影响
市场产品的溶液以对应于其每日剂量的浓度制备。特别是，将一粒Culturelle胶囊的内容物(100亿个鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)GG的细胞和菊粉)重悬浮在1ml水中。将三瓶Enterogermina的内容物(SANOFI；60亿个克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)SIN、克劳氏芽孢杆菌O/C、克劳氏芽孢杆菌T和克劳氏芽孢杆菌N/R的芽孢)离心(10分钟，4696x g)并重悬浮在1ml的水中。将5滴BioGaia(108CFU的罗伊氏粘液乳杆菌DSM 17938)重悬浮在1ml的水中。将一粒Ultra Levure胶囊的内容物(BIOCODEX；200mg的布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)CNCM I-745)重悬浮在1ml的水中。将一粒
胶囊(340mg，100亿个发酵乳杆菌和德氏乳杆菌的细胞)的当量重悬浮在1ml水中。使用1ml的市场产品溶液来测试其在改良的双歧杆菌生成测定中的作用(15倍稀释的培养基)。将连续稀释的样品铺板在具有L-半胱氨酸(0.6g/L)、环己酰亚胺(70mg/L)和莫匹罗星(50mg/L)的MRS板上。对鼠李糖乳酪杆菌GG(从MRS计数中减去双歧杆菌计数)、克劳氏芽孢杆菌(铺板在BHI上，需氧培养)、罗伊氏乳杆菌DSM17938(MRS+四环素(30μg/ml)，厌氧)和布拉氏酵母菌CNCMI-745(Saboraud(4％葡萄糖)，需氧培养)进行产品计数的选择性列举。
固相萃取C18柱
在所有的C18纯化中，使用半强度的
制剂(相当于10ml中1.7g)，因为这是10g Strata C18固相萃取柱(Phenomenex)的最大结合容量。因此，除非另有说明，流动、清洗和洗脱级分均为半强度。将半强度的
在5000rpm下离心5分钟(ServallST16R，带TX-400转子)。得到的上清液用0.2μm的过滤器过滤以除去固体颗粒。将10g Strata C18固相萃取柱连接到真空泵上，用120ml的甲醇条件化，并用120ml的HPLC水进行平衡。将过滤后的上清液应用在柱上，通过重力作用允许其通过，并收集所得的流穿物。接下来，用120ml 5％的甲醇清洗柱，收集清洗。在柱真空干燥5分钟后，在柱上应用120ml的甲醇，洗脱仍然与吸附剂结合的级分，收集洗脱。将收集的清洗和洗脱级分旋转蒸发以去除溶剂，并将样品在水中浓缩到初始浓度。流穿物、清洗和洗脱级分进行过滤灭菌(0.2μm过滤器)并贮存在4℃直到使用。
硫酸铵沉淀
将低乳糖
(LLL)溶液(相当于10ml中的3.4g)以5000rpm离心10分钟(设备详情)。将得到的上清液通过0.2μm过滤器过滤，以去除固体颗粒。在室温下将3.18g硫酸铵(旨在达到50％的饱和度)逐渐溶解在10ml的上清液中，一式两份。在室温下摇动温育1个烧瓶6小时，并且温育第二个烧瓶1小时。接下来，烧瓶内容物在4℃下5000rpm离心15分钟。向第二个烧瓶中的上清液添加硫酸铵，使其达到60％的饱和度，并如先前一样进行培养。这种方法一直持续到达到80％的饱和度(达到90％饱和度所需的硫酸铵不溶解)。将在不同阶段收集的沉淀物溶解在10ml的缓冲液(150mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5)中，并在4℃下贮存，直到使用C18柱脱盐(见上文)。
HPLC分析
对原始样品进行HPLC分析
上清液样品在MilliQ水中以1比2(
和LLL)和1比7(发酵乳杆菌和德氏乳杆菌)稀释。将100μl等分试样应用于TosoHaas凝胶渗透柱(TSK凝胶G2000SW和G2000SWXL串联，5μ，7.8x 30cm)，以1ml/min运行30％乙腈等度梯度。HPLC洗脱液通过214nm的UV吸收进行监测，并在35分钟内以1分钟的间隔收集级分进行测定。
对C18纯化的样品进行HPLC分析
将27x 80μl等分的上清液样品(共2160μl)应用于TosoHaas凝胶渗透柱(TSK凝胶G2000SW和G2000SWXL串联，5μ，7.8x30cm)，在35分钟内以1ml/min运行30％乙腈0.1％TFA等度梯度。HPLC洗脱液通过214nm的UV吸收进行监测，并以1分钟的间隔收集级分。级分37-60在MALDI TOF质谱分析中测试，并在离心浓缩后在双歧杆菌生成测定中测试。
非双歧杆菌株的测试
将-80℃的屎肠球菌和大肠杆菌的原液分别划线在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA，生产者)和Luria-Bertani(LB，生产者)板上并在37℃下温育过夜。用单个菌落接种20ml的TSB或LB肉汤，然后在37℃下温育过夜。对含有9ml1.1倍MRS肉汤(0.6g/L L-半胱氨酸，1mg/L刃天青)或稀释范围的LB(在水中或PBS中)或PBS的厌氧Hungate管补充1ml水或1ml
溶液，并接种100μl 100倍稀释的过夜培养物。在37℃下温育过夜厌氧管。收集的样品经连续稀释，并在TSA或LB板上编排，然后在37℃下进行过夜有氧温育。
结果
双歧杆菌的生长取决于
的剂量(图2C；ANOVA；F5,11＝59.654,p<0.0005)。半强度
刺激生长的程度与
相同(Bonferroni事后，p＝1)，而100倍稀释的
中双歧杆菌的计数与水对照相同(Bonferroni事后，p＝1)。
的活性不受酶处理和通常用于灭活酶的热处理的影响(92℃下1小时)。经一系列蛋白水解酶处理的
制剂(图2D)以及经模拟处理的
(图2D)刺激纯培养物中的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的生长(ANOVA；F8,18＝73.582,p<0.0005；与水相比，Bonferroni事后，均p<0.0005；与
相比，均p＝1)(图2D)。用碳水化合物消化酶处理的
制剂的上清液和细胞级分(图2E)以及它们的模拟处理版本(图2E)刺激纯培养物中的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的生长(ANOVA；F10,22＝85.783,p<0.0005；Bonferroni事后，与水相比，均p<0.0005；Bonferroni事后，与
的上清液或细胞级分相比，均p>0.05)(图1E)。令人感兴趣的是，1kDa透析的
也刺激纯培养物中的长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的生长(图2D；ANOVA；F8,18＝73.582,p<0.0005；Bonferroni事后与水相比，p<0.0005)，但没有达到
的水平(ANOVA；F8,18＝73.582,p<0.0005；Bonferroni事后与
相比，p<0.0005)。声处理不影响
的上清液或细胞级分的活性(图2E；ANOVA；F10,22＝85.783,p<0.0005；Bonferroni事后，与水相比，均p<0.0005；Bonferroni事后，与
的上清液或细胞级分相比，均p＝0.05)。响应于
样制剂的24小时生长水平有差异(图2F；ANOVA；F10,21＝141.368,p<0.0005)。
和发酵乳杆菌1b可比较地刺激双歧杆菌的生长(Bonferroni事后，相互比较p＝1，与水相比p<0.0005)，而发酵乳杆菌APC249、德氏乳杆菌APC2421、德氏乳杆菌APC2516、罗伊氏乳杆菌APC2482不促进生长(Bonferroni事后，均p<0.0005)。人乳杆菌APC2512补充对双歧杆菌具有明显的杀伤作用，因为板上回收6个或更少的CFU。德氏乳杆菌2z和德氏乳杆菌保加利亚亚种APC2493具有与水补充相同的效果(Bonferroni事后，分别为p＝1和p＝0.060)。
对于LLL和发酵乳杆菌1b，上清液和完整制剂(含有上清液和细胞)同样刺激双歧杆菌的生长(图2G；ANOVA；F9,20＝113.988，p<0.0005；Bonferroni事后，p≥0.514)，但没有达到与
相同的水平(Bonferroni事后，p≤0.039)。LLL细胞(但不是发酵乳杆菌1b细胞)和LLL和发酵乳杆菌1b的非透析组分显示出可比较的中间双歧杆菌生长刺激(Bonferroni事后，相互比较p＝1，与水和
相比p≤0.036)。
商业益生菌制剂对双歧杆菌生长的影响
在与商业产品温育之前，各条件之间没有差异(ANOVA；F5,12＝0.627，p＝0.683)。24小时温育后，双歧杆菌计数差异显著(ANOVA；F5,12＝574.535，P<0.0005)。补充Culturelle防止双歧杆菌的恢复(Bonferroni事后与任何其他处理相比，p<0.0005)。Enterogermina和BioGaia对双歧杆菌计数没有影响，计数与水相当(与水相比，Bonferroni事后，分别为p＝0.192和p＝0.242，)。最后，Ultra Levure刺激双歧杆菌生长到与LLL相当的水平(Bonferroni事后与水相比，p<0.0005；Bonferroni事后与低乳糖
相比，p＝1)(图3A)。在24小时内，组成商业产品的微生物的数量没有变化：Culturelle(Wilcoxon检验，p＝0.109)，Enterogermina(t2＝1.941，p＝0.192)，BioGaia(t2＝0.595，p＝0.612)，和Ultra Levure(t2＝-0.253，p＝0.824)(图3b)。
SPE C18纯化
用C18柱的优化纯化方案处理半强度
上清液导致所得级分的双歧杆菌CFU计数差异(图4A；ANOVA，F5,12＝117.546，p<0.0005)。除了流穿物(Bonferroni事后p＝1)，所有级分与水对照相比显示出显著差异(Bonferroni事后p<0.0005)。与半强度
上清液相比，清洗级分和合并级分显示没有差异(Bonferroni事后分别为p＝1和p＝0.066)，表明活性级分存在于清洗级分中。半强度发酵乳杆菌1b(图4B；ANOVA，F5,12＝110.087,p<0.0005；Bonferroni事后p＝0.053)和半强度发酵乳杆菌APC249(图4B；ANOVA,F5,12＝57.473,p<0.0005；Bonferroni事后p＝1)显示出与半强度LLL上清液(以及它们自身的半强度上清液)相同水平的双歧杆菌生长刺激，而流动和洗脱级分没有显示生长刺激。当测试发酵乳杆菌1b的全强度清洗级分(半强度发酵乳杆菌1b的两倍浓缩清洗级分)时，我们观察到与LLL(图4C；ANOVA,F15,32＝189.939,p<0.0005；Bonferroni事后p＝1)和半强度发酵乳杆菌1b(Bonferroni事后p＝0.700)上清液相同的双歧杆菌生长刺激。虽然半强度发酵乳杆菌APC249上清液确实刺激双歧杆菌的生长(尽管没有达到全强度或半强度LLL和发酵乳杆菌APC249的水平)，但全强度发酵乳杆菌APC249上清液没有刺激双歧杆菌的生长(Bonferroni事后，与水相比分别为p<0.0005和p＝1)，表明发酵乳杆菌APC249上清液中存在浓度依赖性双歧杆菌抑制性(bifidostatic)化合物。然而，使用发酵乳杆菌APC249的全强度清洗级分(半强度发酵乳杆菌APC249的两倍浓缩清洗级分)，看到的双歧杆菌生长刺激与半强度LLL上清液相同(Bonferroni事后p＝1)，表明在C18纯化过程中至少部分去除双歧杆菌抑制性化合物。
硫酸铵沉淀
观察到双歧杆菌生长24小时后计数的差异(图5；独立样品Kruskal-Wallis，χ2(23)＝69.998，P＜0.0005)。从C18净化硫酸铵沉淀物的清洗1级分一直给出最高的双歧杆菌计数。硫酸铵浓度的每个逐步增加产生显示出与LLL和水相当的对双歧杆菌生长刺激的制剂。
在双歧杆菌生成测定中测试了用浓缩后的C18纯化半强度
运行多次HPLC期间收集的级分。级分52显示出有希望的结果，因为它具有较高的双歧杆菌计数。然而，这是单一的重复，阴性对照(浓缩的HPLC溶剂)显示双歧杆菌水平下降(图7)。
MALDI TOF质谱法显示，在级分51、52和53中出现了类似的谱，最明显的峰来自质谱测量设置，而不是来自测量的样品。在级分52中，我们看到范围为2500到3000m/z的质量出现增加，反映了未定义分子的存在。在级分52中存在5237.08m/z的单峰，但在邻近的级分中不存在(图8)。
当测试
样制剂的上清液时观察到差异(图9A；ANOVA；F15,32＝189.939,p<0.0005)。完全发酵乳杆菌APC249制剂的上清液没有刺激双歧杆菌的生长(Bonferroni事后，与水相比p＝1)，而其一半浓度确实刺激生长(Bonferroni事后，与水相比p<0.0005)，尽管没有达到发酵乳杆菌1b和LLL的完全(Bonferroni事后，与LLL相比p＜0.0005，与发酵乳杆菌1b相比p＝0.024)和半强度上清液(Bonferroni事后，与1/2LLL上清液相比p＝0.009，与1/2发酵乳杆菌1b上清液相比p＜0.0005)的水平。当使用含有上清液和细胞的制剂时，也观察到对双歧杆菌24小时生长的浓度依赖性影响(图9B；ANOVA；F12,26＝120.838,p<0.0005)。德氏乳杆菌APC2421、德氏乳杆菌APC2516和罗伊氏乳杆菌APC2482的完全浓度不能刺激双歧杆菌的24小时生长(Bonferroni事后，与水相比分别为p＝1、p＝0.912和p＝1)，然而它们的半浓度确实刺激生长(Bonferroni事后，与水相比均p<0.0005)，尽管没有达到LLL的观察水平(Bonferroni事后，与LLL相比均p<0.0005)。相比之下，半浓度的LLL与完全浓度的LLL相比引起的刺激更少(Bonferroni事后，p＝0.003)，而半浓度和完全浓度的德氏乳杆菌2z(Bonferroni事后，p＝0.104)和德氏乳杆菌保加利亚亚种APC2493(Bonferroni事后，p＝0.112)显示出不依赖于浓度的相当的刺激。
MRS对双歧杆菌的影响
在10倍稀释的培养基中，浓缩的MRS(cMRS；
的重量当量)对双歧杆菌生长的刺激程度与
相当(图10A；ANOVA；F3,8＝12.078,p＝0.002；Bonferroni事后，p＝1)，且优于LLL及其上清液(Bonferroni事后，p≤0.003)。补充半浓缩MRS(1/2cMRS)的C18级分后，双歧杆菌计数有差异(图10B；独立样品Kruskal-Wallis；Kruskal-Wallis，χ2(5)＝15.222，p＝0.009)。1/2cMRS后面是1/2cMRS C18清洗级分，具有数字上最高的计数。
结论
在实施例1中，证明
补充在24小时人粪便发酵过程中增加双歧杆菌的相对和绝对丰度两者。实施例2证实发酵剂的数据，即
刺激双歧杆菌的生长。例如，这通过从婴儿和成年个体两者中分离出的测试双歧杆菌株的71％(七种中的五种)的生长刺激得到阐明。
活性是剂量依赖性的，在34mg/ml时看到最高活性，而低100倍的剂量(0.34mg/ml)没有作用。
益生元通常用于刺激双歧杆菌的生长，特别是乳糖相关化合物，如乳糖和GOS，以及菊粉和FOS已知刺激双歧杆菌的生长。然而，双歧杆菌的刺激并不归因于
中存在的乳糖，因为
的低乳糖版本(LLL)显示出与
相当的活性。
刺激双歧杆菌生长的能力不是益生菌制剂间的共同特征。三种市售的细菌产品在其日常剂量下没有刺激双歧杆菌的生长。这些包括克劳氏芽孢杆菌的孢子、罗伊氏乳杆菌DSM17938的细胞和鼠李糖乳酪杆菌GG。令人感兴趣的是，鼠李糖乳酪杆菌GG制剂的补充含有菊粉，尽管存在这种众所周知的益生元，但使双歧杆菌细胞完全失活。相反，含有布拉氏酵母菌CNCM I-745的基于酵母的制剂以类似于
的方式刺激双歧杆菌生长。
在用于
生产的两种株中，仅发酵乳杆菌对双歧杆菌的生长显示出与
相当的刺激，而德氏乳杆菌没有显示生长增强或者显示最小的生长增强。此外，由测试的乳杆菌产生的其他五种完全强度制剂无一能够刺激双歧杆菌的生长至
的水平。出乎意料的是，那些制剂的半浓度对双歧杆菌的生长有更多样的影响。四种半浓度的制剂显示刺激作用(发酵乳杆菌APC 249、德氏乳杆菌APC 2421、德氏乳杆菌APC 2516、罗伊氏乳杆菌APC 2482)，再次没有达到
的水平。这是另一个出乎意料的结果，因为这四种株的完全强度制剂是抑制性的，而半强度制剂具有刺激作用。
进行了几个分离实验，以鉴定负责刺激双歧杆菌生长的一种或多种化合物。首先，证明负责
活性的化合物可以使用C18柱进行部分纯化，该柱通常用于从水性基质中提取疏水性或极性有机分析物。用5％的甲醇清洗中从柱中释放活性化合物，表明那些化合物仅与柱的吸附剂弱结合。一般来说，
LLL和发酵乳杆菌1b的半强度制剂的重构清洗级分与它们的非纯化制剂一样有活性，但它们具有干净得多的色谱图。当清洗级分浓缩到完全浓度时，其活性与
上清液相等，再次证明抑制性化合物得到了一定清除。令人感兴趣的是，发酵乳杆菌APC249的C18纯化不仅除去了杂质，而且还除去了由该株产生的双歧杆菌抑制性化合物。其次，在双歧杆菌生成测定中测试了从尺寸排阻柱中收集的浓缩级分，揭示了级分52具有包含生长刺激性化合物的潜力，而级分52的MALDI TOF质谱法导致潜在的令人感兴趣的峰。
序列表
<110> 阿黛尔医药简易股份公司
<120> 肠道双歧杆菌的生长的刺激
<130> ADAR-164/01WO
<150> US63/018,908
<151> 2020-05-01
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n是a, c, g或t
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ggtcttcttg ccgtcgat 18
Claims (14)
1.组合物，其包含发酵乳杆菌细胞，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善所述人或非人动物受试者的肠道健康。
2.根据权利要求1使用的组合物，其还包含德氏乳杆菌细胞。
3.组合物，其包含已经培养发酵乳杆菌细胞的培养基，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善所述人或非人动物受试者的肠道健康。
4.根据权利要求1使用的组合物，其还包含已经培养发酵乳杆菌细胞的培养基。
5.根据权利要求2使用的组合物，其还包含已经培养发酵乳杆菌细胞和德氏乳杆菌细胞的培养基。
6.组合物，其包含已经培养发酵乳杆菌细胞和德氏乳杆菌细胞的培养基的上清液，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善所述人或非人动物受试者的肠道健康。
7.组合物，其包含权利要求6的上清液的级分52，所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善所述人或非人动物受试者的肠道健康，其中级分52是在MALDI TOF质谱术中在5200m/z左右具有单峰的尺寸排阻HPLC级分。
8.根据权利要求1至6中任一项使用的组合物，其中所述发酵乳杆菌和/或德氏乳杆菌的细胞是死细胞。
9.组合物，其包含
所述组合物用于通过刺激人或非人动物肠道中双歧杆菌的生长来维持和/或改善所述人或非人动物受试者的肠道健康。
10.根据权利要求1至9中任一项使用的组合物，其中所述受试者是健康人。
11.根据权利要求1至9中任一项使用的组合物，其中所述受试者是患有肠道病症的人。
12.根据权利要求11使用的组合物，其中所述肠道病症选自抗生素相关性腹泻、生态失调、肠易激综合征(IBS)和炎性肠病(IBD)。
13.根据权利要求1至12中任一项使用的组合物，其中所述组合物处于药物组合物、食物补充剂或营养补充剂的形式。
14.根据权利要求13使用的组合物，其中所述食物补充剂或营养补充剂包含在选自下组的食品内：乳、酸奶或酸奶式产品、奶酪、冰淇淋、基于谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方奶、营养配方奶、干燥口服粗粉或粉末、湿口服糊剂或果冻、用于干管喂养的粗粉或粉末或用于湿管喂养的流体。
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