KR20230005919A - 장 비피도박테리아 성장의 자극 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 장 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써, 장 건강을 유지/개선하기 위한 조성물을 제공한다. 제품 락테올®을 비롯한 락토바실루스 페르멘툼의 세포를 포함하는 조성물이 특히 관심대상이다. 조성물이 치료할 수 있는 구체적인 병태의 예는 항생제-연관 설사, 디스바이오시스, 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)을 포함한다.
Description
본 개시내용은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극할 수 있는 작용제에 관한 것이다.
장 미생물총 조성은 숙주 건강 상태에서 중요한 역할을 할 수 있다. 특히, 미생물총 파괴는 설사, 과민성 장 증후군 (irritable bowel syndrome, IBS), 비만, 알레르기 및 자폐증을 비롯한 행동 및 발달 장애와 연관되어 있다. 미생물총 조성에 영향을 미치도록 설계된 전략은 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 및 신바이오틱스 (프로바이오틱 박테리아와 이러한 박테리아 및 기타 박테리아의 증식을 자극하는 프리바이오틱의 조합)의 섭취를 포함한다. 미생물총 조정에 대한 보다 극적이지만 덜 예측가능한 접근법은 항미생물제 (예컨대 항생제 또는 박테리오신)의 보충 또는 대변 미생물총 전달 (fecal microbiota transfer, FMT)을 포함한다. 미생물 대사물의 변경된 수준은 또한 우울증, 결장직장암, 심혈관 질환, 비만 및 제2형 당뇨병과 같은 상태와 연관되었다. 따라서, 미생물-유래 분자, 예컨대 신경전달물질, 단쇄 지방산 (short-chain fatty acid, SCFA), 인돌, 담즙산, 콜린 대사물, 락테이트 및 비타민의 역할은 건강 및 웰빙에서 중요한 역할을 한다.
SCFA는 비소화성 식이 탄수화물의 미생물 발효 동안 생산된다. SCFA 생산은 숙주 에너지 대사에 직접적으로 기여할 수 있으며, 아세테이트 및 프로피오네이트는 간 및 말초 기관에 의해 흡수 및 대사되는 반면, 부티레이트는 주로 결장 상피에 의해 활용되고, 에너지원으로서 특정 박테리아에 의해 사용될 수 있다. 추가로, SCFA는 세포 분화의 조정, 항발암 및 항염증 효과에 의해 또는 포만감의 증진 및 식욕의 억제에 의해 숙주 생리학에 유익한 효과를 갖는다. 비피도박테리아에 의한 프로피오네이트 및 아세테이트의 생산은 숙주 건강에 대한 그의 유익한 효과에 대한 하나의 이유로서 제안되었다.
비피도박테리아는 인간 위장관에서 종종 발견되는 혐기성 그람-양성 박테리아이다. 건강한 성인에서, 총 대변 미생물총의 4.4% 내지 17.9%가 비피도박테리아이다. 일반적으로, 더 높은 수준의 비피도박테리아가 장 내의 내독소 수준 감소, 장 투과성 감소, 박테리아 전위율 감소 및 대사 개선을 포함하는 이로운 효과와 연관되었다. 동시에, 감소된 수의 비피도박테리아는 항생제-연관 설사, IBS, 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease, IBD), 비만, 알레르기 및 퇴행성 자폐증을 비롯한 다양한 장애와 연관되었다. 따라서, 비피도박테리움(Bifidobacterium)의 자극은 다수의 장애를 예방하고/거나 이의 정도를 감소시키고 삶의 질을 개선하기 위한 유효한 전략이다. 내인성 비피도박테리움 종의 자극은 특히 관심 대상이다.
락토바실루스(Lactobacillus)는 그람-양성, 통성 혐기성 또는 미세호기성, 막대형, 비-포자-형성 박테리아 속이다. 이들은 락트산 박테리아 군의 주요 부분이다 (즉, 이들은 당을 락트산으로 전환시킨다). 인간에서, 이들은 다수의 신체 부위에서 미생물총의 유의한 성분을 구성한다. 현재 락토바실루스는 180종을 초과하는 종을 함유하며, 매우 다양한 유기체들을 포괄한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 락토바실루스에 대한 언급은 최근에 리모실락토바실루스 페르멘툼(Limosilactobacillus fermentum)으로 재명명된 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum)을 포함한다. 따라서, 락토바실루스 페르멘툼 및 리모실락토바실루스 페르멘툼은 본 개시내용에서 상호교환가능하게 사용된다.
본 발명자들은 놀랍게도 락토바실루스 균주의 세포 (예컨대 사멸 세포) 및/또는 해당 세포가 성장한 배양 배지를 그의 상청액 (즉 무세포 상청액) 및 세포 분획과 함께 포함하는 조성물이 포유동물 (예컨대 인간) 장에서의 비피도박테리아의 성장을 자극할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 조성물 및 분획은 건강한 포유동물 (예를 들어 인간) 장을 유지하는데, 그리고 항생제-연관 설사, 디스바이오시스(dysbiosis), 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)이 포함되는, 장 내의 증가된 양의 비피도박테리아에 의해 보조될 수 있는 장애의 치료에 특히 유용하다. 본 개시내용의 측면을 요약하는 보고서는 2021년 2월 12일에 온라인 (http://aem.asm.org)에 개시된 문헌 [Applied and Environmental Microbiology, doi: 10.1128/AEM.02459-20 (Warda et al.)에서 찾을 수 있다. 이 논문 및 그의 구체적 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용될 때, "배양 배지"는 바람직하게는 락토바실루스의 1종 이상 균주의 세포 성장으로부터 생성되는 물질을 포함하는 MRS 브로쓰 (즉 한천 성분이 없는 통상적인 MRS 제품)이다.
포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극할 수 있는 본 개시내용의 한 특정 제품은 락테올(LACTEOL)®이다. 락테올®은 수분 보충 및/또는 식이 조치를 보충하는 성인 및 소아에서의 설사를 위한 대증 치료제로서 판매된다. 그러나, 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는 것은 이전에 보고되지 않았다.
포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극할 수 있는 본 개시내용의 또 다른 특정 제품은 저 락토스 락테올® (low lactose LACTEOL, 이하 LLL로 지칭됨)이다. LLL은 판매되는 것과 같은 최종 락테올® 제품을 형성하기 위한 락토스의 첨가 전의 락테올®의 제조 제품이다. LLL은 락테올® 중 10% w/w 미만의 락토스를 함유한다.
포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극할 수 있는 본 개시내용의 또 다른 특정한 제품은 락테올(LACTEOL®), 즉 락토바실루스 페르멘툼의 성분이다.
포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극할 수 있는, 분획 52로 지정된 락테올® 상청액의 분획을 비롯한, 락테올®, LLL 및 락토바실루스 페르멘툼의 상청액 및 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 분획이 또한 특히 관심대상이다.
본 개시내용은 추가로, 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는 역할을 하는 분획 52 내에 포함된 1종 이상의 화합물에 관한 것이다.
락테올® 중 활성 성분은 락토바실루스 엘비(Lactobacillus LB) 균주 (락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii)의 조합)의 열-사멸된 세포 및 발효된 배양 배지를 함유하는 배양 용액으로부터 유래된다. 락토바실루스 사멸 세포를 포함하는 본 개시내용의 다른 활성 생성물과 함께, 락테올®은 조성 및 효과의 일관성, 저장의 용이성, 취약한 환자에서의 감염의 위험 없음, 박테리아-병독성 또는 항생제-내성 카세트의 전위 없음을 비롯한, 살아있는 유기체, 예컨대 프로바이오틱스를 함유하는 제품에 비해 다수의 잠재적 이점을 가지며, 또한 본 발명의 생성물은 항생제 또는 항진균제와 함께 사용되는 경우에 활성을 보유한다.
본원 전반에 걸쳐 용어 "치료" 및 "치료하는"은 또한 언급된 상태 또는 장애에 대한 본 개시내용의 조성물의 예방적 및 보호적 용도를 포괄하는 것으로 의도된다.
본 개시내용의 한 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 포함하는, 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 락토바실루스 페르멘툼의 세포 또는 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지를 포함하는, 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지와 함께 포함하는, 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지와 함께 포함하는, 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 락테올®을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 LLL을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 락테올® 또는 LLL의 상청액 분획 또는 세포 분획을 제공한다.
본 개시내용의 특정 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 락테올® 또는 LLL의 상청액 분획을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 특정 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 분획 52 (본원에서 정의된 바와 같음)를 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 특정한 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하는데 사용하기 위한 분획 52 내의 1종 이상의 화합물을 제공한다.
본 개시내용의 한 측면은 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 유효량을 환자에게 투여하여 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해, 락토바실루스 엘비의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 비롯한 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포) 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 또는 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서의 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 유효량을 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해, 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 유효량을 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지와 함께 환자에게 투여하여 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해 유효량의 락테올®을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해 유효량의 LLL을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해 유효량의 락테올® 또는 LLL의 상청액 분획 또는 세포 분획을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 특정 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해 유효량의 락테올® 또는 LLL의 상청액 분획을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키기 위해 동물 (인간 포함) 환자에게 유효량의 분획 52를 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시키는 능력을 나타내는 분획 52의 1종 이상의 화합물의 유효량을 동물 (인간 포함) 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 장 건강을 개선하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "장 건강을 개선하다" 및 "장 건강을 개선하는"은: (1) 장 장애, 예컨대 디스바이오시스의 발생을 예방 또는 완화시키기 위해 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위한 본 개시내용의 생성물의 예방적 용도 및 (2) 항생제-연관 설사, 디스바이오시스, 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)을 비롯한 장 및 GI 관의 장애를 치료하기 위해 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위한 본 개시내용의 생성물의 용도를 포함한다.
본 개시내용의 한 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 락토바실루스 엘비의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 비롯한, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포) 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 또는 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지와 함께, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)를 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지와 함께, 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한 유효량의 락테올®을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예컨대, 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 유효량의 LLL을 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 유효량의 락테올® 또는 LLL의 상청액 분획 또는 세포 분획을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 특정한 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 유효량의 락테올® 또는 LLL의 상청액 분획을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 추가적인 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 유효량의 분획 52를 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 양을 증가시킴으로써 동물 (인간 포함) 환자에서 장 건강을 개선하는데 사용하기 위한, 유효량의 1종 이상의 분획 52의 화합물을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
도 1은 물, 락트산, 락토스 또는 락테올®이 보충된 용기에서의 대변 발효 전 및 24시간 후의 비피도박테리움 로드 및 총 계수의 등가량을 나타낸다.
도 2a는 10 x 희석된 배지에서 다양한 유아- 및 성인-연관 비피도박테리움 균주의 성장에 대한 락테올®의 효과를 보여준다. 도 2b는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 락테올® 성분 [상청액, 세포 및 저 락토스 락테올® (LLL)]의 효과를 나타낸다. 도 2c는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 락테올® 용량의 효과를 나타낸다. 도 2d 및 도 2e는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 효소적으로 또는 물리적으로 처리된 락테올®의 효과를 나타낸다. 도 2f는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 락테올®-유사 제제의 효과를 나타낸다. 도 2g는 15 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 LLL 및 엘비. 페르멘툼 성분 [상청액, 세포, 및 투석된 것]의 효과를 보여준다.
도 3a 및 3b는 15 x 희석된 배지에서의 비. 롱검(B. longum) 아종 인판티스(infantis) ATCC 15697 (B1)의 24시간 성장에 대한 프로바이오틱스의 효과를 나타낸다.
도 4a, 4b 및 4c는 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 24시간 성장에 대한 락테올®, 엘비. 페르멘툼, 엘비. 페르멘툼 APC249, 및 LLL의 SPE C18 정제를 보여준다.
도 5는 10 x 희석된 배지에서의 비피도박테리움 성장에 대한 암모늄 침전 분획의 C18 정제의 효과를 나타낸다.
도 6은 크기 배제 칼럼을 통과하는 락테올® 및 그의 분획의 UV 흡수 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 C-18 정제된 1/2 강도 락테올®의 HPLC 분획에 반응한 비피도박테리움 성장을 나타낸다 (15 x 희석된 배지).
도 8은 C18 정제된 락테올®의 분획 52 및 주변 분획에 대한 MALDI TOF 질량 분광측정법 결과를 나타낸다.
도 9는 비피도박테리움의 24시간 성장에 대한 락테올®-유사 제제의 농도 효과를 나타낸다 (15 x 희석된 배지). 도 9a는 락테올®의 중량 등가량의 전체 및 절반에서의 엘비. 페르멘툼 균주의 상청액의 효과를 나타낸다. 도 9b는 락테올® 중량 등가량의 전체 및 절반에서의 세포 및 상청액의 조합의 효과를 나타낸다.
도 10은 10 x 희석 배지 (도 10a) 및 15x 희석 배지 (도 10b)에서의 비피도박테리움의 성장에 대한 농축 MRS 제제 (cMRS; 3.4 g/10 ml 물)의 효과를 나타낸다.
도 2a는 10 x 희석된 배지에서 다양한 유아- 및 성인-연관 비피도박테리움 균주의 성장에 대한 락테올®의 효과를 보여준다. 도 2b는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 락테올® 성분 [상청액, 세포 및 저 락토스 락테올® (LLL)]의 효과를 나타낸다. 도 2c는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 락테올® 용량의 효과를 나타낸다. 도 2d 및 도 2e는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 효소적으로 또는 물리적으로 처리된 락테올®의 효과를 나타낸다. 도 2f는 10 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 락테올®-유사 제제의 효과를 나타낸다. 도 2g는 15 x 희석된 배지에서의 성장에 대한 LLL 및 엘비. 페르멘툼 성분 [상청액, 세포, 및 투석된 것]의 효과를 보여준다.
도 3a 및 3b는 15 x 희석된 배지에서의 비. 롱검(B. longum) 아종 인판티스(infantis) ATCC 15697 (B1)의 24시간 성장에 대한 프로바이오틱스의 효과를 나타낸다.
도 4a, 4b 및 4c는 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 24시간 성장에 대한 락테올®, 엘비. 페르멘툼, 엘비. 페르멘툼 APC249, 및 LLL의 SPE C18 정제를 보여준다.
도 5는 10 x 희석된 배지에서의 비피도박테리움 성장에 대한 암모늄 침전 분획의 C18 정제의 효과를 나타낸다.
도 6은 크기 배제 칼럼을 통과하는 락테올® 및 그의 분획의 UV 흡수 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 C-18 정제된 1/2 강도 락테올®의 HPLC 분획에 반응한 비피도박테리움 성장을 나타낸다 (15 x 희석된 배지).
도 8은 C18 정제된 락테올®의 분획 52 및 주변 분획에 대한 MALDI TOF 질량 분광측정법 결과를 나타낸다.
도 9는 비피도박테리움의 24시간 성장에 대한 락테올®-유사 제제의 농도 효과를 나타낸다 (15 x 희석된 배지). 도 9a는 락테올®의 중량 등가량의 전체 및 절반에서의 엘비. 페르멘툼 균주의 상청액의 효과를 나타낸다. 도 9b는 락테올® 중량 등가량의 전체 및 절반에서의 세포 및 상청액의 조합의 효과를 나타낸다.
도 10은 10 x 희석 배지 (도 10a) 및 15x 희석 배지 (도 10b)에서의 비피도박테리움의 성장에 대한 농축 MRS 제제 (cMRS; 3.4 g/10 ml 물)의 효과를 나타낸다.
본 개시내용은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써, 장 건강을 유지하고 개선하는 것을 돕는 미생물학적 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용의 적합한 조성물은, 한 측면에서, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포), 또는 락토바실루스 엘비를 비롯한 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 혼합물을 포함한다. 본 개시내용의 특정한 조성물은 락테올®을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 적합한 조성물은 락테올®, LLL 또는 락토바실루스 페르멘툼의 성분을 포함한다.
특정한 측면에서, 적합한 조성물은 락테올®, LLL 또는 락토바실루스 페르멘툼의 상청액 및/또는 세포를 포함한다.
본 개시내용의 특정한 조성물은 락테올® 또는 LLL의 상청액의 분획을 포함한다. 특히 관심있는 하나의 이러한 분획은 분획 52이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 적합한 조성물은 포유동물 (예를 들어 인간) 장에서 유익한 비피도박테리아의 성장을 자극하는 것을 담당하는 분획 52 내의 1종 이상의 화합물을 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 개시내용의 적합한 조성물은 락토바실루스 페르멘툼의 세포 또는 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)가 성장하는 배양 배지를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 적합한 조성물은 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예컨대 사멸 세포)를 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장하는 배양 배지와 함께 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 적합한 조성물은 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예컨대 사멸 세포)를 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장하는 배양 배지와 함께 포함한다.
본원에서 언급된 생물학적 기탁물은 파리 세덱스 15 75724 루 듀 독토르 룩스 25-28 인스티튜트 파스퇴르에 위치한 콜렉션 내쇼날레 드 컬쳐스 드 마이크로오가니즘스 (CNCM)에 기탁되었다. 발효된 배양 배지 중 락토바실루스 엘비는 참조 코드 MA 65/4E (MA65/4E-1b: 락토바실루스 페르멘툼, MA65/4E-2z: 락토바실루스 델브루엑키이)로 CNCM에 기탁되어 있다. MA65/4E는 1991년 8월 26일에 기탁되었다. 락토바실루스 엘비의 2종의 개별 박테리아 균주는 부다페스트 조약 하에 락토바실루스 페르멘툼, CNCM I-2998 (참조: MA65/4E-1b; 초기 기탁일: 1992년 8월 26일; 부다페스트 조약에 부합하는 전환일: 2003년 3월 27일) 및 락토바실루스 델브루엑키이, CNCM I-4831 (참조: MA65/4E-2z; 초기 기탁일: 1992년 8월 26일; 초기 기탁을 부다페스트 조약에 부합하는 전환 요청: 2013년 12월 20일; 전환 수령은 2014년 1월 9일 허여됨)로서 기록되어 있다.
락토바실루스 엘비 사멸 세포는 발효된 배양 배지 중의 살아있는 세포를 약 110℃에서 약 1시간 동안 가열함으로써 수득될 수 있다. 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 델브루엑키이 또는 그의 혼합물의 사멸 세포는 열-사멸 과정을 통해 유사한 방식으로 수득될 수 있다.
혼합물로서 사용되는 경우, 락토바실루스 페르멘툼 대 락토바실루스 델브루엑키이의 중량비는 약 99:1 내지 약 1:99, 예를 들어 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9를 포함하는 약 9:1 내지 1:9의 임의의 적합한 비일 수 있다. 락토바실루스 페르멘툼 대 락토바실루스 델브루엑키이의 중량비는 특히 약 9:1일 수 있다.
락테올®은 락토바실루스 엘비의 사멸 세포를 발효된 배양 배지와 함께 (예를 들어, 동결건조, 분무-건조 또는 유동층 건조에 의해) 건조시킨 후, 본 발명에 사용하기에 적합한 조성물로 제제화함으로써 제조될 수 있다. 특정한 측면에서, 락토스가 건조 전에 습윤 발효 생성물에 첨가될 수 있다. 또 다른 측면에서, 락토스가 또한 제제화 단계의 일부로서 건조 후에 첨가될 수 있다.
락테올®은 배양 배지 중에 열-사멸된 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 건조된 조합물을 약 9:1 비로 함유한다.
락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 델브루엑키이, 또는 락토바실루스 엘비를 비롯한 그의 혼합물의 사멸 세포는 또한 건조 단계를 생략하거나 또는 건조된 생성물을 적합한 액체, 예컨대 물로 재구성함으로써, 락토스의 존재 또는 부재 하에 액체 형태로 사용될 수 있다.
락테올®, LLL 또는 락토바실루스 페르멘툼의 상청액 및 세포는 전통적인 분리 기술, 예컨대 원심분리에 이어서 액체로부터 고체 물질의 분리 (예를 들어 여과에 의함)에 의해 각각 락테올®, LLL 또는 락토바실루스 페르멘툼의 용액으로부터 제조될 수 있다. 락테올® 또는 LLL의 상청액의 분획은 크기 배제 크로마토그래피, 예컨대 크기 배제 HPLC 칼럼 크로마토그래피를 통해 수득될 수 있다. 분획은 용매-용매 추출을 사용하고 고체 상 추출 칼럼, 예를 들어 C18, 정제에 의해 정제/농축될 수 있다. 분획 내로부터의 활성 화합물은 LC-MS/MS (액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분광측정법)를 사용하여 분석 및 특징화될 수 있다.
분획 52는 크기 배제 HPLC에 의해 수득되고 C18을 사용한 다중 실행으로 정제된 락테올® 또는 LLC의 상청액의 분획이고; MALDI TOF 질량 분광측정법에서 분획 52는 약 5200 m/z (예컨대 5237.08 m/z)에서 단일 피크를 갖는다.
한 측면에서, 락토바실루스 페르멘툼, 락토바실루스 델브루엑키이, 또는 락토바실루스 엘비를 비롯한 그의 혼합물의 세포 (예를 들어 사멸 세포)는 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 양으로 본 개시내용의 조성물에 존재한다. 본 개시내용의 대표적인 일 실시양태에서, 락토바실루스 엘비 균주의 사멸 세포는 본 개시내용의 조성물 중에 약 10억개 이상의 세포/g, 예를 들면 약 400 내지 약 800억개의 세포/g (예컨대 약 600억개의 세포/g)을 포함한 약 100 내지 약 1000억개의 세포/g의 비율로 존재한다.
본 개시내용의 조성물은 대상체의 연령, 체중 및 성별, 치료될 상태, 및 투여 지속기간 및 투여 경로와 같은 인자에 따라 달라질 적합한 용량으로 경구로 투여될 수 있다. 통상적으로 훈련된 의사 또는 수의사는 각각의 인간 또는 비-인간 동물 환자에 대한 본 개시내용의 제약 조성물의 유효 용량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 적합한 투여 형태의 본 개시내용의 제약 조성물은 환자에게 1일 1회 또는 2회 편리하게 투여될 수 있다. 유아 또는 어린 아동에서, 20 내지 40 kg 범위의 체중을 기준으로, 성인 투여량의 대략 1/2이 투여될 수 있고, 20 kg 미만의 체중을 기준으로, 성인 투여량의 대략 1/4이 투여될 수 있다.
예를 들어 표준 제약 투여 형태, 예컨대 캡슐, 또는 정제, 또는 사쉐 중의 본 개시내용의 조성물의 편리한 단위 용량은 성인 인간 환자에게 1일 1회 또는 2회 투여되는 약 2000 mg 이하의 임의의 유효 용량일 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 또한 식품 또는 영양 보충제로서 또는 식품, 예를 들어 요거트에서 투여될 수 있다. 이 경우에 약 100 g까지의 매우 높은 용량이 섭취될 수 있을 것이다.
본 개시내용의 제약 조성물은 제약상 이용가능한 담체 및/또는 부형제를 사용하여 제제화될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 실행될 수 있는 방법에 따라 단위 용량으로 제조되거나 또는 고용량 용기에 함유될 수 있다. 여기서, 투여 형태는 정제, 캡슐, 과립, 분말, 사쉐 함유 분말, 또는 액체, 예컨대 수성 매질-함유 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.
예를 들어, 한 측면에서, 제약 조성물을 캡슐로서 제제화하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 건조된 (예를 들어 동결건조된) 세포, 또는 락토바실루스 엘비를 비롯한 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포의 혼합물 (임의로 발효된 배양 배지 및/또는 동결건조 첨가제와 함께)을 1종 이상의 적합한 비-독성 제약상 이용가능한 불활성 담체 및 부형제와 혼합할 수 있다. 예는 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제, 착색제 및 건조제를 포함한다. 적합한 결합제는 천연 당, 예컨대 전분, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토스, 천연 또는 합성 검, 예컨대 옥수수 감미제, 아카시아, 트라가칸트 또는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 또는 염화나트륨일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 붕해제는 전분, 메틸셀룰로스, 한천, 벤토나이트 또는 크산탄 검을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 윤활제는 활석 및 스테아르산마그네슘을 포함한다. 적합한 건조제는 규산을 포함하고, 적합한 희석제는 락토스, 예컨대 무수 락토스를 포함한다. 적합한 동결건조 첨가제는 락토스 1수화물 및 금속 탄산염, 예컨대 탄산칼슘을 포함한다. 생성물 혼합물은 임의의 표준 캡슐 케이싱, 예컨대 젤라틴 캡슐에 함유될 수 있다.
또 다른 측면에서, 경구 현탁액을 위한 분말 형태의 본 개시내용의 제약 조성물은, 예를 들어 락토바실루스 페르멘툼의 건조된 (예를 들어 동결건조된) 세포, 또는 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (임의로 발효된 배양 배지 및/또는 동결건조 첨가제와 함께)를 1종 이상의 적합한, 비-독성 제약상 이용가능한 불활성 담체 및 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예는 희석제, 향미제, 감미제 및 건조제를 포함한다. 적합한 건조제는 규산을 포함하고, 적합한 희석제는 락토스, 예컨대 무수 락토스 또는 수크로스를 포함하며, 후자는 또한 감미제로서 작용할 수 있다. 적합한 동결건조 첨가제는 락토스 1수화물 및 금속 탄산염, 예컨대 탄산칼슘을 포함한다. 분말 제품은 음용가능한 액체와 혼합할 준비가 된 임의의 표준 사쉐에 함유될 수 있다.
경구 투여용 조성물은 또한 액체 또는 고체 식품 또는 영양 제품 (예를 들어 영양 보충제)의 일부일 수 있다. 예는 우유, 요거트 또는 요거트-스타일 제품, 치즈, 아이스크림, 시리얼-기반 제품, 우유-기반 분말, 영양 조제식, 유아 조제식, 영양 조제식, 건식 구강 그릿 또는 분말, 습식 구강 페이스트 또는 젤리, 건식 경관 섭식용 그릿 또는 분말 또는 습식 경관 섭식용 유체를 포함한다.
또한, 임의적인 추가의 활성 성분이 또한 본 개시내용의 조성물과 함께 사용하기 위해 존재할 수 있다. 임의적인 활성 성분은, 예를 들어 비타민, 항생제, 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱스를 포함한다. 추가의 활성 성분(들) 및 본 개시내용의 조성물은 개별 조성물로서 공-투여되거나 또는 개별적으로 (예를 들어 순차적으로) 투여될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분(들)은 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포), 또는 락토바실루스 엘비를 비롯한 락토바실루스 페르멘툼 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)의 혼합물과 동일한 조성물 내로, 임의로 발효된 배양 배지 및/또는 동결건조 첨가제와 함께 혼입될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 그의 분획은 건강한 포유동물 (예를 들어 인간) 장을 유지하는데, 그리고 항생제-연관 설사, 디스바이오시스, 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)을 바롯한, 장 내의 증가된 양의 비피도박테리아에 의해 보조될 수 있는 장애의 치료에 특히 유용하다.
하기는 본 개시내용의 구체적 실시양태이다:
실시양태 1: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼 세포의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 장 장애의 발생에 대해 인간 또는 비-인간 동물 대상체를 보호하는 방법.
실시양태 2: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 장 장애의 발생에 대해 인간 또는 비-인간 동물 대상체를 보호하는 방법.
실시양태 3: 실시양태 1 또는 2에 있어서, 락토바실루스 페르멘툼 및/또는 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 사멸 세포인 방법.
실시양태 4: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락테올® 제품의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 장 장애의 발생에 대해 인간 또는 비-인간 동물 대상체를 보호하는 방법.
실시양태 5: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포) 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)가 성장한 배양 배지의 상청액의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 대상체를 장 장애의 발생에 대해 보호하는 방법.
실시양태 6: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 실시양태 5의 상청액의 분획 52의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 장 장애의 발생에 대해 인간 또는 비-인간 동물 대상체를 보호하는 방법.
실시양태 7: 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 건강한 인간인 방법.
실시양태 8: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼 세포의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 대상체에서 장 장애를 치료하는 방법.
실시양태 9: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 대상체에서 장 장애를 치료하는 방법.
실시양태 10: 실시양태 8 또는 9에 있어서, 락토바실루스 페르멘툼 및/또는 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 사멸 세포인 방법.
실시양태 11: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락테올® 제품의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 대상체에서 장 장애를 치료하는 방법.
실시양태 12: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포) 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)가 성장된 배양 배지의 상청액의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 대상체에서 장 장애를 치료하는 방법.
실시양태 13: 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극하기 위해, 실시양태 12의 상청액의 분획 52의 유효량을 인간 또는 비-인간 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 분획 52는 크기 배제 HPLC에 의해 수득되고 C18로의 다중 실행으로 정제된 락테올® 또는 LLC의 상청액의 분획이고; MALDI TOF 질량 분광측정법에서 약 5200 m/z에서 (예컨대 5237.08 m/에서) 단일 피크를 갖는 것인, 인간 또는 비-인간 동물 대상체에서 장 장애를 치료하는 방법.
실시양태 14: 실시양태 8 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
실시양태 15: 실시양태 8 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 장 장애가 항생제-연관 설사, 디스바이오시스, 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 16: 락토바실루스 페르멘툼의 세포를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 17: 실시양태 15에 있어서, 락토바실루스 델브루엑키이의 세포를 또한 포함하는 조성물.
실시양태 18: 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 19: 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 20: 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지와 함께, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 21: 실시양태 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 락토바실루스 페르멘툼 및/또는 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 사멸 세포인 조성물.
실시양태 22: 락테올®을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 23: 락토바실루스 페르멘툼의 세포 (예를 들어 사멸 세포) 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포 (예를 들어 사멸 세포)가 성장한 배양 배지의 상청액을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 24: 실시양태 22의 상청액의 분획 52를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
실시양태 25: 실시양태 16 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 건강한 인간인 조성물.
실시양태 26: 실시양태 16 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 장 장애의 치료를 위한 조성물.
실시양태 27: 실시양태 16 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 인간 대상체에서 장 장애의 치료를 위한 조성물.
실시양태 28: 실시양태 26 또는 27에 있어서, 장 장애가 항생제-연관 설사, 디스바이오시스, 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)으로부터 선택된 것인 조성물.
실시양태 29: 실시양태 16 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제약 조성물, 식품 보충제 또는 영양 보충제의 형태인 조성물.
실시양태 30: 실시양태 29에 있어서, 상기 식품 보충제 또는 영양 보충제가 우유, 요거트 또는 요거트-스타일 제품, 치즈, 아이스크림, 시리얼-기반 제품, 우유-기반 분말, 유아용 조제식, 영양 조제식, 건식 구강 그릿 또는 분말, 습식 구강 페이스트 또는 젤리, 건식 경관 섭취용 그릿 또는 분말 또는 습식 경관 섭식 유체로부터 선택된 식제품 내에 포함되는 것인 조성물.
본 개시내용이 특정 예시적 실시양태 및 구체적 실시예를 참조하여 본원에 기재되었지만, 형태 및 세부사항에 있어서의 변형이 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 그 안에서 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
실시예 1
락테올
®
제제
락테올® 분말을 대변 발효 용기에 공급하는데 사용하였다.
대변 발효 - 동결된 표준화된 접종물 (frozen standardized inoculum, FSI)의 제조
동결된 표준화된 접종물을 문헌 [O'Donell MM et al. in Journal of Microbiological Methods. (2016) vol. 9, pages 9-16]에 기재된 방법과 유사한 방식으로 제조하였다. 간략하게, 지원자/공여자 (n = 5)는 엄격한 기준을 준수하였다: 모든 공여자는 건강한 성인이었고, 공여 전 6개월 동안 항생제를 섭취하지 않았다. 공여자로부터의 대변 샘플을 플라스틱 용기 내로 수집하고, 혐기성 조건의 발생기 (젠박스 아나에르(GENbox anaer), 프랑스 바이오메리욱스(BioMerieux))를 갖는 집백에 넣고, 4℃에서 저장하였다. 평균 9시간 내에 대변 샘플을 무산소 분위기 (10% H2, 0% O2, 0% N2) 하에 혐기성 챔버 (돈 휘틀리(Don Whitley), 영국 웨스트 요크셔)로 옮겼다. 대변을 혐기성 챔버에서 70 μm 필터 삽입물 (스팍스 랩 서플라이즈(Sparks lab supplies), 아일랜드)이 있는 대형 스토마커 백 내로 함께 풀링하였다. 0.05% (w/v) L-시스테인 히드로클로라이드 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 아일랜드)를 함유하는 50 mM 포스페이트 완충제 pH 6.8 (추가로 포스페이트 완충제로 지칭됨) 400 ml를 스토마커 백에 첨가하고, 이어서 수동 샘플 균질화시켰다. 이어서, 여과된 슬러리를 소르발(Sorvall) SLA-3000 원심분리기에서 25분 동안 4000 x g로 원심분리하고, 다시 혐기성 캐비넷에서 400 ml 포스페이트 완충제 중에 재현탁시켰다. 이어서, 2차 원심분리 (25분 동안 4000 x g)를 수행한 후, 400 ml 포스페이트 완충제 중에 재현탁시켰다. 이어서, 생성된 대변 박테리아 현탁액에 200 ml의 글리세롤을 보충하고, 분취하고, 사용할 때까지 -80℃에서 1 내지 9주 동안 동결시켰다 (이하에서 FSI로 지칭됨). 원심분리 단계를 제외하고, 모든 처리는 혐기성 캐비닛에서 수행하였다. FSI의 사용 전에, 분취물을 37℃에서 0.5 내지 1시간에 걸쳐 해동시킨 후, 발효 용기 내로 접종하였다.
대변 발효 - 원위 결장 모델
전분-보충된 대변 배지를 문헌 [Fooks LJ and Gibson GR in Anaerobe (2003) vol. 9(5), pages 231-42]에 기재된 바와 같이, 리터당 발효 용기의 최종 농도 (총 부피 200 ml)로 제조하였다: 2 g 펩톤, 2 g 효모 추출물, 0.76 g NaCl, 0.04 g K2HPO4, 0.04 g KH2PO4, 0.007 g CaCl2·2H2O, 0.01 g MgSO4·7H2O, 2 g NaHCO3, 2 ml 트윈 80, 0.5 g L-시스테인-HCl, 0.5 g 담즙 염, 10 g 가용성 전분, 0.05 g 헤민 (1 M NaOH의 3 방울 중에 용해됨), 및 10 μl 비타민 K1 (시그마 알드리치). 180 ml의 기초 배지에 3.4 g/100 ml 락테올® (100 ml 중 340 mg의 락테올®의 10개의 사쉐/캡슐에 상응함), 또는 대조군으로서 등가량의 락트산 (30 mM), 락토스 (36 mM) 또는 물을 보충하였다. 필요한 경우에 물을 첨가하여 부피가 187.5 ml가 되게 하였다. 배지를 멀티포스(MultiFors) 시스템 (인포스(Infors), 영국)의 발효 용기에 첨가하고, 그의 pH를 6.8로 조정하고, 각각의 용기를 산소-무함유 N2로 적어도 120분 동안 폭기하여 혐기성 조건이 확립되도록 보장하였다. 12.5 ml FSI를 사용하여 각각의 용기에 접종하였다. 발효를 37℃에서 24시간에 걸쳐 수행하고, 1M NaOH 또는 1M HCl의 자동 첨가에 의해 일정한 pH 6.8에서 유지하고; 산소-무함유 N2로 폭기하고, 200 rpm에서 연속적으로 교반하였다. 샘플을 T0, 1시간 (T1), 2시간 (T2), 3시간 (T3), 4시간 (T4), 5시간 (T5), 6시간 (T6), 22시간 (T22) 및 24시간 (T24)의 발효 후에 각각의 용기로부터 회수하고, 가공시까지 -80℃에서 저장하였다. 각각의 조건을 적어도 삼중으로 시험하였다.
DNA 단리
사용된 비드-박동 (패스트프렙(FastPrep)-24, 엠피 바이오메디칼즈(MP Biomedicals), 미국) 용액의 부피를 600 μl로 증가시키고, 최종 용리 부피를 30 μl TAE로 감소시키면서, 제조업체의 권장사항에 따라 퀴아앰프 패스트 DNA 스툴 미니(QIAamp Fast DNA Stool Mini) 키트 (퀴아젠(Qiagen), 독일)를 사용하여 사소하게 변형시켜 대변 발효 샘플로부터의 DNA 단리를 수행하였다. DNA 양 및 품질의 평가는 큐비트(Qubit) dsDNA BR 검정 키트를 사용하고 품질 평가를 위해 겔 상에서 5 μl 샘플을 실행하여 DNA 농도를 측정함으로써 수행하였다.
16S 메타게노믹스 - 미생물총 분석
DNA 증폭, 인덱싱, 정규화 및 서열분석
라이브러리 제조를 문헌 [Warda AK et al in Behavioural brain research (2018) vol. 362, pages 213-23]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 16S 유전자의 V3 및 V4 영역을 퓨전 폴리머라제 마스터 믹스(Phusion Polymerase Master Mix) 및 V3-V4 (정방향 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGAT GTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' (서열 식별번호: 1); 역방향 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (서열식별번호: 2)) 프라이머 (98℃ 30초; 98℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 20초의 25 사이클; 72℃ 5분)를 사용하여 증폭시켰다. 앰플리콘을 큐빗(Qubit) dsDNA HS 검정 키트에 의해 품질 및 양에 대해 체크하고, 겔 상에서 실행시키고, 앰퓨어 XP 자기 비드를 사용하여 세정하였다. 퓨전 폴리머라제 마스터 믹스 및 넥스테라(Nextera) XT 인덱스 키트 (95℃ 30초; 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 8 사이클; 72℃ 5분)를 사용하여 5 μl의 세정된 앰플리콘을 인덱스 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 인덱싱된 앰플리콘을 앰퓨어 XP 자기 비드를 사용하여 세정하고, 큐빗 dsDNA HS 검정 키트에 의해 품질 및 양에 대해 체크하고, 겔 상에서 실행하였다. 모든 샘플을 물 중에 4 nM로 정규화한 후, 5 μl의 각각의 샘플을 함께 풀링하고, 일루미나 MiSeq 서열분석을 위해 GTAC (독일)로 보냈다.
16S 데이터 분석
미가공 판독물의 품질을 FastQC v0.11.3으로 가시화하였다. 이어서, 판독물을 문헌 [Callahan BJ et al. in Nat Methods (2016) vol. 13(7), pages 581-3]에 따라 DADA2 패키지 (v1.03)를 사용한 분석을 위해 R v3.3.0 내로 임포팅하였다. 서열분석 과정 동안 도입된 오차를 보정하여 리보솜 서열 변이체 (Ribosomal Sequence Variant, RSV)를 생성하였다. 이들을 엑스포팅하고, 키메라에스레이어(ChimeraSlayer) 골드 데이터베이스 v20110519로 USEARCH v8.1.1861에서 실행된 드 노보 및 참조-기반 키메라 필터링 둘 다를 사용하여 추가의 키메라를 필터링하였다. 나머지 RSV는 RDP 데이터베이스 버전 11.4과 대조하여 mothur v1.38 [문헌 [Schloss PD et al. in Applied and environmental microbiology (2009) vol. 75(23), pages 7537-41] 참조]를 사용해 분류하였고 뿐만 아니라, SPINGO를 사용해 종 수준으로 분류하였다 [문헌 [Allard G et al. in BMC bioinformatics (2015) vol, 16, page 324] 참조]. 박테리아 또는 고세균의 도메인 분류를 갖는 RSV만을 추가의 분석을 위해 유지하였다. 중간점에서 근원하는 RSV 서열의 계통수를 패스트트리(FastTree)를 사용해 생성하였다 [문헌 [Price MN et al. in Molecular biology and evolution (2009) vol. 26(7), pages 1641-50] 참조]. 알파 다양성 및 베타 다양성을 PhyloSeq v1.16.2를 사용하여 생성하였으며, 이를 또한 Ape v3.5에서 실행된 바와 같은 주요 좌표 분석에 사용하였다. RSV 수준에 대한 DESeq2 v1.12.4 [문헌 [Love MI et al. in Genome Biol. (2014) vol. 15(12), page 550] 참조] 그리고 문 내지 속에 대한 윌콕슨 검정을 사용하여 차등 존재비 분석을 수행하였다. 필요한 경우 벤자미니 호크버그 방법을 사용하여 P-값을 조정하였다. R에서의 모든 시각화는 ggplot2 v2.2.1을 사용하여 수행하였다. 본 공개에서 논의된 서열분석 데이터는 서열 판독 아카이브 (Sequence Read Archive, SRA)에 기탁되어 있고, 수탁 번호 PRJNA545405 하에 접근가능하다.
qPCR
단리된 DNA를 사용하여 총 미생물 로드 및 비피도박테리아 로드를 상대적으로 정량화하였다. 반응을 라이트사이클러 480 플레이트 및 접착 커버 (로슈)를 사용하여 384-웰 라이트사이클러 480 PCR (로슈) 상에서 실행하였다. 각각의 15 μl 반응물은 6.5 μl 물, 7.5 μl 2X 센시패스트(SensiFAST)TM SYBR 노-록스 마스터 믹스 (바이올린(Bioline)), 0.3μl의 각각의 10 μM 프라이머 (정방향 및 역방향) 및 1μl의 DNA 샘플을 함유하였다. DNA 대신 물을 사용하여 주형이 없는 대조군 (NTC)을 제조하였다. 샘플을 사용 전에 100배 희석하였다. 각각의 반응물을 4중으로 실행하였다. 프라이머는 총 계수의 경우 U16SRT-F (5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3 (서열식별번호: 3), U16SRT-R (5-TATTACCGCGGCTGCTGGC-3 (서열식별번호: 4)), 및 비피도박테리아 정량화의 경우 Bif-xfp-F1 (5-CGTCCGTTCTACCCGATG-3 (서열식별번호: 5)), Bif-xfp-R1 (5-GGTCTTCTTGCCGTCGAT-3 (서열식별번호: 6))를 사용하였다. 사이클링 파라미터는 95℃에서 5분, 이어서 95℃에서 10초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 30초의 45 사이클이었다. 비-특이적 증폭을 제거하기 위해 모든 프로그램의 끝에 용융 곡선 분석 (60 내지 97℃)을 포함시켰다. 교차점 (Cp) 값 및 용융 온도는 기기 소프트웨어를 사용하여 자동으로 계산하였다. 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 밤새 성장된 배양물 10 ml로부터 단리된 DNA의 10배 희석물을 사용하여 프라이머의 효율을 점검하였고, U16SRT 및 Bif-xfp 프라이머에 대해 E가 각각 95.7% 및 95.5%였다. CFU/ml을 Cp 값과 상관시키기 위해 동일한 희석 범위를 미생물 군 둘 다에 대한 표준 곡선으로서 사용하였다. 동시에, 16S rRNA 카피/ml를 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697 게놈 내의 16S 유전자의 4개의 카피에 기초하여 계산하였다 [rrnDB 데이터베이스에 기초하면, 박테리아 게놈에 대한 평균 카피수는 4.9이다 (https://rrndb.umms.med.umich.edu/; entry 12 December 2018)].
대사물 분석
샘플을 얼음 상에서 해동시키고, 1분 동안 최대 속도로 원심분리하였다. 상청액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, HPLC 용기로 옮기고, 측정할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 샘플 분석을 하기와 같이 MS-Omics에 의해 수행하였다: SCFA 분석을 위해 샘플을 히드로클로라이드 산을 사용하여 산성화시키고, 중수소 표지된 내부 표준을 첨가하였다. 모든 샘플은 무작위 순서로 분석되었다. 사중극자 검출기 (5977B, 애질런트(Agilent))와 커플링된 GC (7890B, 애질런트)에 설치된 고극성 칼럼 (제브론(Zebron)TM ZB-FFAP, GC 캡. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 사용하여 분석을 수행하였다. 탁월한 대사물 분석을 위해, 샘플을 문헌 [Smart et al. (DOI: 10.1038/nprot.2010.108)]에 기재된 프로토콜을 사용하여 메틸 클로로포르메이트로 유도체화하였다. 모든 샘플은 무작위 순서로 분석되었다. 분석은 사중극자 질량 분광측정법 검출기 (5977B, 애질런트)와 커플링된 기체 크로마토그래피 (7890B, 애질런트)를 사용하여 수행되었다. 두 경우 모두에서, 시스템은 켐스테이션(ChemStation) (애질런트)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터를 켐스테이션 (애질런트)을 사용하여 netCDF 포맷으로 전환시킨 후, 데이터를 임포팅하고, 문헌 [Johnsen et al. in Journal of chromatography A. (2017) vol. 1503, pages 57-64]에 기재된 파라디즈(PARADISe) 소프트웨어를 사용하여 매트랩(Matlab) R2014b (매스웍스, 인크.(Mathworks, Inc.))에서 프로세싱하였다.
결과
미생물학적 변화 - 16S rRNA 유전자 메타게노믹스
발효 동안 수집된 샘플로부터 DNA를 단리하고, 16S rRNA 유전자 앰플리콘 서열분석을 수행하였다. 속 수준에서, 모든 실험 용기에서 발효 시작 시에 높은 다양성이 관찰되었고, 이는 인간 장 마이크로바이옴의 높은 다양성을 나타낸다. 시간에 따라, 조성은 모든 용기에서 점차적으로 변하였고, 가장 느린 변화는 물 용기에서 일어났고, 가장 빠른 변화는 락트산 및 락테올® 용기에서 일어났다. 실제로, 에스케리키아(Escherichia)/시겔라(Shigella)의 초기 증가 후에, 비피도박테리움의 상대 존재비의 극적인 증가가 락테올® 용기에서 발생했고 다른 용기에서는 보다 적은 정도로 발생하였다. 관찰된 변화는 반복실험 용기에서 재현가능하였지만, 과 수준에서의 유의한 변화는 검출할 수 없었으며 (윌콕슨 검정), 이는 아마도 군당 제한된 수의 샘플로 인한 것일 것이다. 속 수준에서, 물 용기에서 24시간에 걸쳐 일부 통계적으로 유의한 변화가 관찰되었고 (윌콕슨 검정), 이 조건에 대해 4회 반복실험을 수행하였고, 이는 아마도 이 군에 대한 검정력을 증가시켰을 가능성이 크다. 유사하게, 또한 α-다양성은 Chao1 및 샤논(Shannon) 지수에 의해 측정된 바와 같이 시간에 따라 시각적으로 감소하였다. α-다양성에서의 이러한 하락은 아마도 폐쇄 시스템에서 발생하는 종의 자연 손실을 반영할 가능성이 크다. 그러나, 선택된 분류군의 유의한 과다성장의 경우에, 잔류하는 분류군의 수준이 검출 수준 미만으로 떨어질 수 있기 때문에 감소된 α-다양성이 또한 관찰될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 0, 6 및 24시간에 시험된 조건 사이의 α-다양성에서의 통계적으로 유의한 변화 뿐만 아니라 시간에 따른 개별 조건에 대한 변화는 관찰되지 않았다. 4개의 반복실험을 갖는 물 용기를 제외하고는, 조건당 제한된 수의 반복실험이 다시 원인이 될 수 있다.
개체 사이의 미생물총 다양성 (β 다양성)을 추가로 조사하기 위해, 주요 좌표 분석 (PCoA) 접근법을 사용하였다. 미생물총 조성의 명백한 이동이 실험 24시간 동안 발생하였음이 밝혀졌으며, 이는 발효의 길이가 다양성에 주요 영향을 미쳤음을 나타내고, 여기서 PC1은 폐쇄 시스템에서 예상된 바와 같이 분산의 66.07%를 설명한다. 초기에 모든 용기는 함께 확고하게 클러스터링되었고, 이는 다시 출발 조건이 잘 표준화되었음을 나타낸다. 발효 종료시, 미생물총은 PC2를 따라 확산되었다 (분산의 12.44%를 설명함). 특히, 락테올® 용기로부터의 미생물총은 락토스 용기로부터의 미생물총과 함께 PC2 축의 상단에서 클러스터링한 반면, 락트산 용기로부터의 미생물총은 물 용기로부터의 미생물총과 함께 PC2 축의 하단에서 클러스터링하였다 (도 2). 0, 6 및 24시간에 시험된 조건 사이의 β-다양성에서의 통계적으로 유의한 변화뿐만 아니라 시간에서의 개별 조건에 대한 변화는 관찰되지 않았다. 조건당 제한된 수의 반복실험이 다시 원인이 될 수 있다.
마지막으로, RSV 수준에서의 분석은 보다 특이적인 분류학적 차이가 평가되도록 하였다. 26개의 RSV의 존재비는 증가한 반면, 33개의 RSV는 물 용기에 비해 락테올® 용기에서 감소하였다. 동시에, 단지 3개 및 14개의 RSV의 존재비가 물 용기에 비해 락트산 및 락토스 용기에서 각각 변화하였다. 특히, 락테올® 용기에서 증가된 6개의 RSV는 비피도박테리움 속으로 할당되었고, 이들 중 1개인 비피도박테리움 롱검만이 종 수준으로 할당될 수 있었다. 락토스 용기에서, 비피도박테리움에 할당된 5개의 RSV의 수준이 물 용기에 비교하여 증가하였고, 이들 중 3개만이 락테올® 용기와 중첩되었다.
시간에 따른 존재비 변화의 분석은 적어도 하나의 조건에서 상이하게 풍부한 302개의 RSV를 생성하였다. 특히, 36개의 RSV는 모든 조건에서 시간에 따라 증가한 반면, 108개의 RSV는 감소하였다. 8개의 RSV가 락테올® 용기에서, 20개의 RSV가 락토스에서, 4개의 RSV가 락트산에서, 19개의 RSV가 물 용기에서 특이적으로 변화되었다.
락테올
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은 발효 동안 비피도박테리아의 수를 증가시킨다
발효의 시작 시에, 임의의 용기 사이에 비피도박테리움 수준 (일원 ANOVA; F3,8=0.912, p=0.477) 및 총 박테리아 로드 (일원 ANOVA; F3,8=0.074, p=0.972)의 차이가 없었다 (도 1). 24시간 발효 후에, 용기 사이에 비피도박테리움 수준의 차이가 있었다 (크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정, p=0.031) (도 1). 물 및 락테올® 보충된 용기에서의 비피도박테리움 수준은 유의하게 상이한 반면 (수동 사후, 다중 비교를 위해 p-값 대조됨, p=0.007 < α/k), 모든 다른 용기 사이의 다른 차이는 유의하지 않았다. 또한, 시간에 따른 각각의 용기에서의 비피도박테리움의 증가는 유의하지 않았다 (관련 샘플 윌콕슨 부호 순위 검정, p=0.109). 동시에, 용기 보충은 24시간 발효에서 총 박테리아 로드에 대해 유의한 효과를 갖지 않았다 (웰치 검정, p=0.108; 브라운-포르시테(Brown-Forsythe), p=0.285) (도 1). 또한 시간 경과에 따라 변화가 없었다 (관련 샘플 윌콕슨 부호 순위 검정, p≥0.109).
대사물 변화
발효 공정의 모니터링은 락트산 또는 물 대조군과 비교하여 락테올®의 존재 하에 pH를 제어하는데 요구되는 대략 4배 더 많은 양의 NaOH (뿐만 아니라 연장된 요건)를 밝혀내었다. 이는 락테올®의 존재 하에, 발효 공정이 보다 많은 양의 산의 생산을 유발하였고, 이 공정이 보다 긴 시간 동안 유지되었음을 시사한다. 발효 전후에 용기에 존재하는 화합물의 성질을 규명하기 위해 대사체학 분석을 수행하였다. 발효 시작시에 물, 락트산 및 락토스가 보충된 용기로부터 수집한 샘플은 함께 확고하게 클러스터링한 반면, 락테올® 용기로부터의 샘플은 별개의 클러스터를 생성하였다. 특히, 초기에, 33종의 주석달린 화합물이 물 용기와 비교하여 락테올® 용기에서 상승된 수준을 가졌다. 24시간 발효 후, 모든 용기에서의 대사물 조성이 이동하였고, 락테올® 용기에서의 변화가 가장 현저하였다. 이 단계에서, 39종의 주석달린 화합물은 물 용기과 비교하여 락테올® 용기에서 유의하게 더 높은 수준을 가졌다.
단쇄 지방산 (SCFA)
생산된 대사물의 성질을 확인하기 위해, 본 발명자들은 SCFA, 및 구체적으로 그의 유익한 효과가 알려진 부티르산에 초점을 맞추었다. 발효의 시작 전에, 낮은 수준의 개별 SCFA가 존재하였고, 아세트산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.037; 사후 본페로니 p>0.05), 이소부티르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.023; 사후 본페로니 p>0.05) 및 발레르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=1.000)의 수준에서 용기 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 락테올® 용기에서, 본 발명자들은 락트산 용기와 비교하여 약간 더 높은 수준의 부티르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.030; 사후 본페로니 p=0.050) 및 프로피온산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.026; 사후 본페로니 p=0.016)을 검출하였지만, 물 또는 락토스 용기와 비교하여 차이는 없었다 (크루스칼-왈리스 검정 p<0.05; 사후 본페로니 p>0.05). 포름산의 수준은 락트산과 락토스 용기 사이에서만 상이하였다 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.012; 사후 본페로니 p=0.013). 24시간 발효 후에, 본 발명자들은 모든 다른 용기에 비해 락테올® 용기에서 아세트산의 상승된 수준을 관찰하였다. 추가로, 24시간 발효 후에 포름산 수준은 물 및 락토스 용기에 비해 락테올® 용기에서 유의하게 더 높았다. 발효 후, 프로피온산 (F(3,9)=0.382, p=0.769), 부티르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.401), 이소부티르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.094) 및 발레르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.205) 수준에서 용기 사이에 유의한 차이는 없었다. 모든 샘플에서 이소발레르산, 헥산산 및 헵탄산의 수준은 검출 하한 (LOD) 미만이었다. 추가로, 발효 전 발레르산 농도는 LOD 미만이었다.
TCA 사이클
발효 전에, 물과 비교하여 상승된 수준의 숙신산이 락테올® 용기에서 검출되었고 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.018, 사후 본페로니 p=0.010), 푸마르산이 락토스 용기에서 검출되었다 (F(3,9)=5.599, p=0.019; 사후 본페로니 p=0.017). 예상대로, 락트산의 수준은 물에 비해 락트산 용기에서 더 높았다 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.010, 사후 본페로니 p=0.008). 락트산 수준은 락테올® 용기에서 증가하였지만, 다중 비교 기준을 통과하지는 않았다 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.010, 쌍별 비교 사후 본페로니 p=0.028, 다중 비교 조정된 사후 본페로니 p=0.171). 락트산과 락토스 용기 사이에서 피루베이트의 차이가 검출되었다 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.013, 사후 본페로니 p=0.019). 24시간 후, 푸마르산 (크루스칼-왈리스 검정 p=0.025, 사후 본페로니 p=0.035), 숙신산 (F(3,9)=22.239, p<0.0005; 사후 본페로니 p<0.0005), 및 락트산 (F(3,9)=120.294, p<0.0005; 사후 본페로니 p<0.0005)의 발효 수준이 물과 비교하여 락테올® 용기에서 상승되었다. 락트산의 수준은 또한 물과 비교하여 락트산 (F(3,9)=120.294, p<0.0005; 사후 본페로니 p=0.001) 및 락토스 (F(3,9)=120.294, p<0.0005; 사후 본페로니 p<0.0005) 용기에서 상승되었지만, 락테올® 용기에서 발견된 수준 (둘 다에 대해 사후 본페로니 p<0.0005)은 아니었다. 나머지 6종의 TCA 회로 화합물에 대한 측정에서, 발효 전 및/또는 후에 용기들 사이에 차이는 없었다 (크루스칼-왈리스 검정 p>0.05).
아미노산
발효 전에, 19종의 시험된 아미노산 중 12종이 물 용기에 비해 락테올® 용기에서 상승된 수준을 가졌다. 특히, 트립토판 수준은 모든 다른 용기과 비교하여 락테올® 용기에서 더 높았다 (F(3,9)=17.431, p<0.0005; 사후 본페로니 p≤0.006). 발효 후, 19종의 시험된 아미노산 중 10종이 물 용기와 비교하여 락테올® 용기에서 상승된 수준을 가졌다.
다른 대사물
발효 전에, 61종의 시험된 화합물 중 20종은 물 용기와 비교하여 락테올® 용기에서 상승된 수준을 가졌다. 발효 후에, 61종의 시험된 화합물 중 26종의 확인되고 주석달린 화합물이 물 용기과 비교하여 락테올® 용기에서 상승된 수준을 가졌다.
결론
실시예 1은 인간 대변 샘플을 접종한 혐기성 회분식 배양물에서 미생물총 조성에 대한 락테올®의 영향을 조사하였다. 락테올®은 엘. 페르멘툼 및 엘. 델브루엑키이에 의한 초기 발효 동안 생성되는 락트산뿐만 아니라 동결건조 공정을 용이하게 하기 위해 생산 후에 첨가되는 락토스를 함유하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 물 이외의 추가의 대조군으로서, 본 발명자들은 개별적으로 락트산 및 락토스를 보충한 것을 포함하였다. 마이크로바이옴 및 대사물 분석 둘 다는 발효 전에 수집된 샘플의 확고한 클러스터링을 나타내었고, 이는 한편으로는 제제의 재현성, 및 다른 한편으로는 인간 장 마이크로바이옴의 높은 조성 다양성을 확인시켜 준다. 예상된 바와 같이, 본 발명자들은 마이크로바이옴과 관련하여 용기 사이의 차이를 관찰하지 못하였다. 그러나, 락테올® 용기는 주로 아미노산의 상승된 수준의 관점에서 변경된 대사물 프로파일을 나타내었으며, 이는 이러한 조건을 대조군과 구별되게 설정하였다.
시간에 따라 모든 용기에서의 마이크로바이옴 및 대사물 프로파일 둘 다가 이동하였고, 락테올® 용기에서의 변화가 가장 현저하였다. 락테올® 보충은 24시간 발효 동안 비피도박테리움의 상대 존재비뿐만 아니라 절대 존재비 둘 다를 증가시켰다. 락테올® 용기에서의 이러한 확장에 따라, 본 발명자들은 이전에 비피도박테리아에 의해 생산되는 것으로 나타난 아세트산, 포름산 및 락트산의 증가된 수준을 관찰하였다. 비피도박테리아 또는 SCFA의 존재는 일반적으로 유익한 것으로 간주되었다.
실시예 2
락테올
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제제
성장 실험에서, 재구성된 락테올® 분말 (0.34 g/ml)을 사용하였다. 대안적으로, 저 락토스 락테올® (LLL)을 사용하였다. 각각의 제제는 달리 언급되지 않는 한 용액 ml당 5 x 109 내지 1 x 1010개의 세포체를 함유하였다.
비피도박테리움 접종물의 제조
비피도박테리움 균주 (표 1)의 -80℃ 원액 100 μl를 L-시스테인 (최종 농도 0.6 g/L) 및 레주자린 (최종 농도 1 mg/L)이 보충된 MRS 브로쓰 (디프코(Difco), BD) 10 ml를 함유하는 혐기성 헌게이트(Hungate) 튜브에 주입하였다. 튜브를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 100배 희석된 밤샘 배양물 100 μl를 달리 언급되지 않는 한 접종물로서 사용하였다. 균주 비. 비피둠 LMG 11041 및 비. 갈리쿰 APC 838의 경우, 불량한 밤새 성장으로 인해 10배 희석된 밤샘 배양물 100 μl를 사용하였다.
비피도박테리아성장촉진성 검정
혐기성 헌게이트 튜브 내의 L-시스테인 (최종 농도 0.6 g/L) 및 레자주린 (최종 농도 1 mg/L)이 보충된 9 ml의 기본 배지 (10 x 또는 15 x 희석됨; 희석 배율은 물로 보충될 경우의 비피도박테리움의 무성장 또는 최소 성장을 위해 요구되는 분말 배지의 각각의 배치에 따라 설정됨) MRS 브로쓰에 1 ml의 테스트 용액 (락테올® 제제) 또는 대조군 중 하나 (우세하게 물)를 보충하였다. 이어서, 헌게이트 튜브를 접종하고, 산소 접근을 제한하기 위해 시린지 및 바늘을 사용하여 T0 샘플을 수집하였다. 헌게이트 튜브를 37℃에서 인큐베이션하고, 규칙적인 간격으로 샘플을 채취하였다. 수집된 샘플을 PBS 중에 연속 희석하고, 100 μl를 L-시스테인 (최종 농도 0.6 g/L)이 보충된 신선한 MRS 한천 플레이트 상에 이중으로 플레이팅하였다. 플레이트를 혐기성 발생기 (바이오메리욱스)가 장착된 병에서 37℃에서 적어도 48시간 동안 인큐베이션한 후, 콜로니 카운팅하였다.
락테올
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처리
(a) 효소 처리
5 ml의 락테올® 용액에 10 mg의 프로테이나제 K (1 mM CaCl2·2H2O가 첨가됨), 트립신, 펩신, 프로나제, 리소자임, 또는 α-키모트립신을 보충하였다. 락테올® 용액의 5 ml 세포 및 상청액 분획에 1000 유닛 셀룰라제, 25 유닛 α-글루코시다제, 1000 유닛 α-아밀라제 및 125 유닛 β-갈락토시다제를 보충하였다. 튜브를 진탕시키면서 37℃에서 4시간 동안, 이어서 92℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 효소 처리된 락테올®, 세포, 및 상청액 분획을 비피도박테리아성장촉진성 검정에서 시험할 때까지 4℃에서 저장하였다. α-아밀라제 및 β-갈락토시다제로 처리된 상청액의 pH를 효소 첨가 전에 7.16으로 증가시키고, 원래 pH로 다시 조정하고, 인큐베이션 후에 여과하였다. 효소적으로 처리된 세포 또는 상청액 1 ml를 비피도박테리아성장촉진성 검정 (10 x 희석된 배지)에 사용하였다.
(b) 물리적 처리
투석
15 ml 물에 재현탁된 5.1 g의 락테올®을 세척된 1 kDa 투석 튜브 (푸르-에이-라이저 마그나(Pur-A-Lyser Magna) 1000, 시그마(Sigma))로 옮겼다. 이어서, 튜브를 4.5 L의 탈염수에 넣고, 4℃에서 4일 동안 스티어링하면서 인큐베이션하였다. 물을 매일 교체하였다. 튜브의 내용물을 헌게이트 튜브로 옮기고, 비피도박테리아성장촉진성 검정 (10x 희석된 배지)에서 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
초음파처리
락테올® 용액을 원심분리하고, 상청액을 여과하고, 세포 펠릿을 2회 세척하였다. 상청액 및 세포 분획을 4시간 동안 초음파처리하고, 비피도박테리아성장촉진성 검정 (10 x 희석된 배지)에 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
대안적 치료 - 프로바이오틱스
실험실에서 제조된 락토바실루스 제제의 제조
락토바실루스 균주 (표 1)를 -80℃ 원액으로부터 MRS 플레이트 상에 스트리킹하였다. 10 ml MRS 브로쓰에 단일 콜로니를 접종하고, 37℃에서 밤새 혐기성으로 인큐베이션하였다. 1% 접종물을 L-시스테인 (최종 농도 0.6 g/L)이 보충된 MRS 브로쓰를 갖는 플라스크에 사용하였다. 엘비. 델브루엑키이 2z의 성장을 위한 배지에 카세인으로부터의 1% 펩신을 보충하여 그의 성장 요건을 촉진하였다. 37℃에서 밤새 혐기성 인큐베이션 후, 플라스크의 내용물을 큰 페트리 디쉬에 분배하고, 동결-건조될 때까지 -80℃에 두었다. 동결-건조된 내용물을 플레이트로부터 긁어내고, 0.34 g/ml 물에 재현탁시킨 후, 110℃에서 1시간 동안 열 처리하고 (락테올® 제조 동안 열 처리가 적용됨), 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
비피도박테리아에 대한 시판 제품의 효과
시판 제품의 용액을 그의 1일 용량에 상응하는 농도로 제조하였다. 특히, 1개의 컬처렐(Culturelle) 캡슐의 내용물 (100억개 세포의 락티카제이바실루스 람노수스(Lacticaseibacillus rhamnosus) GG 및 이눌린)을 1 ml의 물에 재현탁시켰다. 3개의 엔테로게르미나(Enterogermina)의 플라콘의 내용물 (사노피(SANOFI); 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii) SIN, 비. 클라우시이(B. clausii) O/C, 비. 클라우시이 T, 및 비. 클라우시이 N/R의 포자 60억개)을 원심분리하고 (4696 x g에서 10분), 1 ml의 물에 재현탁시켰다. 바이오가이아(BioGaia) (리모실락토바실루스 루테리(Limosilactobacillus reuteri) DSM 17938 108 CFU) 5 방울을 물 1 ml에 재현탁시켰다. 울트라 레부르(Ultra Levure) (바이오코덱스(BIOCODEX); 200 mg의 사카로미세스 보울라디이(Saccharomyces boulardii) CNCM I-745)를 1 ml의 물에 재현탁시켰다. 락테올® (340 mg, 엘비. 페르멘툼 및 엘비. 델브루엑키이 100억개 세포) 1개의 캡슐의 등가량을 물 1 ml 중에 재현탁시켰다. 1 ml의 시판 제품 용액을 사용하여 변형된 비피도박테리아성장촉진성 검정 (15x 희석된 배지)에서 그의 효과를 시험하였다. 연속 희석된 샘플을 L-시스테인 (0.6 g/L), 시클로헥시미드 (70 mg/L), 및 무피로신 (50 mg/L)을 갖는 MRS 플레이트 상에 플레이팅하였다. 엘비. 람노수스(Lb. rhamnosus) GG (MRS 계수에서 비피도박테리아 계수를 차감함), 비. 클라우시이 (BHI 상에 플레이팅함, 호기성 인큐베이션), 엘비. 루테리(Lb. reuteri) DSM 17938 (MRS+테트라시클린 (30 μg/mL), 혐기성), 및 사카로미세스 보울라르디이(Saccharomyces boulardii) CNCM I-745 (사보라우드(Saboraud) (4% 덱스트로스), 호기성 인큐베이션)에 대해 생성물 계수의 선택적 계수를 수행하였다.
락테올
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정제
고체 상 추출 C18 칼럼
모든 C18 정제에서, 절반 강도의 락테올® 제제 (10 ml 중 1.7 g과 등가량)를 사용하였으며, 이는 이것이 10 g 스트라타 C18 고체 상 추출 칼럼 (페노메넥스)의 최대 결합 용량이기 때문이다. 결과적으로, 유동, 세척 및 용리 분획은 달리 언급되지 않는 한 절반 강도였다. 절반 강도 락테올®을 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다 (로터 TX-400을 갖는 서볼 ST 16R). 생성된 상청액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 고체 입자를 제거하였다. 10 g 스트라타 C18 고체 상 추출 칼럼을 진공 펌프에 연결하고, 120 ml의 메탄올로 컨디셔닝하고, 120 ml의 HPLC 물로 평형화시켰다. 여과된 상청액을 칼럼 상에 적용하고, 중력 통과시키고, 생성된 통과액을 수집하였다. 다음에, 칼럼을 5% 메탄올 120 ml로 세척하고, 세척물을 수집하였다. 칼럼의 5분의 진공 건조 후, 120 ml의 메탄올을 칼럼에 적용하여 흡착제에 여전히 결합된 분획의 용리를 허용하고, 용리액을 수집하였다. 수집된 세척 및 용리 분획을 회전 증발시켜 용매를 제거하고, 샘플을 물 중 초기 농도로 농축시켰다. 용리, 세척 및 용리 분획을 필터-멸균하고 (0.2 μm 필터), 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
황산암모늄 침전
저 락토스 락테올® (LLL) 용액 (10 ml 중 3.4 g과 등가량)을 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다 (장비 세부사항). 생성된 상청액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하여 고체 입자를 제거하였다. 서서히 3.18 g의 황산암모늄 (50% 포화에 도달하는 것을 목표로 함)을 실온에서 10 ml의 상청액에 이중으로 용해시켰다. 1개의 플라스크를 6시간 동안 인큐베이션하고, 제2 플라스크를 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플라스크 내용물을 4℃에서 15분 동안 5000 rpm으로 원심분리하였다. 제2 플라스크로부터의 상청액에 황산암모늄을 보충하여 60% 포화에 도달하도록 하고, 이전과 같이 인큐베이션하였다. 이러한 접근법은 80% 포화에 도달할 때까지 계속되었다 (90% 포화에 도달하는데 요구되는 황산암모늄은 용해되지 않았다). 상이한 단계에서 수집된 침전물을 완충제 (150 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.5) 10 ml 중에 용해시키고, C18 칼럼 (상기 참조)을 사용하여 탈염될 때까지 4℃에서 저장하였다.
HPLC 분석
미가공 샘플의 HPLC 분석
상청액 샘플을 밀리 큐 물 중에 1/2 (락테올® 및 LLL) 및 1/7 (엘비. 페르멘툼 및 엘비. 델브루엑키이)로 희석하였다. 100 μl 분취액을 1 ml/분의 30% 아세토니트릴 등용매 구배로 실행되는 토소 하스(Toso Haas) 겔 투과 칼럼 (TSK 겔 G2000SW 및 G2000SWXL 연속, 5μ, 7.8 x 30 cm)에 적용하였다. HPLC 용리액을 214 nm에서의 UV 흡수에 의해 모니터링하고, 분획을 검정을 위해 35분에 걸쳐 1분 간격으로 수집하였다.
C18 정제된 샘플의 HPLC 분석
상청액 샘플의 27 x 80 μl 분취액 (총 2160 μl)을 35분에 걸쳐 1 ml/분으로 30% 아세토니트릴 0.1% TFA 등용매 구배로 실행하는 토소 하스 겔 투과 칼럼 (TSK 겔 G2000SW 및 G2000SWXL 연속, 5μ, 7.8 x 30 cm)에 적용하였다. HPLC 용리액을 214 nm에서의 UV 흡수에 의해 모니터링하고, 분획을 1분 간격으로 수집하였다. 분획 37-60을 MALDI TOF 질량 분광측정법에서 시험하고, 하기 원심분리 농도를 비피도박테리아성장촉진성 검정에서 시험하였다.
비-비피도박테리아 균주의 테스트
이. 파에시움(E. faecium) 및 이. 콜라이(E. coli)의 -80℃ 원액을 각각 트립톤 대두 한천 (TSA, 생산자) 및 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB, 생산자) 플레이트 상에 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 사용하여 20 ml의 TSB 또는 LB 브로쓰에 접종한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 9 ml의 1.1x MRS 브로쓰 (0.6 g/L L-시스테인, 1 mg/L 레자주린) 또는 희석 범위의 LB (물 또는 PBS 중) 또는 PBS를 함유하는 혐기성 헌게이트 튜브에 1 ml 물 또는 1 ml의 락테올® 용액을 보충하고, 100배 희석된 밤샘 배양물 100 μl를 접종하였다. 혐기성 튜브를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 수집된 샘플을 연속 희석하고, TSA 또는 LB 플레이트 상에 정치한 후, 37℃에서 밤새 호기성 인큐베이션하였다.
결과
선택된 비피도박테리아의 성장에 대한 락테올
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및 락테올
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-유사 제제의 효과
락테올®은 순수 배양물에서 유아-연관 및 성인-연관 비피도박테리아 둘 다의 성장을 자극하였다. 구체적으로, 비피도박테리움 롱검 아종. 인판티스 ATCC 15697 (B1; t4 = 18.555, p < 0.0005), 비피도박테리움 롱검 아종. 롱검 JCM 7053 (B2; t4 = 15.626, p = 0.003), 비피도박테리움 비피둠 LMG 11041 (ATCC29521) (B3; t4 = -7.432, p = 0.002), 비피도박테리움 브레베 JCM7017 (B4; t4 = 7.667, p = 0.016), 비피도박테리움 갈리쿰 APC 838 (ATCC 49850) (B5; t4 = -2.828, p = 0.047), 비피도박테리움 안굴라툼 APC 329 (ATCC 27535) (B7; t4 = 12.065, p < 0.0005), 및 비피도박테리움 롱검 아종. 롱검 APC 2744 (ATCC 15707) (B8; t4 = 14.603, p < 0.0005) (도 2a). 보다 상세하게, 락테올®은 순수 배양물 중 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 성장을 자극하였다 (ANOVA; F4,10 = 108.650, p < 0.0005; 사후 본페로니, p < 0.0005) (도 2b). 동시에, 락테올®의 가용성 (상청액) 및 불용성 (주로 세포) 분획은 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 성장을 락테올®과 동일한 정도로 자극하였다 (사후 본페로니, 물과 비교하여 모두 p < 0.0005, 락테올®과 비교하여 각각 p = 1, p = 0.165) (도 2b). 락테올®의 저 락토스 버전은 또한 전체 락테올®과 대등한 성장 자극을 나타내었다 (사후 본페로니, 물과 비교하여 p < 0.0005, 락테올®과 비교하여 p = 0.225) (도 2b).
비피도박테리움의 성장은 락테올® 용량에 의존적이었다 (도 2c; ANOVA; F5,11 = 59.654, p < 0.0005). 절반 강도 락테올®은 락테올®과 동일한 정도로 성장을 자극한 반면 (사후 본페로니, p = 1), 100배 희석된 락테올®에서 비피도박테리움 계수는 물 대조군에서와 동일하였다 (사후 본페로니, p = 1). 락테올® 활성은 효소 처리 및 효소를 불활성화시키는데 통상적으로 사용되는 열 처리 (92℃에서 1시간)에 의해 영향을 받지 않았다. 다양한 단백질분해 효소로 처리된 락테올® 제제 (도 2d) 및 모의-처리된 락테올® (도 2d)은 순수 배양물 중 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 성장을 자극하였다 (ANOVA; F8,18 = 73.582, p < 0.0005; 물과 비교하여 사후 본페로니, 모두 p < 0.0005; 락테올®과 비교하여 사후 본페로니, 모두 p = 1) (도 2d). 탄수화물 소화 효소로 처리된 락테올® 제제의 상청액 및 세포 분획 (도 2e) 및 그의 모의-처리된 버전 (도 2e)은 순수 배양물 중 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 성장을 자극하였다 (ANOVA; F10,22 = 85.783, p < 0.0005; 물과 비교하여 사후 본페로니, 모두 p < 0.0005; 락테올®의 상청액 또는 세포 분획과 비교한 사후 본페로니, 모두 p > 0.05) (도 1e). 흥미롭게도, 1 kDa 투석된 락테올®은 또한 순수 배양물 중 비. 롱검 아종 인판티스 ATCC 15697의 성장을 자극하였으나 (도 2D; ANOVA; F8,18=73.582, p<0.0005; 물과 비교하여 사후 본페로니, p<0.0005), 락테올®의 수준은 아니었다 (ANOVA; F8,18=73.582, p<0.0005; 락테올®과 비교하여 사후 본페로니, p<0.0005). 초음파처리는 락테올®의 에테르 상청액 또는 세포 분획의 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 2e; ANOVA; F10,22 = 85.783, p < 0.0005; 물과 비교하여 사후 본페로니, 모두 p < 0.0005); 락테올®의 상청액 또는 세포 분획과 비교하여 사후 본페로니, 모두 p = 0.05). 락테올®-유사 제제에 반응한 24시간 성장 수준에서 차이가 있었다 (도 2f; ANOVA; F10,21 = 141.368, p < 0.0005). 락테올® 및 엘비. 페르멘툼 1b는 비피도박테리움 성장을 대등하게 자극한 반면 (사후 본페로니, 서로 비교하여 p = 1, 물과 비교하여 p < 0.0005), 엘비. 페르멘툼 APC249, 엘비. 델브루엑키이 APC2421, 엘비. 델브루엑키이 APC2516, 엘비. 루테리 APC2482는 성장을 촉진하지 않았다 (사후 본페로니, 모두 p < 0.0005). 6개 이하의 CFU가 플레이트 상에서 회수되었기 때문에, 엘비. 호미니스 APC2512 보충물은 비피도박테리움에 대한 명백한 사멸 효과를 가졌다. 엘비. 델브루엑키이 2z 및 엘비. 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 APC2493은 물 보충물과 동일한 효과를 가졌다 (사후 본페로니, 각각 p = 1 및 p = 0.060).
LLL 및 엘비. 페르멘툼 1b 둘 다에 대해, 상청액 및 전체 제제 (상청액 및 세포를 함유함)가 비피도박테리움의 성장을 동등하게 자극하였으나 (도 2g; ANOVA; F9,20 = 113.988, p < 0.0005; 사후 본페로니, p ≥ 0.514), 락테올®과 동일한 수준은 아니었다 (사후 본페로니, p ≤ 0.039). LLL 세포 (엘비. 페르멘툼 1b 세포는 아님) 및 LLL 및 엘비. 페르멘툼 1b의 비-투석 성분은 대등한 중간 비피도박테리움 성장 자극을 나타냈다 (사후 본페로니, 서로 비교하여 p = 1, 물 및 락테올®과 비교하여 p ≤ 0.036).
비피도박테리아 성장에 대한 상업적 프로바이오틱 제제의 효과
시판 제품과 함께 인큐베이션하기 전에, 조건 사이에 차이가 없었다 (ANOVA; F5,12 = 0.627, p = 0.683). 24시간 인큐베이션 후, 비피도박테리아 계수는 유의하게 상이하였다 (ANOVA; F5,12 = 574.535, p < 0.0005). 컬처렐 보충물은 비피도박테리아의 회수를 막았다 (임의의 다른 처리와 비교하여 사후 본페로니, p < 0.0005). 엔테로게르미나 및 바이오가이아는 둘 다 비피도박테리아 계수에 영향을 미치지 않았고, 여기서 계수는 물과 대등하였다 (물과 비교하여 사후 본페로니, 각각 p = 0.192 및 p = 0.242). 마지막으로, 울트라 레부르는 비피도박테리아 성장을 LLL과 대등한 수준으로 자극하였다 (물과 비교하여 사후 본페로니, p < 0.0005; 저 락토스 락테올®과 비교하여 사후 본페로니, p = 1) (도 3a). 24시간에 걸쳐, 시판 제품을 구성하는 미생물의 수에는 변화가 없었다: 컬처렐 (윌콕슨 검정, p = 0.109), 엔테로게르미나 (t2=1.941, p = 0.192), 바이오가이아 (t2=0.595, p = 0.612), 및 울트라 레부르 (t2=-0.253, p = 0.824) (도 3b).
락테올
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제제의 정제
SPE C18 정제
C18 칼럼에 대한 최적화된 정제 프로토콜로 절반 강도 락테올® 상청액을 프로세싱하는 것은 생성된 분획에 대한 비피도박테리아 CFU 계수의 차이를 가져왔다 (도 4a; ANOVA, F5,12 = 117.546, p < 0.0005). 통과액을 제외한 모든 분획 (사후 본페로니 p = 1)은 물 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내었다 (사후 본페로니 p < 0.0005). 세척 및 풀링된 분획은 절반 강도 락테올® 상청액과 비교하여 차이를 나타내지 않았으며 (사후 본페로니 각각 p = 1 및 p = 0.066), 이는 활성 분획이 세척 분획에 존재함을 나타낸다. 절반 강도 엘비. 페르멘툼 1b (도 4b; ANOVA, F5,12 = 110.087, p < 0.0005; 사후 본페로니 p = 0.053) 및 절반 강도 엘비. 페르멘툼 APC249 (도 4B; ANOVA, F5,12 = 57.473, p < 0.0005; 사후 본페로니 p = 1) 둘 다의 C18 정제로부터의 세척 분획은 절반 강도 LLL 상청액 (뿐만 아니라 그 자신의 절반 강도 상청액)과 동일한 수준의 비피도박테리움 성장 자극을 나타낸 한편, 유동 및 용리 분획은 성장 자극을 나타내지 않았다. 엘비. 페르멘툼 1b의 전체 강도 세척 분획 (절반 강도 엘비. 페르멘툼 1b의 2배 농축된 세척 분획)을 시험할 때, 본 발명자들은 LLL (도 4c; ANOVA, F15,32 = 189.939, p < 0.0005; 사후 본페로니 p = 1) 및 절반 강도 엘비. 페르멘툼 1b (사후 본페로니 p = 0.700) 상청액과 동일한 비피도박테리움 성장 자극을 관찰하였다. 절반 강도 엘비. 페르멘툼 APC249 상청액은 비피도박테리움 성장을 자극하였지만 (비록 전체 또는 절반 강도 LLL 및 엘비. 페르멘툼 APC249의 수준은 아니지만), 전체 엘비. 페르멘툼 APC249 상청액은 비피도박테리움 성장을 자극하지 않았고 (물과 비교하여 사후 본페로니 각각 p < 0.0005 및 p = 1), 이는 엘비. 페르멘툼 APC249 상청액 내의 농도-의존적 비피도박테리아성장정지성 화합물(들)의 존재를 가리킨다. 그러나, 엘비. 페르멘툼 APC249의 전체 강도 세척 분획 (절반 강도 엘비. 페르멘툼 APC249의 2배 농축된 세척 분획)으로, 절반 강도 LLL 상청액과 동일한 비피도박테리움 성장 자극이 나타났고 (사후 본페로니 p =1), 이는 비피도박테리아성장정지성 화합물(들)이 C18 정제 공정 동안 적어도 부분적으로 제거된다는 것을 시사한다.
황산암모늄 침전
비피도박테리움의 24시간 성장 후의 계수 차이가 관찰되었다 (도 5; 독립적 샘플 크루스칼-왈리스, χ2(23) = 69.998, p < 0.0005). 황산암모늄 침전물의 C18 세정으로부터의 세척 1 분획은 일관되게 최고 비피도박테리움 계수를 제공하였다. 황산암모늄 농도의 각각의 단계적인 증가는 LLL 및 물에 대등한 비피도박테리움 성장의 자극을 나타내는 제제를 생성하였다.
락테올
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및 그의 분획의 HPLC 분석
락테올®, LLL 및 2종의 생산자 균주의 상청액의 UV 흡수 프로파일은 제제의 매우 다양한 조성을 확인하였다. C18 또는 SI1 칼럼을 사용한 SPE 정제는 비피도박테리아 성장에 영향을 미치지 않으면서 큰 비율의 화합물을 제거하였고, 그 결과 약 23분에 더 간단한 UV 흡수 피크가 나타났다 (도 6).
농축 후 C18 정제된 절반-강도 락테올®을 사용한 다중 HPLC 실행 동안 수집된 분획을 비피도박테리아성장촉진 검정에서 시험하였다. 분획 52는 비피도박테리움 계수가 더 높았기 때문에 유망한 결과를 나타냈다. 그러나, 이는 단일 반복실험이었고, 음성 대조군 (진한 HPLC 용매)은 감소된 비피도박테리움 수준을 나타내었다 (도 7).
MALDI TOF 질량 분광측정법은 분획 51, 52 및 53에서 유사한 프로파일을 나타내었으며, 가장 현저한 피크는 측정된 샘플로부터가 아니라 질량 분광측정 설정으로부터 유래하였다. 분획 52에서, 본 발명자들은 2500 내지 3000 m/z 범위의 질량의 증가된 발생을 관찰하였으며, 이는 규정되지 않은 분자의 존재를 반영한다. 5237.08 m/z에서의 단일 피크가 분획 52에는 존재하였지만, 이웃 분획에는 존재하지 않았다 (도 8).
비피도박테리아 성장에 대한 락테올
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-유사 제제의 농도-의존성 효과
락테올®-유사 제제의 상청액을 시험할 때 차이가 관찰되었다 (도 9a; ANOVA; F15,32 = 189.939, p < 0.0005). 전체 엘비. 페르멘툼 APC249 제제의 상청액은 비피도박테리움 성장을 자극하지 않은 반면 (사후 본페로니, 물과 비교하여 p = 1), 이의 절반 강도는 성장을 자극하였으나 (사후 본페로니, 물과 비교하여 p < 0.0005), 엘비. 페르멘툼 1b 및 LLL의 전체 (사후 본페로니, LLL과 비교하여 p = 0.024, 엘비. 페르멘툼 1b과 비교하여 p < 0.0005) 및 절반 강도 상청액 (사후 본페로니, 1/2 LLL 상청액과 비교하여 p = 0.009, 1/2 엘비. 페르멘툼 1b 상청액과 비교하여 p < 0.0005)의 수준은 아니었다. 상청액 및 세포 둘 다를 함유하는 제제를 사용한 경우 비피도박테리움의 24시간 성장에 대한 농도 의존성 효과가 또한 관찰되었다 (도 9b; ANOVA; F12,26 = 120.838, p < 0.0005). 전체 농도의 엘비. 델브루엑키이 APC2421, 엘비. 델브루엑키이 APC2516, 및 엘비. 루테리 APC2482는 비피도박테리움의 24시간 성장을 자극할 수 없었지만 (사후 본페로니, 물과 비교하여 각각 p = 1, p = 0.912, 및 p = 1), 그의 절반 강도는 성장을 자극하였으나 (사후 본페로니, 물과 비교하여 모두 p < 0.0005), LLL에 대해 관찰된 수준은 아니었다 (사후 본페로니, LLL과 비교하여 모두 p < 0.0005). 대조적으로, 절반 강도의 LLL은 전체 LLL과 비교하여 더 적은 자극을 유발한 반면 (사후 본페로니, p = 0.003), 절반 및 전체 농도의 엘비. 델브루엑키이 2z (사후 본페로니, p = 0.104) 및 엘비. 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 APC2493 (사후 본페로니, p = 0.112)는 농도와 무관하게 대등한 자극을 나타내었다.
비피도박테리아에 대한 MRS의 효과
10 x 희석된 배지에서, 농축된 MRS (cMRS; 락테올®의 중량 등가량)가 비피도박테리움 성장을 락테올®과 대등한 정도로 자극하였고 (도 10a; ANOVA; F3,8 = 12.078, p = 0.002; 사후 본페로니, p = 1), LLL 및 이의 상청액 (사후 본페로니, p ≤ 0.003)보다 더 양호하였다. 절반 농축된 MRS (1/2 cMRS)의 C18 분획으로의 보충 후 비피도박테리움 계수에 차이가 있었다 (도 10b; 독립 샘플 크루스칼-왈리스; 크루스칼-왈리스, χ2(5) = 15.222, p = 0.009). 1/2 cMRS에 이어서 수치적으로 가장 높은 계수를 갖는 1/2 cMRS C18 세척 분획이 이어진다.
결론
실시예 1에서, 락테올® 보충물이 24시간 인간 대변 발효 동안 비피도박테리아의 상대 및 절대 존재비 둘 다를 증가시켰음이 입증되었다. 실시예 2는 락테올®이 비피도박테리아의 성장을 자극한다는 점에서 발효기 데이터를 확인한다. 이는, 예를 들어 유아 및 성인 개체 둘 다로부터 단리된 시험된 비피도박테리움 균주의 71% (7명 중 5명)의 성장 자극에 의해 예시된다. 락테올® 활성은 용량-의존성이었고, 가장 높은 활성은 34 mg/ml에서 관찰된 반면, 100배 더 낮은 용량 (0.34 mg/ml)은 효과가 없었다.
프리바이오틱스는 비피도박테리아 성장을 자극하는데 통상적으로 사용되고, 특히 락토스 관련 화합물, 예컨대 락툴로스 및 GOS, 뿐만 아니라 이눌린 및 FOS는 비피도박테리아 성장의 자극에 대해 공지되어 있다. 그러나, 비피도박테리아 자극은 락테올®의 저 락토스 버전 (LLL)이 락테올®과 대등한 활성을 나타냈기 때문에 락테올®에 존재하는 락토스에 기인하지 않았다.
비피도박테리움 성장을 자극하는 능력은 프로바이오틱 제제들 간의 통상적인 형질이 아니다. 3종의 상업적으로 입수가능한 박테리아 제품은 그의 1일 용량에서 비피도박테리움 성장을 자극하지 않았다. 이들은 비. 클라우시이의 포자, 엘비. 루테리 DSM 17938 및 엘비. 람노수스 GG의 세포를 포함하였다. 흥미롭게도, 엘비. 람노수스 GG 제제로의 보충물은 이눌린을 함유하였지만, 이러한 널리 공지된 프리바이오틱의 존재에도 불구하고, 비피도박테리움 세포를 완전히 불활성화시켰다. 대조적으로, 에스. 보울라디이 CNCM I-745를 함유하는 효모-기반 제제는 락테올®과 유사한 방식으로 비피도박테리움 성장을 자극하였다.
락테올® 상청액 및 세포 분획 둘 다는 비피도박테리아 성장의 대등한 자극을 나타내었다. 그러나, LLL 세포 및 엘비. 페르멘툼 1b 세포는 동등한 자극을 나타내지 않았으며, 이는 락토스 첨가 및/또는 분무 건조/동결건조 공정이 세포 분획의 활성에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
락테올® 생산에 사용된 2개의 균주 중에서, 엘비. 페르멘툼만이 락테올®과 대등한 비피도박테리움 성장의 자극을 나타낸 반면, 엘비. 델브루엑키이는 성장 증진을 나타내지 않거나 최소로 나타내었다. 또한, 시험된 락토바실루스에 의해 생성된 5종의 다른 전체-강도 제제 중 어느 것도 비피도박테리아 성장을 락테올® 수준으로 자극할 수 없었다. 예상외로, 이들 제제의 절반 강도는 비피도박테리아 성장에 보다 다양한 영향을 미쳤다. 절반-강도 제제 중 4종은 자극 효과를 나타내었고 (엘비. 페르멘툼 APC 249, 엘비. 델브루엑키이 APC 2421, 엘비. 델브루엑키이 APC 2516, 엘비. 루테리이 APC 2482), 이는 다시 한번 락테올®의 수준은 아니었다. 이는 이들 4종의 균주의 전체-강도 제제는 억제성인 반면, 절반-강도 제제는 자극 효과를 갖는다는 점에서 또 다른 예상외의 결과이다.
여러번의 분리 실험을 수행하여 비피도박테리아 성장 자극을 담당하는 하나 이상의 화합물을 확인하였다. 첫째로, 락테올® 활성을 담당하는 화합물은, 통상적으로 수성 매트릭스로부터 소수성 또는 극성 유기 분석물의 추출에 사용되는 C18 칼럼을 사용하여 부분적으로 정제될 수 있는 것으로 입증되었다. 활성 화합물은 5% 메탄올 세척으로 칼럼으로부터 유리되었고, 이는 이들 화합물이 칼럼 흡착제에 단지 약하게 결합되었음을 나타낸다. 일반적으로, 락테올®, LLL, 및 엘비. 페르멘툼 1b의 절반 강도 제제의 재구성된 세척 분획은 그의 비-정제된 제제만큼 활성이었지만, 이들은 훨씬 더 깨끗한 크로마토그램을 가졌다. 세척 분획이 전체 농도로 농축되었을 때, 그의 활성은 락테올® 상청액과 동일하였고, 이는 다시 한번 억제 화합물이 다소 제거되었음을 입증한다. 흥미롭게도, 엘비. 페르멘툼 APC 249의 C18 정제는 불순물뿐만 아니라 이 균주에 의해 생산된 비피도박테리아성장정지성 화합물을 제거하였다. 둘째로, 크기 배제 칼럼으로부터 수집된 농축된 분획을 비피도박테리아성장촉진성 검정에서 시험하여, 이는 분획 52가 성장 자극 화합물을 포함할 가능성이 있음을 나타낸 한편, 분획 52의 MALDI TOF 질량 분광측정법은 잠재적으로 흥미로운 피크를 생성하였다.
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Claims (14)
- 락토바실루스 페르멘툼의 세포를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
- 제1항에 있어서, 락토바실루스 델브루엑키이의 세포를 또한 포함하는 조성물.
- 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
- 제1항에 있어서, 락토바실루스 페르멘툼의 세포가 성장한 배양 배지를 또한 포함하는 조성물.
- 제2항에 있어서, 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지를 또한 포함하는 조성물.
- 락토바실루스 페르멘툼의 세포 및 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 성장한 배양 배지의 상청액을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
- 제6항의 상청액의 분획 52를 포함하며, 여기서 분획 52는 MALDI TOF 질량 분광측정법에서 약 5200 m/z에서 단일 피크를 갖는 크기 배제 HPLC 분획인, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 락토바실루스 페르멘툼 및/또는 락토바실루스 델브루엑키이의 세포가 사멸 세포인 조성물.
- 락테올®을 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물 장에서 비피도박테리아의 성장을 자극함으로써 인간 또는 비-인간 동물 대상체의 장 건강을 유지 및/또는 개선하는데 사용하기 위한 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 건강한 인간인 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 장 장애를 갖는 인간인 조성물.
- 제11항에 있어서, 장 장애가 항생제-연관 설사, 디스바이오시스, 과민성 장 증후군 (IBS) 및 염증성 장 질환 (IBD)으로부터 선택된 것인 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물, 식품 보충제 또는 영양 보충제의 형태인 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 식품 보충제 또는 영양 보충제가 우유, 요거트 또는 요거트-스타일 제품, 치즈, 아이스크림, 시리얼-기반 제품, 우유-기반 분말, 유아용 조제식, 영양 조제식, 건식 구강 그릿 또는 분말, 습식 구강 페이스트 또는 젤리, 건식 경관 섭식용 그릿 또는 분말 또는 습식 경관 섭식용 유체로부터 선택된 식품 내에 포함되는 것인 조성물.
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