PT2236598E

PT2236598E - Microrganismos para melhorar o estado de saúde de indivíduos com distúrbios relacionados com a ingestão de glúten

Info

Publication number: PT2236598E
Application number: PT88652128T
Authority: PT
Inventors: Yolanda Sanz Herranz; Ester Sanchez Sanchez; Marcela Susana Medina; Giada De Palma; Inmaculada Nadal Gimenez
Original assignee: Consejo Superior Investigacion
Priority date: 2007-12-24
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2013-04-02
Also published as: CA2710666C; ES2343499B1; EP2236598B1; DK2236598T3; CN101983237B; JP2011507540A; ES2343499A1; JP5693232B2; ES2402183T3; CA2710666A1; KR20100110341A; SI2236598T1; EP2236598A4; MX2010007038A; CN101983237A; US8501169B2; BRPI0819533A2; AU2008341708A1; AU2008341708B2; EP2236598A1

Description

ΕΡ2236598Β1

DESCRIÇÃO

INDIVÍDUOS GLÚTEN

MICRORGANISMOS PARA MELHORAR O ESTADO DE SAÚDE DE COM DISTÚRBIOS RELACIONADOS COM A INGESTÃO DE

SECTOR DA TÉCNICA A invenção refere-se aos sectores da Indústria Alimentar e da Farmacêutica. Especificamente, a invenção refere-se ao campo dos probióticos e produtos derivados na forma de alimentos funcionais e novos alimentos, probióticos, simbióticos, nutracêuticos ou suplementos alimentares e composições farmacêuticas com aplicações clinicas.

ESTADO DA TÉCNICA A doença celíaca é uma enteropatia, afeção do intestino, de uma natureza imunitária causada por intolerância permanente às proteínas do glúten de cereais, que afeta indivíduos geneticamente predispostos. A doença tem um vasto espectro clínico e inclui formas típicas, atípicas, silenciosas e potenciais. As formas típicas mais frequentemente presentes nos primeiros anos de vida (6-24 meses) e manifesta principalmente com sintomas intestinais e alterações relacionadas (malabsorção, diarreia crónica, perda de peso, distensão abdominal, atraso de crescimento, etc.). É normalmente a doença crónica mais comum, com uma prevalência de 0,7 a 2,0% entre a população geral e 15 a 20% entre os familiares em primeiro grau. Também, a ingestão de glúten e a doença celíaca são associadas com outros distúrbios tais como síndroma de Down, diabetes Mellitus tipo 1, dermatite 1 ΕΡ2236598Β1 herpetiforme, miopatia, esclerose múltipla, artrite, autismo, esquizofrenia, depressão, linfomas, e ataxia. A relação entre ingestão de glúten e distúrbios psiquiátricos, neurológicos e comportamentais é considerada um resultado da produção de péptidos bioativos, tais como exorfinas, possuindo atividade opióide.

As proteínas do glúten (gliadinas e prolaminas e gluteninas análogas) representam o fator ambiental principal que desencadeia doença celíaca e outros distúrbios relacionados. Estas proteínas contêm sequências de péptidos ricas em prolina e glutamina, tornando-as mais resistentes a enzimas digestivas do que outras proteínas na dieta e, deste modo, capazes de permanecer no lúmen intestinal. Em indivíduos geneticamente predispostos, estes péptidos são responsáveis por uma reação análoga que envolve o sistema imunitário inato e adaptativo e que, globalmente, leva a inflamação crónica da mucosa intestinal, aumento dos linfócitos intraepiteliais, hiperplasia da cripta, e uma deterioração progressiva dos villi intestinais incluindo o seu total desaparecimento. Os péptidos tóxicos produzidos após a ingestão de glúten podem passar através do epitélio intestinal e são reconhecidos pelas moléculas HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 de células apresentadoras de antigénio, de um modo preferido, após a sua desamidação através da ação de transglutaminase tecidular. Deste modo, estes são apresentados a recetores de células T, produzindo a sua ativação. Isto envolve a expressão do antigénio CD4, também conhecido como auxiliar (Th), e sua diferenciação em subpopulações de linfócitos, envolvendo deste modo imunidade adquirida. A subpopulação Th2 interage com células B que se diferenciam em células do plasma e produzem os anticorpos 2 ΕΡ2236598Β1 anti-gliadina, antiendomísio, e anti-transglutaminase tecidular. A subpopulação Thl é responsável por um aumento na secreção de citoquinas pró-inflamatórias (principalmente IFN-γ) e na proporção de IFN-y/IL-10 (Salvati et al 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac intestinal mucosa. Gut. 54: 46-53) . Os péptidos de glúten podem também desencadear uma resposta no epitélio intestinal mediada pela citoquina IL-15, envolvendo o sistema imunitário inato (Green e Jabri 2006. Celiac disease. Ann Rev Med. 57:207-21). As gliadinas ingeridas estimulam a produção de IL-15 em células epiteliais, que favorece a expansão clonal de linfócitos T CD8 citotóxicos intraepiteliais e a expressão de IFN-γ (Jabri et al. 2000. Selective expansion of intraepithelial lymphocytes expressing the HLAE-specific natural killer receptor CD94 in celiac disease. Gastroenterology. 118:867-79; Mention et al., 2003. Interleukin 15: a key to disrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and limphomagenesis in celiac disease. Gastroenterology. 125: 730-45; Forsberg et al. 2007. Concomitant increase of IL-10 and pro-inflammatory cytokine in intraepithelial limphocyte subsets in celiac disease. Int Immunol. 2007:19, 993-1001). A composição da microbiota intestinal de doentes com doença celíaca também apresenta um desequilíbrio em relação com a dos indivíduos de controlo saudáveis, caracterizado pela predominância de bactérias pró-inflamatórias e uma proporção reduzida e composição de bactérias do ácido láctico e bifidobactérias. (Sanz et al., 2007. Differences in faecal bacterial communities in coeliac and healthy children as detected by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3):562-8. Nadai et al., 2007. Imbalance in the composition of the duodenal microbiota of children with 3 ΕΡ2236598Β1 celiac disease. J Med Microbiol. 2007 Dec; 56 (Pt 12):1669-74; Collado et al. 2009. Specific duodenal and faecal bacterial groups are associated with paediatric celiac disease. J Clin Pathol. 62: 264-269). No lúmen intestinal e epitélio, a combinação de glúten com um aumento nas bactérias prejudiciais pode atuar como um fator desencadeador ou favorecer o processo patológico e as reações pro-inflamatórias em casos de doença celíaca ativa, assim como em outros distúrbios relacionados. Do mesmo modo, a presença ou ausência de certas espécies bacterianas podem favorecer ou proteger contra a toxicidade do glúten. A doença celíaca tem uma grande incidência e gravidade; no entanto, atualmente não existe terapia para estes doentes. A única alternativa é manter uma dieta estritamente isenta de glúten de longa duração. A conformidade com esta recomendação dietética é difícil e os doentes continuam a sofrer sintomas gastrointestinais, deficiências nutricionais, e riscos de saúde elevados (distúrbios imunitários, osteoporose, infertilidade, cancro, etc.) e o equilíbrio do seu ecossistema intestinal não é nunca totalmente restaurada. Adicionalmente, os indivíduos com doença celíaca refratária (5-10%) não respondem a esta recomendação dietética.

As opções terapêuticas ou coadjuvantes que estão normalmente sob investigação para tratar a doença celíaca incluem a administração oral de enzimas proteolíticas obtidas a partir de plantas ou microrganismos para acelerar digestão gastrointestinal de péptidos de glúten (Shan et al. 2005. Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue. 20050249719/A1; Marti et al. 2006. Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole glúten. 4 ΕΡ2236598Β1 20060286601/Α1; Stepniak y Koning. 2006. Enzymatic glúten detoxification: the proof of the pudding is in the eating! Trends Biotechnol. 24:433-4; Gass et al. 2007. Combination

enzyme therapy for gastric digestion of dietary glúten in patients with celiac sprue. Gastroenterology. 133:472-80). A eficácia desta estratégia foi demonstrada em sistemas modelo utilizando preparações de proteína e péptido ou seus equivalentes recombinantes, mas estudos que demonstram a sua eficácia in vivo são ainda necessários em indivíduos que ingerem glúten como na comida. Apesar dos benefícios potenciais desta terapia como um adjuvante numa dieta isenta de glúten, os seus efeitos serão altamente dependentes do tempo de ingestão da preparação de enzima e permitirão apenas a ingestão ocasional de glúten reduzindo o limiar de toxicidade. Outras alternativas propostas incluem o desenvolvimento de compostos inibidores da transglutaminase tecidular (Khosla et al., 2006. Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof W02007025247), anticorpos capazes de capturar os péptidos de gliadina (Fox, 2007. Antibody therapy for treatment of diseases associated with glúten intolerance. 20070184049/A1), compostos que bloqueiam os sítios de ligação de péptidos de glúten a moléculas HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 (Sollid et al. 2007. Drug therapy for celiac sprue. 20070161572/A1); Peakman e Chicz. 2007. Peptide epitopes recognized by disease promoting CD4+ T limphocytes. 20070142622/A1), antagonistas de citoquinas pró-inflamatórias tais como IFN-γ (Maroun et al., 2007. Interferon useful for the treatment of interferon related diseases. 20070160609/A1), a administração oral de citoquinas reguladoras recombinantes (Salvati et al., 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin dependent T cell activation in ex vivo cultured celiac intestinal mucosa. Gut. 2005; 54:46-53), 5 ΕΡ2236598Β1 inibidores de moléculas de adesão envolvidas nas reações inflamatórias, e antagonistas de zonulina responsáveis por aumentos na permeabilidade paracelular (Paterson e Ginski. 2007. Formulations for a tight junction effector US20070196501/A1). Estas estratégias ocasionam a modificação de moléculas envolvidas em vários processos biológicos e sua utilização pode levar a efeitos secundários não desejados. As estratégias da indústria alimentar estão a ser desenvolvidas para evitar a presença de epitopos tóxicos na comida gue se ingere através da manipulação genética de certas variedades de trigo e a utilização de enzimas proteoliticas e lactobacilos durante os processos de fermentação de cereais, gue podem degradar os epitopos tóxicos. Desta forma, o objetivo é introduzir melhorias na dieta de doentes celíacos e proporcionar-lhes uma vasta variedade de produtos mas sem prevenir ou tratar a própria doença (Rizzello et al. 2007. Highly efficient glúten degradation by lactobacilli and fungai proteases during food Processing: new perspectives for celiac disease. Appl Environ Microbiol.73:4499-507). A utilização de estirpes pertencentes ao género Bifidobacterium como probióticos ou preparações farmacêuticas para o tratamento e prevenção de doença celíaca e distúrbios relacionados e é a base da presente invenção. Os benefícios das bifidobactérias especificamente selecionadas para este fim são numerosos. As bifidobactérias possuem uma especial capacidade para colonizar o trato intestinal de recém-nascidos, contribuindo significativamente para o desenvolvimento das suas defesas (imunitárias e outras) e para a tolerância oral aos antigénios dietéticos. Este grupo de bactérias é um dos principais constituintes da microbiota 6 ΕΡ2236598Β1 intestinal nos primeiros anos de vida, particularmente em crianças alimentadas a peito.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Breve Descrição da Invenção 0 pedido revela um método for selecionar microrganismos ou estirpes microbianas capazes de modular a resposta imunitária. Estes microrganismos, de um modo preferido pertencentes ao género Bifidobacterium, são capazes de ser utilizados para o tratamento ou prevenção de doenças mediadas pelo imunitário tais como a doença celíaca, devido às suas capacidades imunomodulatórias. A invenção de acordo com as reivindicações proporciona uma nova estirpe do género Bifidobacterium (CECT 7347; daqui em diante "estirpe da invenção" (IATA-ES1) ou o sobrenadante de uma cultura dos microrganismos da invenção ou o extrato obtido a partir dos microrganismos da invenção na forma de preparações concebidas para reduzir os riscos e melhorar a saúde e qualidade de vida dos indivíduos com doença celíaca e outros distúrbios relacionados com a ingestão de glúten (alergia, autismo, ataxia, diabetes, esclerose múltipla, etc.). A estirpe da invenção foi isolada a partir de fezes de bebés alimentados a peito saudáveis e identificada por sequenciação do 16S rRNA e genes tuf. Esta estirpe tem propriedades imunomodulatórias capazes de regular as respostas pró-inflamatórias tipo Thl característica de doença celíaca e doenças relacionadas (esclerose múltipla, diabetes, 7 ΕΡ2236598Β1 ataxia, etc.), assim como as respostas imunitárias tipo Th2 caracteristicas de alergias a proteínas da dieta mediadas por IgE, que resultam da ingestão de trigo e outras proteínas de cereais. A estirpe da invenção é caracterizada por induzir uma baixa produção da citoquina IFN-γ Thl e da citoquina pró-inflamatórias IL-1, e por induzir uma elevada produção das citoquinas reguladoras IL10 e TGF-β em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). 0 perfil de citoquinas induzido por esta estirpe não é uma característica comum de todas as bifidobactérias e bactérias do ácido láctico do intestino humano e torna-a particularmente adequada para modular a resposta imunitária anómala trazida por proteínas do glúten em indivíduos predispostos. A sua combinação com outros microrganismos, tais como por exemplo B. longum ATCC15707, podem potenciar a síntese da citoquina reguladora IL-10 benéfica para o controlo do processo de inflamação característico destas patologias. As bactérias não viáveis (inativadas através e vários procedimentos, tais como calor, congelamento-descongelamento, radiação, etc.) mantêm as suas propriedades imunomodulatórias. A estirpe da invenção é capaz de incorporar e hidrolisar os péptidos do glúten responsáveis por estes distúrbios, reduzindo a concentração de epitopos tóxicos e seu potencial patogénico. A estirpe da invenção possui peptidases específicas para hidrolisar substratos contendo prolina, que são comuns às proteínas do glúten. As combinações desta com outras estirpes de bifidobactérias que possuem peptidases de diversas especificidades permitem que a sua ação seja complementada, favorecendo a degradação de epitopos tóxicos. A combinação de bifidobactérias com outros microrganismos tais como Lactococcus lactis NCD0712, que tem uma proteinase 8 ΕΡ2236598Β1 ancorada na parede celular, também potência os efeitos hidrolíticos devido exclusivamente à ação da bifidobactéria. A estirpe da invenção é capaz de modular a resposta imunitária provocada pelos péptidos do glúten através de: (i) indução da síntese de citoquinas reguladoras (IL-10), (ii) redução da produção de citoquinas pró-inflamatórias IFN-γ, IL-1, IL-8 e IL-15 derivadas da resposta imunitária inata e adaptativa (iii) inibição das vias pró-inflamatórias mediada pelo fator nuclear kB (Exemplo 3, Tabela 3). A estirpe da invenção, assim como os seus compostos derivados de acordo com as reivindicações é também capaz de inibir as bactérias patogénicas isoladas da microbiota intestinal de doentes de doença celíaca, com potencial pró-inflamatório e fatores de virulência que favorecem o restabelecimento do equilíbrio intestinal (Exemplo 4, Tabelas 4 e 5) . Estas estirpes são também capazes de inibir a resposta pró-inflamatória das bactérias intestinais de doentes com doença celíaca ativa e dos que tinham uma dieta isenta de glúten, reduzindo a síntese de citoquinas pró- inflamatórias (TNF-α e IFN-γ) e aumentando a das citoquinas reguladoras (IL-10). A estirpe da invenção também possui atividades metabólicas (por exemplo: fosfatase, esterase, lipase, galactosidase, glucosidase e N-acetil-glucosaminidase) que favorece a digestão de nutrientes e melhora a síndroma da malabsorção e malnutrição características de doentes celíacos A estirpe da invenção possui a capacidade para aderir a mucina (1-4%) e é estável sob condições de stresse 9 ΕΡ2236598Β1 gastrointestinal (pH ácido e elevada concentração de bilis; Exemplo 5, Tabela 6 e Tabela 7) e dos processos tecnológicos de armazenamento e preparação de alimentos (refrigeração, liofilização, fermentação, etc.). In vivo é capaz de sobreviver em trânsito em humanos após administração oral. Todas estas propriedades garantem a sua persistência prolongada e a eficácia no intestino e sua utilização como probióticos e simbióticos (combinações de pró e prebióticos). Estes também garantem a sua utilização na forma de alimentos funcionais, novos alimentos, suplementos, nutracêuticos e fármacos para redução dos riscos e melhoria da saúde e qualidade de vida dos indivíduos com doença celíaca assim como com outros distúrbios relacionados com a ingestão de glúten.

Deste modo, um primeiro aspeto da revelação refere-se a um método para selecionar microrganismos ou estirpes de microrganismos capazes de modular a resposta imunitária a alergias alimentares, que compreende: (a) isolamento de microrganismos a partir de amostras, de um modo preferido fezes, a partir de indivíduos saudáveis, de um modo preferido bebés alimentados a peito, e (b) seleção destes microrganismos do estádio anterior capazes de modular a resposta imunitária e hidrolisar, inativar ou interferir com o mecanismo de ação de pelo menos um agente que causa alergias alimentares, de um modo preferido, doença celíaca. De um modo preferido, os microrganismos selecionados no estádio (a) pertencem a um género ou espécie potencialmente probiótico. Numa forma de realização preferida, a resposta imunitária modulada pelo microrganismo obtida no estádio (a) são as respostas pró-inflamatórias do tipo Thl ou Th2. Também, os microrganismos obtidos no estádio (a) e (b), 10 ΕΡ2236598Β1 alternativamente ou em adição à sua capacidade de modulação da resposta imunitária, podem ser selecionadas pela sua capacidade para aumentar a viabilidade e/ou integridade de células epiteliais melhorando a função de barreira intestinal

Os microrganismos selecionados pelo método acima ou capazes de hidrolisar, inativar ou interferir com os mecanismos de ação de pelo menos um agente que causa alergias alimentares e que modula a resposta imunitária podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção de alergias alimentares (daqui em diante "microrganismos da invenção"). Deste modo, um aspeto da invenção refere-se aos microrganismos reivindicados para utilização como um medicamento ou composições alimentares, de um modo preferido, para o tratamento ou prevenção de alergias alimentares. A invenção refere-se a uma estirpe bacteriana com o número de depósito CECT 7347. A invenção refere-se ainda a uma composição (daqui em diante, a "composição da invenção") que compreende a estirpe da invenção, onde, além disso, está de um modo preferido presente nesta composição numa proporção entre 0,1 e 99,9%, de um modo preferido entre 1% e 99% e de um modo mais preferido entre 10% e 90%. Esta composição pode adicionalmente compreender outros microrganismos ou meios que potenciam, entre outros, a capacidade imunomoduladora do microrganismo ou estirpe da invenção ou a sua capacidade para hidrolisar, inativar ou interferir com os mecanismos de ação dos agentes que causam alergias alimentares. 11 ΕΡ2236598Β1 A invenção refere-se ainda a uma composição que pode ser obtida a partir dos compostos bioativos derivados dos microrganismos da invenção que são o sobrenadante de uma cultura de qualquer dos microrganismos da invenção (daqui em diante "sobrenadante da invenção") , ou os extratos obtidos a partir da cultura pura ou mista de qualquer dos microrganismos da invenção ou estirpe da invenção (daqui em diante, "extrato da invenção"), estes compostos bioativos derivados do microrganismo da invenção, daqui em diante "compostos bioativos derivados da invenção", podem ser utilizados para a preparação de alimentos, suplementos, nutracêuticos, produtos com base em probióticos ou simbióticos, novos alimentos ou medicamentos, e do mesmo modo as suas diferentes utilizações também fazem parte da invenção. Outro aspeto da revelação refere-se a um material de suporte para a preparação de produtos alimentares que compreende a composição da invenção ou pelo menos um microrganismo da invenção, de um modo preferido, a estirpe da invenção. Numa forma de realização preferida, o microrganismo da invenção está contido no material de suporte numa quantidade de pelo menos cerca de 105 cfu/g de material de suporte, de um modo preferido entre 106 cfu/g e 1012 cfu/g, de um modo mais preferido entre 106 cfu/g e IO10 cfu/g. De acordo com o exposto anteriormente, qualquer produto ou suplemento alimentar compreendendo a composição da invenção também forma parte da invenção. A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica ou composição alimentar que compreende qualquer dos seguintes compostos: a composição da invenção, o sobrenadante da invenção, o extrato da invenção, um microrganismo da invenção, a estirpe da invenção e, opcionalmente, meios e/ou 12 ΕΡ2236598Β1 excipientes farmacologicamente aceitáveis. A quantidade de microrganismos que a composição farmacêutica ou composição alimentar deve conter variará de acordo com o tipo de patologia é concebida para tratamento. De um modo preferido, a referida patologia é uma alergia alimentar e, de um modo mais preferido, doença celíaca. No caso da preparação de composições alimentares, e de acordo com a presente invenção, pelo menos um microrganismo da invenção ou composto bioativo derivado da invenção, é incorporado no material de suporte, de um modo preferido, numa quantidade de entre 105 cfu/g e 1014 cfu/g do material de suporte, de um modo mais preferido, entre cerca de 108 cfu/g e 1013 cfu/g, e mesmo de um modo mais preferido entre 107 cfu/g e 1012 cfu/g, no caso de um microrganismo da invenção, e no caso de um composto bioativo derivado da invenção numa proporção de entre 0,1 e 99,9%, de um modo preferido entre 1% e 99% e de um modo mais preferido entre 10% e 90%. Estas composições alimentares podem ser utilizadas para a preparação de nutracêuticos, alimentos funcionais, probióticos, simbióticos, suplementos nutricionais ou qualquer outros tipos de produto concebido para o tratamento ou prevenção, de um modo preferido, de alergias alimentares e, de um modo mais preferido, de doença celíaca. A composição farmacêutica ou composição alimentar da invenção podem ser encontradas, de um modo preferido, na forma de comprimidos, cápsulas, microcápsulas, pós, soluções, pastas, etc.

Outro aspeto da invenção refere-se à composição da invenção, ao sobrenadante da invenção, extrato da invenção, composição farmacêutica da invenção, ou à composição 13 ΕΡ2236598Β1 alimentar da invenção em que o microrganismo da invenção ou a estirpe da invenção é combinada com outro microrganismo, um sobrenadante obtido da sua cultura ou as suas frações subcelulares. De um modo preferido, o referido microrganismo pertence ao género Lactococcus, de um modo preferido à espécie Lactococcus lactis e, de um modo mais preferido, é a estirpe Lactococcus lactis NCD0712. A invenção também se refere às diferentes formas de apresentação da composição da invenção que podem ser formuladas como um alimento, nutracêutico, preparação farmacêutica, suplemento, probióticos ou simbióticos, ou novos alimentos.

Definições:

Bebés alimentados a peito: através da descrição este termo referir-se-á, de um modo preferido, a indivíduos saudáveis, de um modo preferido, com menos de dois anos de idade, de um modo mais preferido, menos de 1 ano de idade e, de um modo mais preferido, menos do que 6 meses de idade, que foram predominantemente alimentados a peito.

Indivíduos saudáveis: preferencialmente este termo refere-se a alguém que não sofre de qualquer tipo de patologia crónica ou aguda de acordo com os critérios dos médicos especialistas. Preferencialmente, a referida patologia provoca inflamação do epitélio intestinal, de um modo mais preferido, doença celíaca.

Alergias alimentares: ao longo da descrição este termo referir-se-á, preferencialmente, às alergias alimentares 14 ΕΡ2236598Β1 causadas, preferencialmente, por leite, ovos, leguminosas, nozes, crustáceos, peixe, moluscos, sésamo, sementes de girassol, sementes de algodão, sementes de papoila, feijões, ervilhas, lentilhas e, de um modo mais preferido, por glúten.

Resposta pró-inflamatória tipo Thl: a resposta a um estimulo que causa uma elevada produção de citoquinas tipo Thl, e de um modo preferido, da citoquina IFN-γ que é, de um modo preferido, pelo menos 100 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 15 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 10 vezes e de um modo ainda mais preferido pelo menos 4 vezes superior ao do controlo.

Resposta pró-inflamatória do tipo Th2: a resposta a um estimulo que causa uma elevada produção de citoquinas tipo Th2, e de um modo preferido da citoquina IL4 que é pelo menos 100 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 15 vezes, de um modo mais preferido, pelo menos 10 vezes e de um modo ainda mais preferido, pelo menos 4 vezes superior à do controlo. Género ou espécie potencialmente probiótico: De um modo preferido ao longo da descrição, este termo referir-se-á às espécies e estirpes das seguintes divisões filogenéticas e géneros procariotas: Archaea, Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Fusobacteria, Spirochaetes, Fibrobacters, Deferribacteres, Deinococcus,

Thermus, Cianobacteria, Methanobrevibacterium,

Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc. Peptostreptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Ruminococcus, Coprococcus, Subdolingranulum, Dorea, Bulleidia, Anaerofustis, Gemella, Roseburia, Catenibacterium, Dialister, 15 ΕΡ2236598Β1

Anaerotruncus, Staphylococcus, Micrococcus, Propionibacterium, Enterobacteriaceae, Faecalibacterium, Bacteroid.es,

Parabacteroides, Prevotella, Eubacterium, Akkermansia, Bacillus, Butyrivibrio, Clostridium, etc. Assim como as espécies e estirpes de fungos e leveduras Saccharomyces, Candida, Pichia, Debaryomyces, Torulopsis, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium, entre outras.

Meios: este termo refere-se, de um modo preferido, a meios de cultura, substratos, prebióticos, fibras, compostos bioativos, excipientes, ingredientes, etc. que melhoram quaisquer características dos microrganismos da invenção para utilização, de um modo preferido, na preparação de medicamentos, composições nutricionais, composições, materiais de suporte, sobrenadantes e alimentos da invenção (por exemplo, estabilidade, capacidades imunomoduladoras, capacidades de adesão, fermentação, hidrólise ou inativação de agentes que causam alergia, etc.).

Material de suporte: de um modo preferido, o material de suporte é uma composição alimentar selecionada a partir de leite, iogurte, queijo, leite fermentado, produtos alimentares com base em leite fermentado, cereais fermentados, farinhas, sumos, açúcar, bolos, gelados, formulações para crianças, etc.

Medicamento: através da descrição este termo referir-se-á a composições farmacêuticas ou formulações, de um modo preferido, concebidas para tratar ou prevenir alergias, alergias alimentares, doenças inflamatórias intestinais, infeções gastrointestinais e a translocação de microrganismos patogénicos ou suas toxinas, alteração do equilíbrio 16 ΕΡ2236598Β1 intestinal (disbiose), sobrecrescimento bacteriano, alteração da permeabilidade intestinal, intolerância a alimento, doença celíaca, síndroma de malabsorção, etc.

Composição alimentar: ao longo da descrição este termo referir-se-á a alimentos (funcionais, convencionais e novos), suplementos alimentares, fórmulas para fins nutricionais, e nutracêuticos concebidos, de um modo preferido, para tratar ou prevenir alergias, alergias alimentares, doenças inflamatórias intestinais, infeções gastrointestinais e a translocação de microrganismos patogénicos ou suas toxinas, alteração do equilíbrio intestinal (disbiose), sobrecrescimento bacteriano, alteração da permeabilidade intestinal, intolerância a alimentos, doença celíaca, síndroma de malabsorção, etc.

Composto bioativo derivado de um microrganismo: qualquer composto ou molécula que faz parte do microrganismo como uma parte estrutural, componente celular, fração subcelular, metabólito ou molécula secretada, obtenível por técnicas físico químicas ou biotecnológicas, incluindo entre outros centrifugação, filtração, liofilização, precipitação, sonicação, disrupção celular mecânica e química, extração do composto a partir de culturas utilizando enzimas e/ou agentes químicos, separação utilizando técnicas cromatográficas, clonagem e sobre-expressão dos genes que codificam as moléculas bioativas que são capazes de realizar uma função benéfica para a saúde. 17 ΕΡ2236598Β1

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Análise por SDS-PAGE dos perfis de proteína das diferentes digestões de gliadina. Painel A: 1) controlo de gliadinas após digestão com pepsina (G-P); 2) controlo de gliadinas após digestão com pepsina e tripsina (G-P-T); 3) G-P incubadas com a estirpe da

invenção; 4) G-P-T incubadas com a estirpe da invenção (Bifidobacterium IATA-ES1). Painel B: 1) G-P de controlo; 2) G-P-T de controlo; 3) G-P incubado com a estirpe da invenção e Lactococcus lactis NCD0712; 4) G-P-T incubadas com a estirpe da invenção e Lactococcus lactis NCD0712.

Figura 2. Cromato grama obtido da fração dialisável da digestão da gliadina in vitro. 0 pico 2 é aquele de um modo preferido hidrolisado pela estirpe da invenção.

Figura 3. Alteração da viabilidade celular (medida como atividade endolisossomal) provocada pela fração solúvel e digerida das gliadinas (Gld), na presença ou ausência de bifidobactérias in vitro. Albumina bovina - BSA -(controlo negativo); BifA2 (B. animalis); Bb (B. bifidum) e BL (Estirpe da invenção - Bifidobacterium longum IATA-ES1-) . Os resultados são expressos em valores médios e os desvios padrão são determinados em quadruplicado.

Figura 4. Produção de citoquinas pró-inflamatórias (TNF-a) e expressão do fator nuclear kB (NF-kB) em culturas de células Caco-2 expostas à fração solúvel e digerida das gliadinas (Gld), na presença ou ausência de

bifidobactérias in vitro. Albumina bovina - BSA 18 ΕΡ2236598Β1 (controlo negativo); BifA2 (B. animalis); Bb (B. bifidum) e BL (Estirpe da invenção - B. longum IATA-ES1-). Os resultados são expressos em valores médios e os desvios padrão são determinados em quadruplicado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente descrição refere-se a um método para selecionar microrganismos ou estirpes de microrganismos capazes de modular a resposta imunitária em alergias alimentares, que compreende: (a) isolar microrganismos de amostras de indivíduos saudáveis, de um modo preferido crianças alimentadas a peito, e (b) selecionar os microrganismos do passo anterior capazes de modular a resposta imunitária e hidrolisar, inativar ou interferir com o mecanismo de ação de pelo menos um agente que provoca alergias alimentares, de um modo preferido doença celíaca. De um modo preferido, os microrganismos selecionados no passo a) pertencem a géneros ou espécies potencialmente probióticos.

Outro aspeto da invenção refere-se a microrganismos capazes de hidrolisar, inativar ou interferir no mecanismo de ação de pelo menos um agente que provoca alergias alimentares e que modula a resposta imunitária. Estes microrganismos podem ser utilizados de um modo preferido para o tratamento ou prevenção de alergias alimentares, doenças inflamatórias intestinais, desequilíbrios no ecossistema intestinal (disbiose), sobrecrescimento bacteriano, síndroma de malabsorção, infeções gastrointestinais e translocação de microrganismos patogénicos ou suas toxinas, e alterações de permeabilidade intestinal. 19 ΕΡ2236598Β1 A invenção também proporciona microrganismos úteis para produzir formulações que reduzem os riscos e melhoram o estado de saúde de indivíduos que sofrem ou estão predispostos a sofrer de distúrbios relacionados com a ingestão de glúten através de vários mecanismos de ação, caracterizados por serem, microrganismos não modificados geneticamente, isolados e selecionados da microbiota intestinal de indivíduos saudáveis para as suas propriedades anti-inflamatórias e reguladoras.

Os seus mecanismos múltiplos de ação incluem por exemplo, e sem limitar o âmbito da invenção: (i) regular a resposta imunológica inata e adaptativa provocada pelos péptidos tóxicos e imunogénicos do glúten; (ii) reduzir a concentração dos epitopos tóxicos no lúmen do intestino através do transporte e da hidrólise dos péptidos do glúten; (iii) fortalecimento da função de barreira defensiva contra bactérias ou outros agentes pró-inflamatórios e com fatores de virulência isolados a partir do trato gastrointestinal de doentes celíacos, e (iv) proporcionar atividades enzimáticas, para além das peptidases, que favorecem a digestão e fornecem os nutrientes para aliviar a síndroma de malabsorção típica destes doentes. Este microrganismo pode produzir efeitos benéficos em adição a estes mencionados, a título de ilustração e sem limitar o âmbito da invenção, reduzir o stress oxidativo associado à inflamação, regular a permeabilidade intestinal, favorecendo a colonização de bactérias Gram-positivas benéficas com funções protetoras, regulando a função das células que apresentam antigénio, inibindo a interação de péptidos tóxicos com as células imunocompetentes e epiteliais do hospedeiro, interagindo com metaloproteases, regulando o ciclo celular e apoptose, 20 ΕΡ2236598Β1 regulando o crescimento celular e a diferenciação e regulando as funções neuroendócrinas. (De Stefano et al., 2007. Lycopene, guercetin and tyrosol prevent macrophage activation induced by gliadina and IFN-γ. Eur J Pharmacol. 2; 566 (1-3):192-9; Silano et al., 2007. A decapeptide from durum wheat prevents celiac peripheral blood lymphocytes from activation by gliadin peptides. Pediatr Res. 61(1):67-71; Gross et al. 2007. Role of neuropeptides in inflammatory bowel disease. Inflama Bowel Dis. 3(7):918-32).

Os microrganismos da invenção pertencem, de um modo preferido, ao género Blfldobacterium. Os microrganismos deste género oferecem vantagens nas formulações de alimentos, novos alimentos, probióticos, simbióticos, suplementos, nutracêuticos, e formulações farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de doença celíaca e distúrbios relacionados. As bifidobactérias possuem uma capacidade especial para colonizar o trato intestinal dos recém-nascidos, contribuindo significativamente para o desenvolvimento das suas defesas.

Os microrganismos da invenção pertencem à espécie B. longum. Como um exemplo, e sem limitar o âmbito da invenção, a estirpe da invenção pertencente a esta espécie foi isolada a partir das fezes de crianças alimentadas a peito saudáveis e identificadas por sequenciação do gene 16S rRNA (Exemplo 6) e o gene tuf. O fragmento sequenciado (1437 bases) foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 27f e 1401 r e os iniciadores de sequenciação 530f e U-968f também foram utilizados de acordo com os processos descritos por outros autores (Satokari et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-226). Através do alinhamento das sequências obtido com 21 ΕΡ2236598Β1 aquelas que existem nas bases de dados (GenBank), foi detetada uma semelhança máxima com as sequências equivalentes a 14 estirpes diferentes da espécie B. longum e entre elas B. longum BG3 (número de acesso AY735403.1). Parte do gene tuf (498 pb) foi amplificada e sequenciada utilizando os iniciadores descritos por Ventura et al. (Analysis, characterization, and loci of the tuf genes in Lactobacillus and Bifidobacterium species and their direct application for species Identification. Appl Environ Microbiol. 2003; 69 (11): 6908-22). Neste caso, também foi detetada uma semelhança máxima com a espécie B. longum e especificamente com a sequência que corresponde à estirpe B. longum ATCC 15707 (número de acesso AY372042.1) seguindo o mesmo procedimento.

Isto demonstra que B. longum apresenta propriedades ideais para regular o sistema imunitário da invenção de um modo semelhante a outras estirpes deste género selecionadas apropriadamente e espécies que o podem fazer, proporcionando os mesmos efeitos benéficos em indivíduos com distúrbios relacionados com a ingestão de glúten. A invenção refere-se a uma estirpe bacteriana que pertence à espécie B longum e gue foi depositada na Coleção Espanhola de Tipos de Culturas (Colección Espanola de Cultivos Tipo - CECT) , com sede em Bur jassot (Valência) , em 20 de Dezembro de 2007, correspondendo ao número de depósito CECT 7347. Esta estirpe pertence à espécie B. longum de acordo com a homologia da sequência do gene 16S rRNA com outros normalmente disponíveis nas bases de dados (GenBank), como descrito no exemplo 6; assim como com a homologia do gene tuf com o de outras estirpes desta espécies. Este último constitui um exemplo de uma estirpe do género Bifidobacterium 22 ΕΡ2236598Β1 que possui propriedades que permitem a sua utilização em formulações farmacêuticas ou medicamentos, alimentos (novos ou funcionais) ou suplementos nutricionais ou alimentares. A estirpe da invenção, pode ser combinada com outros microrganismos e compostos bioativos para melhorar as suas propriedades protetoras e metabólicas através de ações sinérgicas ou complementares, tais como o aumento na síntese total de citoquinas reguladoras e seus tipos, o aumento na capacidade inibidora contra bactérias patogénicas e da função de barreira intestinal, e o aumento na contribuição de peptidases e outras enzimas que favorecem a digestão aumentando a sus concentração total ou aumentando o seu tipo e especificidade.

Deste modo, outro aspeto da invenção compreende a combinação de bifidobactérias com outros microrganismos ou compostos bioativos, de um modo complementar e/ou sinérgico, favorecendo as respostas imunorreguladoras e a degradação dos péptidos tóxicos e imunogénicos do glúten. Como um exemplo de microrganismos, a estirpe B. longum ATCC 15707 pode reforçar o efeito imunomodulador da estirpe da invenção devido à sua elevada capacidade para induzir a síntese de IL-10 como demonstrado na tabela 1 (Exemplo 1); esta ação também pode complementar a indução de TGF-β produzida apenas pela segunda estirpe (Tabela 1, Exemplo 1) . Ao mesmo tempo, a estirpe Lactoccocus lactis NCD0712 pode complementar e intensificar a degradação de péptidos do glúten devido às bifidobactérias e dessa forma reduzir a concentração de epitopos tóxicos do glúten e a sai lesão intestinal e extraintestinal devido ao facto de possuir, para além de peptidases intracelulares, atividade proteolítica extracelular. A intensificação da 23 ΕΡ2236598Β1 atividade proteolítica é demonstrada no exemplo 2 e na figura 1, em que é possível apreciar uma desaparecimento quase total das bandas de proteína após a incubação das amostras digeridas de gliadina com suspensões celulares da estirpe da invenção e Lactoccocus lactis NCD0712 (Figura 1, painel B, pistas 3 e 4). Esta hidrólise foi superior àquela obtida utilizando apenas a estirpe da invenção (Figura 1, painel A, pistas 3 e 4).

Outro aspeto da divulgação refere-se à utilização da estirpe da invenção, assim como os seus equivalentes não viáveis inativados por diferentes processos (congelamento, aquecimento, radiação, etc.) para objetivos imunomoduladores.

Os microrganismos não viáveis da invenção inativados por diferentes processos (congelamento, aquecimento, radiação, etc.) continuam a ser úteis para objetivos terapêuticos ou preventivos e também formam parte da presente invenção. Os efeitos imunomoduladores das bifidobactérias são produzidos, pelo menos em parte, por constituintes estruturais (DNA, componentes da parede celular, etc.). Isto torna possível que as bifidobactérias mantenham parte das suas propriedades imunomodulatórias sem manter necessariamente a viabilidade (Lammers et al., 2003. Immunomodulatory effects of probiotic bactéria DNA: IL-1 e IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 38: 165-72). Deste modo, o exemplo 3 e a tabela 3, demonstram que as suspensões celulares da estirpe da invenção, inativadas por ciclos de congelamento e descongelamento, podem modular a resposta pró-inflamatória desencadeada pelas gliadinas quando co-incubadas com células mononucleares do sangue periférico, reduzindo desse modo a síntese das citoquinas pró- 24 ΕΡ2236598Β1 inflamatórias (por exemplo IFN-γ) e aumentando a síntese de citoquinas reguladoras (por exemplo IL-10).

Também, os compostos bioativos derivados do microrganismo da invenção tais como compostos estruturais, aqueles que resultam do metabolismo, as moléculas segregadas por qualquer um dos microrganismos ou estirpes da invenção, obtidas através de técnicas bem conhecidas, formam parte da presente invenção e podem também ser utilizadas para modular as respostas imunitárias. Por exemplo, técnicas físico-químicas e biotecnológicas, incluindo entre outras centrifugação, filtração, liofilização, precipitação, sonicação, disrupção celular mecânica e química, extração de compostos baseados em culturas com enzimas e/ou agentes químicos, separação através de técnicas cromatográficas, clonagem de genes que codificam os referidos compostos e a sua sobre-expressão. 0 Exemplo 1 e a tabela 1 demonstram que os componentes estruturais que formam parte do envelope celular das bifidobactérias são responsáveis pelo menos em parte pela indução e produção de citoquinas reguladoras (IL-10 e TGF-β). No exemplo 3 e na tabela 3 em que as amostras de gliadina digeridas foram co-incubadas com suspensões celulares inviáveis da estirpe da invenção é também demonstrado que as componentes estruturais destas células são capazes de reduzir as respostas pró-inflamatórias realizadas pelas gliadinas e de aumentar a síntese de citoquinas reguladoras (IL-10). De igual modo, componentes estruturais, metabolitos e substâncias segregadas pela estirpe da invenção exerceram um efeito inibidor sobre o crescimento de bactérias potencialmente patogénicas isoladas de doentes com doença 25 ΕΡ2236598Β1 celíaca, como demonstrado no exemplo 4 e na tabela 4. No referido exemplo, o efeito inibidor das culturas de células desta estirpe foi avaliada utilizando a técnica da camada dupla em que ambas as células assim como os metabolitos e produtos segregados são colocados em contacto com o microrganismo patogénico, de modo que os efeitos inibidores podem ser devidos à ação sinergística de todos esses componentes. 0 efeito inibidor dos metabolitos e compostos segregados pelas bifidobactérias para o meio de cultura também foi avaliado utilizando como um agente inibidor os sobrenadantes de culturas sem células, previamente liofilizados. Deste modo, foi demonstrado que os compostos libertados para o meio de cultura proporcionam um efeito inibidor contra os potenciais patogénicos isolados a partir de doentes com doença celíaca (Tabela 5).

Numa forma de realização particular da presente invenção os microrganismos da invenção, a composição da invenção, o sobrenadante da invenção, o extrato da invenção, a composição da invenção farmacêutica ou nutricional, a estirpe da invenção, são caracterizados por serem capazes de regular ou modular a resposta imunitária inata e adaptativa provocada pelos péptidos danificadores do glúten ou outras alergias alimentares. A estirpe da invenção foi selecionada para as suas propriedades imunomodulatórias capazes de regular as respostas pró-inflamatórias de tipo Thl características de doença celíaca e doenças relacionadas (síndroma de Down, diabetes mellitus de tipo 1, dermatite herpetiforme, miopatia, esclerose múltipla, artrite, autismo, esquizofrenia, depressão, linfomas e ataxia), assim como as reações 26 ΕΡ2236598Β1 alérgicas de tipo Th2 que podem ser provocadas como um resultado da ingestão de trigo e outras proteínas de cereais. As estirpes são caracterizadas pela sua capacidade para induzir uma baixa produção da citoquina Thl IFN- γ (por exemplo <100 pm/mL) e da citoquina pró-inflamatória IL-1 (por exemplo <150 pm/mL) e induzir uma produção elevada das citoquinas reguladoras IL10 (por exemplo > 800 pm/mL) e TGF-β (por exemplo >50 pmol/mL) pelas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs; Exemplo 1, Tabela 1). O perfil de citoquinas induzidas por estas bifidobactérias não é uma característica comum a todas as bifidobactérias e bactérias intestinais humanas do ácido láctico (Exemplo 1, Tabela 1) e torna-o especialmente ideal para modular a resposta imunitária anómala que as proteínas do trigo produzem em indivíduos predispostos e em doentes com uma doença celíaca ativa. A deteção destes efeitos imunomoduladores quando se utilizam suspensões celulares da estirpe selecionada como estímulo nestes testes (Exemplo 1 e Tabela 1) indica que os componentes estruturais que formam parte do envelope celular desta bifidobactéria são responsáveis, pelo menos em parte, da indução da produção da citoquina reguladora (IL-10 e TGF-β) que podem reduzir os efeitos tóxicos e imunogénicos dos péptidos do glúten. Também, no exemplo 3 e na Tabela 3 é demonstrado que a utilização de suspensões celulares inviáveis da estirpe da invenção (inativadas por ciclos de congelamento-descongelamento) co-incubadas com amostras de gliadina digerida é capaz de reduzir a síntese de citoquinas pró-inflamatórias (por exemplo INF-γ e IL-15) provocadas pelas gliadinas e aumentando a síntese de citoquinas reguladoras (por exemplo INF IL-10). Por isso, é demonstrado que os componentes estruturais das células da bifidobactéria podem regular as respostas imunológicas anómalas provocadas 27 ΕΡ2236598Β1 pelo glúten, sem que seja estritamente necessária para manter a viabilidade da bactéria. A estirpe da invenção, e o composto bioativo derivado da invenção, são caracterizados por serem capazes de fortalecer a função de barreira defensiva contra bactérias prejudiciais, por exemplo bactérias pró-inflamatórias e bactérias com fatores de virulência, isoladas a partir do trato gastrointestinal de doentes de doença celíaca.

Os microrganismos da invenção são capazes de inibir bactérias com potencial patogénico e tóxico, isoladas a partir do intestino de doentes de doença celíaca (Exemplo 4, Tabelas 4 e 5) . Estes agentes patogénicos incluem, entre outras, estirpes das espécies Escherichia coli que codificam fatores de patogenicidade (por exemplo fímbria) e pertencem a grupos filogenéticos virulentos (por exemplo, B2) , estirpes do género Bacteroides e de outros géneros que produzem metaloproteases que contribuem para a lesão de tecidos, e estirpes hemolíticas isoladas a partir de biópsias do duodeno No exemplo 4 e na Tabela 4 o efeito inibidor de culturas celulares totais desta estirpe é demonstrado contra os agentes patogénicos isolados de doentes de doença celíaca, utilizando a técnica de camada dupla, de modo a que estes efeitos podem ser devidos a componentes estruturais, metabolitos e substâncias segregadas pela estirpe da invenção A Tabela 5 também apresenta o efeito inibidor dos sobrenadantes sem células das culturas desta estirpe que apenas contêm os metabolitos e os compostos segregados pela bifidobactéria para este meio. Em ambos os casos, os efeitos de inibição obtidos utilizando a estirpe selecionada são superiores àqueles obtidos utilizando outras estirpes 28 ΕΡ2236598Β1 ensaiadas para objetivos comparativos. Deste modo, os microrganismos ou a estirpe da invenção podem contribuir para restaurar o ecossistema intestinal e reduzindo a carga antigénica de origem microbiana gue iria favorecer o processo inflamatório e o aumento da permeabilidade do epitélio. De igual modo, a estirpe selecionada é capaz de inibir a síntese de citoguinas pró-inflamatórias (por exemplo IFN-γ e TNF-a) estimulada pela microbiota intestinal de doentes de doença celíaca em células mononucleares do sangue periférico. Por exemplo, concentrações de IFN-γ de 90,8 e de TNF-α ed 1966,3 pmol/mL produzidas por PBMCs sob a estimulação com a microbiota de doentes de doença celíaca podem ser reduzidas para valores de 8,2 pmol/mL e 295,2, respetivamente, na presença da estirpe da invenção (Exemplo 7) . Esta estirpe é também capaz de estimular a síntese de citoquinas reguladoras (IL-10), reduzida ao mesmo tempo pela microbiota intestinal de doentes de doença celíaca. Deste modo, por exemplo os valores de IL-10 de 49,3 pmol/mL induzidos pela microbiota de doentes de doença celíaca podem ser aumentados até valores de 107,5 pmol/mL através de estimulação da estirpe de Bifidobacterium IATA-H1. Através deste mecanismo imunomodulador a estirpe selecionada pode contribuir para restaurar o equilíbrio intestinal e evitar a sobre-estimulação do sistema imunitário provocado pela microbiota prejudicial que, juntamente com aquela provocada pelo glúten, podem criar um círculo vicioso que perpetua a inflamação.

Também, os microrganismos da invenção são caracterizados pela sua capacidade para transportar os péptidos do glúten que resultam da digestão gastrointestinal, reduzindo desse modo a concentração de epitopos lesivos. 29 ΕΡ2236598Β1

Especificamente, a estirpe da invenção possui a capacidade para recuperar péptidos tóxicos derivados da digestão gastrointestinal de gliadinas, a partir de produtos que resultam da digestão gástrica através da ação da pepsina (P) , assim como a partir da digestão intestinal por meio da ação da tripsina (T) e da pancreatina (X) (Exemplo 2, Figura 1). A incubação de gliadinas na presença de bactérias viáveis das estirpes selecionadas reduz a sua concentração e a presença de epitopos tóxicos determinados utilizando o anticorpo R5 por ELISA de sanduíche e deste modo os seus possíveis efeitos lesivos no intestino e ao nível extraintestinal. Por exemplo, a concentração de epitopos tóxicos de uma amostra de gliadina digerida com pepsina, tripsina e pancreatina (como indicado no Exemplo 2) de 2349 ppm de glúten determinados por ELISA de sanduíche foi reduzida para 169 ppm de glúten após incubação com suspensões celulares da estirpe da invenção. De igual modo, a incubação da estirpe da invenção com gliadina digerida nas condições gastrointestinais e dialisada, com uma membrana de tamanho de exclusão inferior a 15 kDa, e sua análise subsequente por HPLC na fase inversa tornou evidente a capacidade desta bifidobactéria para reduzir pelo menos em 10% a concentração da fração #2, que foi a principal fração de gliadinas digeridas e aquela que contêm péptidos imunogénicos identificados por espectrometria de massa, uma propriedade que o resto das estirpes testadas não apresenta (Exemplo 8, Figura 2) . Os efeitos biológicos no epitélio intestinal desta propriedade da estirpe de B. longum IATA-ES1 foram demonstrados após incubação das amostras digeridas de gliadina diferentes em culturas de células Caco-2, como descrito no Exemplo 8. Este exemplo demonstra que a estirpe da invenção pode desse modo aumentar a viabilidade das 30 ΕΡ2236598Β1 células epiteliais, ao contrário do resto das estirpes testadas (Exemplo 8, Figura 3) . Adicionalmente, a co-incubação da estirpe da invenção com a amostra digerida de gliadina diminuiu o efeito desta última na síntese de citoquinas pró-inflamatórias tais como TNF-alfa e a expressão dos fatores responsáveis NkB para a expressão de genes pró-inflamatórios (Exemplo 8, Figura 4). A capacidade da estirpe da invenção para capturar os oligopéptidos derivados da digestão de gliadina é reproduzida nas condições intestinais e na presença de sais de bílis. Esta capacidade é potenciada por meio de co-incubação com Lactococcus lactis NCD0712 que, apesar de não conseguir colonizar o intestino grosso, pode atuar como um coadjuvante nos primeiros estádios da hidrólise de glúten ingerido por meio da ação da sua protease ancorada à parede e outras peptidases (Exemplo 2, figura 1). A intensificação da atividade proteolítica por meio da ação de Lactoccocus lactis NCD0712 é demonstrada na figura 1 em que um desaparecimento quase total das bandas de proteína podem ser apreciadas após a incubação das amostras digeridas de gliadina com suspensões celulares da estirpe da invenção e Lactoccocus lactis NCD0712 (Figura 1, painel B, pistas 3 e 4) . Esta hidrólise foi superior àquela obtida utilizando apenas a estirpe da invenção (Figura 1, painel A, pistas 3 e 4) . A atividade da bifidobactéria no glúten também pode ser potenciada através da sua co-incubação com proteases e peptidases de Lactococcus lactis NCD0712 na forma de extratos. A estirpe da invenção pode modular a resposta imunológica anormal provocada pela interação dos péptidos tóxicos do glúten com as células imunocompetentes do 31 ΕΡ2236598Β1 indivíduo não apenas através da metabolização dos péptidos que atuam como antigénios danificadores, mas também através de mecanismos imunorreguladores (Exemplo 3, Tabela 3) . As suspensões de bactérias viáveis ou inativadas das estirpes selecionadas co-incubadas com PBMCs na presença de amostras digeridas de gliadina gastrointestinais são capazes de contrariar o efeito pró-inflamatório destas proteínas em diferentes fases da digestão, por ação da pepsina gástrica (P) e da tripsina intestinal (T) e pancreatina (X) . Esta estirpe é capaz de induzir uma redução na produção das citoquinas pró-inflamatórias IFN-γ, IL-1, IL-8 e IL15 responsáveis pela resposta imunitária adaptativa e inata, assim como aumentar a síntese da citoquina reguladora IL-10 (Exemplo 3, Tabela 3) . Estes efeitos são devidos, pelo menos em parte, à inibição das diferentes subunidades do fator nuclear (NF) kB, p50, p65 (RelA), c-Rel e Rei B determinado por um ensaio de ELISA (Trans AM NFkB, Active Motive, Bélgica) . A inibição deste fator de transcrição implica a inibição da expressão de um grande número de genes pró-inflamatórios que representam um ponto de controlo chave de processos inflamatórios e especificamente os que ocorrem na doença celíaca (Jelínková et al., 2004. Gliadin stimulates human monocytes to production IL-8 and TNF-alpha through a mechanism involving NF- kB. FEBS Lett. 571(1-3):81-5).

Os microrganismos da invenção e os compostos bioativos derivados da invenção, são caracterizados por serem capazes de hidrolisar péptidos do glúten através da sua atividade de peptidase, reduzindo a concentração de epitopos prejudiciais. Como um exemplo, a estirpe da invenção possui peptidases com especificidade larga e com especificidade para substratos que contêm prolina, que são muito abundantes em gliadinas e 32 ΕΡ2236598Β1 limitam a sua hidrólise através de enzimas convencionais (Exemplo 2, Tabela 2) . Especificamente, esta estirpe é uma daquelas com a atividade de iminopeptidase mais elevada (>300 U/mg proteína); de igual modo, apresenta atividade de prolil-endopeptidase (>8 U/mg proteína), X-prolil-dipeptidil-peptidase (>15 U/mg proteína), prolidase e atividade de prolinase (> 15 U/mg proteína) . Também possui atividade de tripeptidase (>130 U/mg proteína contra o substrato Gleu-Gly-Gly) e atividade de leucil-aminopeptidase (>70 U/mg proteína) A atividade desta estirpe contra substratos que contêm prolina, tais como Pro-pNA, é superior àquela detetada noutras bactérias láticas e especialmente a proporção de atividade Pro-pNA/Leu-pNA (Di Cagno et al. 2004. Sourdough bread made from wheat and non-toxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl Environ Microbiol. 70:1088-96; De Angelis et al. 2006. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochim Biophys Acta. 2006 1762(1):80-93), que favorece a hidrólise específica de péptidos do glúten com um elevado teor de prolina.

Deste modo, a estirpe da invenção e os compostos bioativos derivados da invenção possuem atividade metabólica adicional àquela das peptidases (por exemplo: fosfatase, esterase, lipase, galactosidase, glucosidase e N-acetilglucosaminidase) que auxiliam na digestão de nutrientes que são ingeridos com a dieta, e melhoram a síndrome de malabsorção e desnutrição características de doentes de doença celíaca. 33 ΕΡ2236598Β1

Finalmente, outra forma de realização particular é a utilização do microrganismo da presente invenção e os compostos bioativos derivados da invenção em combinação com outros microrganismos, na produção de formulações para reduzir os riscos e melhorar o estado de saúde dos doentes com doenças relacionadas com a ingestão de glúten, ou outras alergias alimentares.

As formulações preparadas utilizando a estirpe da invenção podem ser desenvolvidas industrialmente dando origem a, entre outros e sem limitar o âmbito da invenção, formas diferentes de apresentação ao consumidor: alimentos (funcionais, convencionais e novos), suplementos, nutracêuticos, composições farmacêuticas, probióticos e/ou simbióticos, ou novos alimentos. A estirpe da invenção possui a capacidade para aderir à mucina (1-4%) e é resistente ao pH ácido do estômago (2,0; 2,5 e 3,0) e a concentrações elevadas de sais de bílis (0,5; 1,0; 2,0; e 3,0%) presentes no intestino delgado, que constituem as principais barreiras biológicas que limitam a sobrevivência de probióticos quando passam através do trato intestinal assim como durante os processos de fermentação alimentar e o seu período de armazenamento (Exemplo 5, Tabela 6) . Por exemplo, esta estirpe mantém uma viabilidade e capacidade de crescimento de 56-86% após 90 min de incubação a pH 2,0-2,5. Por isso, esta estirpe possui probabilidades mais elevadas de sobrevivência e de ser funcional do que outras isoladas e do que alguns probióticos normalmente comercializados, como pode ser observado a partir da Tabela 6 Esta estirpe também resiste ao trânsito gastrointestinal in vivo. Após a sua administração na forma de leite fermentado 34 ΕΡ2236598Β1 durante 4 semanas a doses de 107-108 cfu/mL duas vezes por dia é recuperada nas fezes e a sua concentração em relação à concentração inicial (sem ingestão de produtos probióticos) aumenta em pelo menos 1 unidade logarítmica. As bifidobactérias selecionadas crescem e permanecem viáveis em vários alimentos e bebidas, constituindo veículos ideais para a sua incorporação. Por exemplo, estes são capazes de fermentar e coagular leite, estes podem ser utilizados para a preparação de leites fermentados e outros derivados de leite. Estes também resistem a tratamentos tecnológicos para a produção e conservação de alimentos, suplementos e formulações farmacêuticas, tais como por exemplo temperaturas de liofilização e refrigeração, garantindo a sua exploração industrial.

Um aspeto particular da presente invenção compreende a utilização da estirpe da invenção ou compostos bioativos derivados da invenção na preparação de formulações na forma de alimentos.

Desta forma, os microrganismos da invenção podem fazer parte de um alimento formulado para proporcionar, para lá do seu normal valor nutricional, um feito benéfico na redução dos riscos e melhoria do estado de saúde de doentes com doenças relacionadas com a ingestão de glúten.

Outro aspeto particular da presente invenção compreende a utilização da estirpe da invenção, ou dos compostos da invenção bioativos derivados na produção de preparações na forma de nutracêuticos, definidos como substâncias bioativas naturais apresentadas numa matriz não alimentar, que neste caso deve produzir efeitos benéficos em doentes com doenças 35 ΕΡ2236598Β1 relacionadas com ingestão de glúten, reduzindo os seus riscos e melhorando o seu estado de saúde.

No caso da utilização dos microrganismos, a estirpe da invenção ou compostos da invenção bioativos derivados para obter um suplemento dietético ou alimentar, deve incluir na sua composição o microrganismo ou seus compostos bioativos derivados com vista a complementar a dieta para fins de saúde e, neste caso especifico, com o objetivo de produzir efeitos benéficos em doentes com doenças relacionadas com a ingestão de glúten, reduzindo os seus riscos e melhorando a sua saúde.

Outro aspeto particular da presente invenção compreende a utilização dos microrganismos da invenção, a estirpe da invenção ou compostos bioativos da invenção na produção de preparações farmacêuticas. Desta forma, serão utilizados na preparação de composições biologicamente cativas, capazes de serem utilizadas como medicamentos produzindo um efeito benéfico na redução dos riscos e melhoria do estado de saúde de doentes com doenças relacionadas com a ingestão de glúten.

Noutra forma de realização particular da invenção, a estirpe da invenção ou compostos bioativos da invenção devem ser utilizados na produção de probióticos e/ou simbióticos (combinações de probióticos e prebióticos), em que os microrganismos são incorporados, por exemplo vivos ou liofilizados, em quantidades adequadas e em condições que permitem que realizem o seu efeito benéfico ou terapêutico em indivíduos com alergias a alimentos, de um modo preferido aqueles relacionados com a ingestão de glúten, reduzindo desse modo os seus riscos e melhorando o seu estado de saúde. 36 ΕΡ2236598Β1

Um objetivo particular final da presente invenção compreende a utilização da estirpe da invenção ou compostos bioativos da invenção na preparação de novos alimentos. É entendido que novos alimentos significam qualquer alimento ou ingrediente que não foi utilizado normalmente no passado para consumo humano na União Europeia até 15 de Maio de 1997, que iria produzir efeitos benéficos em doentes que sofrem de doenças relacionadas com a ingestão de glúten, reduzindo os seus riscos e melhorando o seu estado de saúde.

EXEMPLOS DE FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO EXEMPLO 1. PROCESSO PARA SELECIONAR ESTIRPES DO GÉNERO BIFIDOBACTERIUM DE ACORDO COM A SUA CAPACIDADE PARA MODULAR A PRODUÇÃO DE CITOQUINA EM CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO (PBMCs) 1. Preparação das culturas e sobrenadantes de blfidobactérlas e outras bactérias láticas intestinais.

As estirpes foram inoculadas em 10 ml de meio de cultura MRS (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Espanha) contendo 0,05% de cisteína (MRS-C) a 1% com uma cultura de 24 h e foram incubadas durante 22 h a 37 °C em anaerobiose. (AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). As células foram recolhidas por centrifugação (6 000 g, 15 min) , lavadas duas vezes em PBS (fosfato de sódio a 10 mM, cloreto de sódio a 130 mM, pH 7,4), e foram ressuspensas em PBS contendo 20% de glicerol. Foram congeladas frações destas suspensões utilizando azoto líquido e conservadas a -80°. O número de células viáveis após o ciclo de congelamento-descongelamento foi determinado através de contagem em placas de MRSC após incubação de 48 h. 37 ΕΡ2236598Β1 A viabilidade foi superior a 90% em todos os casos. Cada fração foi utilizada durante um único teste. Com o objetivo de avaliar os efeitos das bactérias mortas, algumas das frações foram inativadas pelo frio (3 ciclos de congelamento a -20°C e descongelamento) e inativadas pelo calor (30 min. a 80°C) . Os valores de pH dos sobrenadantes obtidos foram ajustados para 7,2 utilizando NaOH e foram esterilizados por filtração (tamanho de poro 0,22 mm, Millipore, Bedford, MA) para eliminar a presença possível de células viáveis. As frações dos sobrenadantes sem células foram conservadas a -80°C até utilização posterior.

2. Isolamento e estimulação de PBMC

As PBMC foram isoladas a partir do sangue periférico de 4 voluntários saudáveis (idade média de 30 anos, intervalo de 24-40) em tubos com heparina. As PBMC foram isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As células foram lavadas com meio RPMI 1640 (Cambrex, Nova Iorque, EUA) e ajustadas para uma densidade de 1 x 106 células/ml em meio RPMI 1640 contendo adicionalmente 10% de soro de bovino fetal (Gibco, Barcelona, Espanha), 2 mM de L-glutamina, 100 pg/ml de estreptomicina e 100 U/ml de penicilina (Sigma). As PBMC foram incubadas em placas de poliestireno de 24 poços com fundo plano (Corning, Madrid, Espanha) na presença ou ausência de agentes estimulantes a 37°C, a 5% de C02, durante 24 h. As suspensões de bactérias vivas e mortas foram utilizadas como um estímulo a 1 x 106 CFU/ml, e volumes de sobrenadante de 150 μ/l. Como um controlo positivo foram utilizados lipopolissacáridos purificados (LPS) de E. coli 0111:B4 (Sigma, St. Louis, MO) a uma concentração de 1 pg/ml. Como um controlo negativo, foi 38 ΕΡ2236598Β1 testada a produção de citoquinas em PBMC não estimuladas. Cada tipo de estimulo foi testado em duplicado em cada experiência. Os sobrenadantes das culturas foram recolhidos por centrifugação, fracionados e armazenados em frações a -20°C até à deteção de citoquina. 3. Determinação de citoquina

As concentrações de citoquinas (IL-1, IFN-γ, IL-10, e TGF-β) dos sobrenadantes foram medidas utilizando ELISA Bioscience kits (BD Biosciences, San Diego, CA) seguindo as instruções do fabricante.

Tabela 1. Propriedades Imunomoduladoras das bifidobactérias e de outras bactérias láticas intestinais. Efeito na produção de citoquinas pelas PBMC de bactérias viáveis.

Estimulo Produção de citoquina (pm/mL) IL-1 IFN-γ IL-10 TGF-β RPMI ND 9,0±1,0 58,0±3,0 ND LPS ND 12,0±0,5 399,0±8,0 ND ^Sl 103,0±37,0 10,1±1,0 2459,0±28,0 236,0±119,0 2A2 255,0±1,0 13,0±2,0 699,0±396,0 ND 3ATCC15707 - 66,1±23,9 4098,4±1551,7 - 4BIR-324 ND 11,0±5,0 469,0±15,0 ND 5W11 - 160,4±6,8 486,0±236,4 - 6BB536 - 143,7±18,3 1390,0±268,8 - 7lmiv 233,0±99,0 27,0±15,0 166,0±53,5 ND ND, não detetado não avaliado 1Estirpe da invenção (IATA-ES1), 2Bifidobacterium IATA-A2, 3Bifidobacterum longum ATCC15707, 4Bifidobacterium BIR-324, sBifidobacterum longum Wll, 6Bífídobacterum longum BB536, ?Lactobacíllus reuteri LM1V. 39 ΕΡ2236598Β1

EXEMPLO 2. PROCESSO PARA SELECIONAR BIFIDOBACTÉRIAS CAPAZES DE HIDROLISAR E TRANSPORTAR PÉPTIDOS DE GLÚTEN REDUZINDO DESSE MODO A SUA TOXICIDADE A capacidade das estirpes para hidrolisar as proteínas e péptidos derivados de glúten foi medida através da quantificação da atividade de largo espetro e peptidases intracelulares específicas para hidrolisar sequências de péptidos que contêm prolina, presentes nos péptidos responsáveis para as respostas imunológicas e tóxicas de glúten. As células de culturas bacterianas de 16-18 horas cultivadas em MRSC foram recolhidas por centrifugação (9000 x g durante 10 minutos a 4°C) lavadas duas vezes em tampão Tris a 50 mM a pH 7 e ressuspensas no mesmo tampão concentrado 10 vezes em relação ao volume da cultura inicial. As células foram rebentadas mecanicamente utilizando um Bead-Beater (Biospec Products, EUA) adicionando 2 volumes de esferas de vidro para cada volume de células e aplicando 2 pulsos de 1,5 minutos. O sobrenadante obtido após centrifugação (8000 g, 10 min) para eliminar fragmentos insolúveis e células foi utilizado como um extrato enzimático para os testes de atividade. Os substratos testados foram como se segue: Leu-paranitroanilida (-pNA) para detetar aminopeptidases de especificidade larga, Leu-Leu-Gly para detetar aminopeptidases e tripeptidases de especificidade larga, Suc-Ala-Pro-pNA para detetar prolil-endopeptidases, Pro-AMC para detetar iminopeptidases, Gly-Pro-AMC para detetar X-prolil-dipeptidilpeptidases; Val-Pro para detetar prolidases, e Pro-Gly para detetar prolinases. No caso de substratos derivados de paranitroanilida, a mistura de reação consistiu em 200 μΐ de tampão fosfato a 50 mM, a pH 7,2, contendo 0,5 mM de substrato e 50 μΐ de extrato enzimático. A mistura de reação 40 ΕΡ2236598Β1 foi incubada a 37°C durante um máximo de 30 min. A hidrólise do substrato e a libertação de paranitroanilina foi monitorizada a 419 nm num espectrofotómetro (550 Microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A hidrólise dos péptidos foi determinada através do ensaio de oxidase de L-aminoácido (Hejgaard, 1978, Rapad assay to detect peptidases in column effluent fractions using L-amino acid oxidase. Analytical Biochem 90: 835-839). Foram incubados 100 μΐ do tampão de reação que contém uma concentração de 0,05 mM com 50 μΐ de extrato enzimático durante 20 min. Após este período foram adicionados 100 μΐ do reagente de oxidase de L-aminoácido e, após 5 minutos de incubação, a absorvência foi medida a 530 nm. A concentração de proteína foi medida utilizando o método de Bradford com o kit comercial da BioRad (Hercules, CA, EUA) .

Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de hidrolisar 1 pmol de substrato a 37°C durante 1 minuto. As atividades foram expressas em U/mg de proteína. A capacidade das estirpes para transportar e hidrolisar os péptidos derivados da digestão de gliadinas foi determinada por electroforese. Neste caso, as suspensões celulares foram ajustadas para uma densidade ótica de 4 até 655 nm, equivalente a 109 cfu/ml, e foram incubadas com três diferentes hidrolisados de gliadina a uma concentração final de 300-600 pg/ml em PBS aos quais foi adicionado 0,2% de glucose. Os hidrolisados de gliadina (Sigma, St. Louis, MO) foram obtidos por estimulação do processo de digestão gastrointestinal do seguinte modo: A). 100 g de gliadinas foram digeridas em um litro de HCL a 0,2 N (pH: 1,8) com 2 g de pepsina purificada a 37° durante 2 h (este hidrolisado será referido como G-P). B) A digestão resultante foi digerida com tripsina através da adição de 2 g de tripsina 41 ΕΡ2236598Β1 após ajustar o pH para 8 utilizando NaOH a 2N (este hidrolisado será referido como G-P+T. C) A amostra dupla digerida foi então tratada com 2 g de pancreatina e agitada durante 2 horas a pH 8 (este hidrolisado será referido como G-P+T+X). Após cada estádio de digestão foi centrifugada a 10 000 g durante 10 min, e o sobrenadante foi armazenado para testes posteriores a - 20°C. As amostras digeridas foram inativadas por incubação a 100°C durante 30 minutos. As suspensões bacterianas foram incubadas na presença dos três hidrolisados de gliadina (A, B e C) durante 6 horas, a 37°C, em anaerobiose. As alterações na viabilidade durante as incubações foram determinadas utilizando o sistema comercial LIVE/DEAD BacLight Kit (Molecular Probes, Leiden, Países Baixos) para microscopia seguindo as instruções do fabricante. A contagem de bactérias vivas (verde) e mortas (vermelha) foi realizada num microscópio de epifluorescência BX 51 Olympus (Tóguio, Japão). Em todos os casos foram detetadas perdas mínimas de viabilidade (0,0-11,5%) após incubação. Após o período de incubação foi centrifugada para eliminar células e proteínas insolúveis e os sobrenadantes foram esterilizados por filtração (tamanho do poro de 0,22 mm, Millipore, Bedford, MA) para eliminar a possível presença de células viáveis. A capacidade das estirpes para transportar e utilizar os diferentes hidrolisados de gliadina foi determinada através da avaliação do desaparecimento de bandas em géis de poliacrilamida convencionais a 15% e em géis de Tris-Tricina (géis Ready 10-20% de gradiente linear, gel de empacotamento a 4%, Bio-Rad, Barcelona, Espanha) para separação de péptidos. As proteínas foram visualizadas através de coloração com Coomassie Brilliant Blue R-250. A redução em epitopos tóxicos que resulta do transporte e da digestão de gliadinas através da ação das bactérias selecionadas foi avaliada utilizando um 42 ΕΡ2236598Β1 ensaio de ELISA de sanduíche R5 (Centro Nacional de Biotecnologia, Madrid).

Tabela 2. Atividade de peptidase de estirpes de bifidobactérias e lactobacilli de origem intestinal contra substratos sintéticos

Estirpes Atividade especifica (U/mg proteína)* Val-Pro Pro-Gly Leu-Gly- Gly Pro-pNA Leu-pNA Suc-Ala— Pro-pNA Gly- PropNA 1ES1 18,1±3,5 15,7±3,8 132,3±7,2 480,2±91,7 80,0±8, 9 8,5±1,9 17,1±0,0 ^A2 27,1±14,0 27,1±07,5 326,1±15,Ç 140,5±6,4 176,5±3,5 18,5±4,8 60,43±11, 0 15707 27,4±2,0 37,9±0,8 - - 5,1 ±0,5 0,02±0,6 0,2±0,5 4 Lm VI 9,34±0,7 10,3±0,6 54,6±2,7 7,8±3,7 61,8±3,4 8,0±3,5 15,2±3,2 *Média ± DP., não avaliado 1Estirpe da invenção (IATA-ES1), 2Bifidobacterium IATA-A2, 3Bifidobacterum longum ATCC 15707, 4Lactobacillus reuteri LM1V. EXEMPLO 3. REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA CAUSADA POR GLIADINAS EM CÉLULAS IMUNOCOMPETENTES ATRAVÉS DA SUA CO-INCUBAÇÃO COM ESTIRPES DO GÉNERO Bifidobacterium SELECIONADAS PELAS SUAS PROPRIEDADES IMUNOMODULADORAS.

As suspensões da estirpe selecionada (10δ—109 CFU/ml), assim como outros incluídos para propósitos comparativos, foram incubadas com os diferentes hidrolisados de gliadina (P, P+T e P+T+P), obtidas como descrito no exemplo 3, e os PBMCs numa concentração de 106 cfc/ml durante 24 h. Como estímulo de controlo os diferentes hidrolisados de gliadina foram utilizados sem bactérias e LPS de E. coli 0111:B4. A produção de citoquina basal foi também detetada sem adicionar qualquer 43 ΕΡ2236598Β1 estímulo. 0 procedimento para isolar PBMCs, estimular e detetar citoquinas foi descrito no exemplo 1.

Tabela 3. Produção de citoquinas por PBMCs estimuladas simultaneamente por gliadinas digeridas em condições gastrointestinais e na presença de culturas inviáveis de bifidobactérias e outras bactérias lácticas com origem intestinal.

Produção de citoqulna (pm/mL) Estímulo IL-1 IL—8 IFN—γ IL—10 IL—15 RPMI ND 173+17 9 + 1 58 + 3 ND LPS ND 2295+83 12+0,5 399+8 175+17 G-P 61±2 4570+484 4267 299+149 34 + 1 G-P + T 169622 149+83 13 6+16 37 + 3 5375+13 G-P+T+X 7 5±1 5264+122 36+9 272+18 25 + 7 1ES1/G-P 123±8 4921+129 11 + 1 1192+752 10 + 7 ES1/G-P+T 48±4 4928+288 8, 2+5 935+426 27+10 ES1/GP+T+X ND 5151+146 2+0, 5 1054+477 ND ÍA2/G-P 109+215 4480+23 6, 9+2 395+216 29+8 A2/G-P+T 129+4 2848+45 43+22 1002+615 46+13 A2/G-P+T+X 129+1 5099+30 29+4 1314+724 134+57 3LM1V/G-P ND 5152+119 62+31 721+16 33+4 LM1 V/G- P + T ND 5015+75 11 + 5 458+218 2 6+4 LM1 V/GP+ T+X ND 5189+98 -82+35 457+257 6 + 1

ND, não detetado 1Estirpe da invenção (IATA-ES1) 2Bifidobacterium IATA-A2 3Lactobacillus reuteri LM1V 44 ΕΡ2236598Β1 EXEMPLO 4. CAPACIDADE DAS BIFIDOBACTÉRIAS SELECIONADAS PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE ISOLADOS DA MIROBIOTA INTESTINAL DE DOENTES COM DOENÇA CELÍACA COM POTENCIAL PATOGÉNICO. A atividade antimicrobiana das estirpes do género Bifidobacterium previamente selecionadas de acordo com as suas propriedades imunomodulatórias seguindo o procedimento descrito no Exemplo 1, foi determinado através de dois métodos: (i) a técnica da camada dupla e (ii) a técnica de difusão no agár. A atividade antibacteriana de cada estirpe foi avaliada globalmente através da técnica da dupla camada utilizando como microrganismos indicadores, bactérias isoladas a partir da microbiota intestinal de doentes com doença celiaca e com potencial patogénico. As bifidobactérias foram cultivadas em placas de MRS-C em linhas de cerca de 2 cm e foram incubadas em condições ótimas durante 16 h e o seu subsequente desenvolvimento foi inibido utilizando clorofórmio. 0 microrganismo indicador foi inoculado numa concentração de 104-105 CFU/ml em 10 ml de agar semissólido adequado, vertido sobre a camada de agár do microrganismo protetor e incubado a 37°C em anaerobiose. Após 24 h foram medidos os halos de inibição à volta das linhas de cultura das bifidobactérias.

De modo a avaliar a atividade antibacteriana devido à secreção de compostos de natureza proteica foi utilizada a técnica de difusão em agár. Foi inoculado 10 ml de meio de crescimento MRS-C a 1% com uma cultura de 24 h de cada uma das bifidobactérias e incubadas durante 16 h a 37°C. Os sobrenadantes foram obtidos por centrifugação (12 000 g, 15 min, 4°C) e concentrados por liofilização. As amostras 45 ΕΡ2236598Β1 liofilizadas foram ressuspensas em 1 ml de tampão fosfato a 50 mM a pH 6,5, neutralizadas com NaOH até atingir um pH de 6,5 para eliminar os efeitos dos ácidos orgânicos produzidos por fermentação, e esterilizadas por filtração. Estas amostras constituíram extratos brutos em que a possível atividade de proteínas antibacterianas produzidas pelas bifidobactérias foi determinada. O microrganismo indicador foi inoculado a uma concentração de 104-105 células/ml em 10 ml de agár semissólido e vertido sobre uma camada sólida de agár do mesmo meio. Após solidificar, os poços de 5 mm foram perfurados, aos quais foram adicionados 40 μΐ do extrato isento de células e neutralizados de cada uma das bifidobactérias. Foi deixado difundir durante 4 h a 4°C e foi subsequentemente incubado em condições ótimas para o indicador ou microrganismo patogénico. Após incubação os halos de inibição à volta do poço foram medidos.

Tabela 4. Inibição de bactérias potencialmente patogénicas isoladas culturas a partir de doentes das bifidobactérias. celíacos por Estirpes Inibição por (cm) Blfidobacterium spp IATA-A2 IATA—ESI Bacteroides CAQ4 0,4 1,4 Bacteroides vulgatus 0,5 1,3 Clostridium difficile 0,9 1,6 E. coli CBE9 1,1 1,9 BC-BP1 0,5 1,2 BC-B01 0,7 1,0 BC-BU1 2, 3 2, 0 BC-BU3 1,0 1,3 46 ΕΡ2236598Β1

Tabela 5. Inibição das bactérias potencialmente patogénicas isoladas a partir de sobrenadantes de culturas de bifidobactérias de doentes celíacos.

Estirpe indicadora Inibição por (cm) Bifidobacterivaa spp. IATA-A2 IATA-ES1 Bac CAQ4 0,40 0, 45 Ent CBE9 0, 95 1,15

EXEMPLO 5. AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA DAS BIFIDOBACTÉRIAS ÀS CONDIÇÕES DE STRESSE GASTROINTESTINAL A resistência das bifidobactérias isoladas às condições ácidas dos sucos gástricos, que constituem a primeira barreira biológica limitando a viabilidade de probióticos após ingestão, foi confirmada para cada uma das estirpes recuperadas. Para fazer isto, as suspensões de células de cada estirpe foram preparadas (108 células/ml) em PBS, contendo 3 g/1 de pepsina (Sigma, St. Louis, MO) e ajustada a pH 2 com HC1 e foram incubadas a 37°C durante um total de 120 min. Em diferentes vezes (0, 90 e 120 min), incluindo o tempo médio de esvaziamento gástrico (90 min), alíquotas foram tomadas para determinar a viabilidade através de contagens em placas de agar MRS-C. Subsequentemente, a tolerância de estirpes resistentes a pH ácido a outras condições de stresse tais como bílis, NaCl e elevadas temperaturas, foi estudada. Para conhecer a tolerância das estirpes estudadas à tolerância à bílis, a sua capacidade para crescer foi avaliada em MRS-C, a que foram adicionadas várias concentrações (0,5-1,5%) de Ox-gall (Sigma, St. Louis, MO). As alíquotas de 200 mL de cada meio, inoculada a 1% com 47 ΕΡ2236598Β1 culturas de 24 h, foram aplicadas em placas multi-poço e incubadas a 37°C. 0 crescimento foi monitorizado utilizando medições de absorvência a 655 nm num espectrofotómetro 550 Microplate Reader (BioRad, Hercules, CA) .

Tabela 6. Efeito das condições gástricas na capacidade de crescimento e viabilidade das estirpes de Bifidobacterium

Viabilidade Capacidade de crescimento* <%) PH pH 3 2,5 2 Estirpes 3 2,5 2 Controlo Log cfu/mL t%) Log cfu/mL t%) Log cfu/mL t%) IATA-ES1 99, 4 ±4,2 86, 2± 13, 0 57, ± 2,3 9, 3± 0,0 9, 3± 0,0 99, 7 8, 1± 0,0 86, 7 5, 2± 0,0 56, 1 BIR 324 89,4 ±2,3 73, 1± 1, 0 61, 6+ 1,7 9, 1± 0,0 8,8± 0,0 96, 9 8,8± 0,2 96, 8 5, 7 9± 0,1 63, 6 Bion 3 98, 4 ±1, 9 78,4±1 , 7 11,6+ 3, 7 9, 0± 0,0 7,3± 0,0 81,2 4,8± 0,1 52,8 NCIMB 8809 1, 8± 0,5 8, 1± 0, 0 ^Viabilidade expressa como a percen Kit system (Molecular Probes) em s 100 %. fCapacidade de crescimento expressa e expressa como uma percentagem da ser 100 %. '/Desvios padrão médios dos resulta -, não detectado tagem da v jspensões em Log cfi_ recontagem dos obtidos iabilidade celulares c /mL determ da suspens em três t detetac =m PBS inado p ão de c estes i ia utilizar a pH 7,2, cr contagen élulas em /dependente ido o LI que foi 4 em pia DBS, que s nd, n VE/DEAD Ba considera cas de aga foi consi ão determi cLight do ser r MRSC derada /ado 48 ΕΡ2236598Β1

Tabela 7. Tolerância das estirpes Bifidobacterium à presença de sais biliares

Estirpes Capacidadede crescimento relativa* (%) Concentração de oxgall (%) Controlo 0, 5 1,0 2,0 3,0 IATA-ESl 100 88,22±0,70 82,65±1,60 69,95±0,33 67,28±1,31 A2 100 73,03±0,98 64,12±1,79 60,96±0,59 38,21±1,44 BIR 324 100 62,68±3,55 43,99±1,64 38,29±0,32 37,06±0,48 NCIMB 8809 100 45,07±8,20 23,88±7,56 3,94±1,05 0,70±1,00 Bion 3 100 30,17±3,2 23,30±0,0 - — *Dados expressos como uma percentagem da velocidade de crescimento (h_1) obtidos na ausência de bílis, que foi considerado como sendo 100%. Os desvios padrão médios dos resultados obtidos em três experiências independentes.

EXEMPLO 6. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DAS BIFIDOBACTERIAS SELECIONADAS

As estirpes do género Bifidobacterium foram isoladas a partir de fezes de bebés saudáveis alimentados a peito que não tinham ingerido alimentos contendo bifidobactérias durante pelo menos um mês antes da análise e a quem não tinha sido dado qualquer tratamento com antibióticos. As amostras foram mantidas a 4°C e foram analisadas sem terem passado mais do que duas horas desde a sua colheita. Duas gramas de cada uma foram diluídas em 10 mM de tampão fosfato contendo uma concentração de NaCl a 130 mM (PBS) e foram homogeneizadas num digestor Lab-Blender 400 (Seward Medicai, London, UK) durante 3 min, e depois diluídas em água peptonada. As alíquotas de 0,1 ml de várias diluições decimais foram inoculadas em agar MRS (de Man Rogosa and 49 ΕΡ2236598Β1

Sharpe; Scharlau, Barcelona) contendo 0,05% de cisteína (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), e 80 mg/mL de mupirocina. Após 48-houras de incubação a 37°C em condições de anaerobiose (AnaeroGen, Oxoid, UK) as colónias isoladas foram selecionadas e a sua identidade foi confirmada através de um estudo da sua morfologia sob coloração de Gram. A identidade dos isolados foi confirmada por PCR especifico para o género, de acordo com a metodologia descrita por Kaufman et al. (1997, Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA targeted probes by colony hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273), utilizando os iniciadores (LM26 e LM3) que amplificam um fragmento de 1,35 kb do gene do RNA 16S ribossómico. Também, o gene rRNA 16S foi sequenciado a partir de DNA total. O fragmento sequenciado foi amplificado utilizando os iniciadores 27f e 1401r e foi purificado utilizando o sistema comercial GFX™PCR (Amershan, Bioscience, UK). Para a sequenciação, os iniciadores 530f e U-968f foram também utilizados de acordo com os procedimentos descritos por outros autores (Jonson, 1994. Similarity analysis of rRNAs. In Methods for General and Molecular Bacteriology; Gerhard, P.; Murray, R. G.E.; Wood, W.A.; Krieg, N.R., Eds. American Society for Microbiology, Washington, DC. Pp 683-700; Satokari et al., 2001. Bifidobacterial Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific PCR and Denaturating Gradient Gel Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Molecular Monitoring of

Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-22). A sequenciação foi efetuada utilizando um sequenciador automático de DNA ABI 3700 (Applied Biosystem, Foster City, CA) . A pesquisa das sequências relacionadas foi efetuada na base de dados GenBank 50 ΕΡ2236598Β1 utilizando o algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol Biol. 215, 403-410). EXEMPLO 7. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE ESTIRPES DO GÉNERO BIFIDOBACTERIUM PARA REGULAR AS RESPOSTAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS CAUSADAS PELA MICROBIOTA INTESTINAL ALTERADA DE INDIVÍDUOS CELÍACOS COM DOENÇA ACTIVA E APÓS TRATAMENTO COM UMA DIETA ISENTA DE GLÚTEN. 1. Preparação das culturas intestinais de bifidobactérias e amostras fecais para avaliação.

As estirpes do género Blfldobacterium foram inoculadas em 10 ml de meio de crescimento MRS (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Espanha) contendo cerca de 0,05% de cisteina (MRS-C) a 1% com uma cultura de 24 h e foram incubadas durante 22 h a 37°C em anaerobiose. (AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK). As células foram recolhidas por centrifugação (6 000 g, 15 min) , lavadas duas vezes em PBS (10 mM de fosfato de sódio, 130 mM de cloreto de sódio, pH 7,4), e ressuspensas em PBS contendo 20% de glicerol. As aliquotas destas suspensões foram congeladas utilizando azoto liquido e conservadas a -80°C. O número de células viáveis após o ciclo de congelamento-descongelamento foi determinado por recontagem de placas MRSC após incubação durante 48 h. A viabilidade foi superior a 90% em todos os casos. Cada alíquota foi utilizada para um único teste.

As fezes de doentes celíacos com a doença ativa (no momento de diagnóstico) e tratado com uma dieta isenta de glúten durante pelo menos 2 anos foram diluídos 1/10 em tampão fosfato, homogeneizado num digestor durante 3-5 51 ΕΡ2236598Β1 minutos e congelado a -20 °C para utilização como um estimulo nas células mononucleares do sangue periférico. As amostras de fezes dos indivíduos saudáveis foram também tomadas como controlos.

2. Isolamento e estimulação de PBMC

Os PBMC do sangue periférico de 4 voluntários saudáveis (média de 30 anos de idade, variando de 24-40) foram isolados em tubos com heparina. O isolamento de PBMC foi efetuado por centrifugação em gradiente de Ficoll (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . As células foram lavadas em meio RPMI 1640 (Cambrex, Nova Iorque, USA) e ajustadas a uma densidade de 1 x 106 células/ml em meio RPMI 1640 contendo também 10% de soro fetal de bovino (Gibco, Barcelona, Espanha), 2 mM de L-glutamina, 100 mg/ml de estreptomicina e 100 U/ml penicilina (Sigma). As PBMC foram incubadas em placas de poliestireno de 24 poços de fundo plano (Corning, Madrid, Espanha) na presença ou ausência de agentes de estimulação a 37° C, a 5% de C02, durante 24 h. Como um estímulo, foram utilizados extratos das fezes de indivíduos saudáveis, doentes com doença celíaca ativa e não ativa, na presença ou ausência de 30 mL de suspensões de células bacterianas vivas de 1 x 106 CFU/ml. Como um controlo positivo foi utilizado lipopolissacárido purificado (LPS) de E. coli 0111:B4 (Sigma, St. Louis, MO) numa concentração de 1 pg/ml. Como um controlo negativo foi testada a produção de citoquina em PBMC não estimuladas. Cada tipo de estímulo foi testado em duplicado em cada experiência. Os sobrenadantes das culturas foram recolhidos por centrifugação, fracionada e armazenada em alíquotas a -20°C até detecção da citoquina. 52 ΕΡ2236598Β1 3. Determinação de citoquinas e marcadores de ativação celular A concentração de citoquinas (IFN-γ, IL-10, e TGF-β) dos sobrenadantes foi medida utilizando kits ELISA de Bioscience (BD Biosciences, San Diego, CA) após as instruções do fabricante. Os marcadores das diferentes populações de linfócitos e os de ativação foram detetados utilizando anticorpos anti CD4, CD8 e CD86 marcados com FITC (eBioscience, San Diego, CA) e citometria de fluxo (Flow cytometer EPICS® XL-MCL; Beckman Coulter, Flórida). A implicação da via de transdução de sinal mediada pelo fator nuclear (NF) kB na resposta imunitária foi determinada por adição de um seu inibidor (lactacistina).

Resultados

As fezes de doentes com doença celiaca, que apresentaram alterações na composição dos microbiota, induziram uma produção de citoquinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ) superior à dos indivíduos saudáveis e uma produção da citoquina IL-10 anti-inflamatória inferior à de indivíduos saudáveis em PBMC. Estas também aumentaram a síntese da molécula de superfície CD86 essencial para a ativação de células T mais do que as fezes de controlo. A co-incubação com bifidobactéria regula o perfil de citoquinas pró-inflamatórias induzidas pela microbiota fecal de doentes com doença celíaca, reduzindo a síntese de TNF-α e IFN-γ e aumentando a de IL-10. A inibição da síntese de citoquinas na presença de lactacistina sugere que o NF kB está envolvido nos efeitos imunomoduladores exercidos pelas bifidobactérias. 53 ΕΡ2236598Β1

EXEMPLO 8: CARACTERIZAÇÃO DAS FRAÇÕES DE GLIADINAS PRODUZIDAS NO PROCESSO DE DIGESTÃO IN VITRO E CARACTERIZAÇÃO DA REDUÇÃO DE PÉPTIDOS DERIVADOS DA DIGESTÃO GASTROINTESTINAL DE GLIADINAS POR BIFIDOBACTÉRIAS E SEUS EFEITOS BIOLÓGICOS 1. Digestão de Gliadina Gastrointestinal

Foi utilizada uma preparação de gliadinas (Sigma, G3375) que contém quatro das isoformas, gliadinas α-β-, γ-, e ω-, destas proteínas cuja sequência completa de aminoácidos está disponível. A solução de diferentes alíquotas (150 mg) do extrato comercial de gliadinas foi efetuada numa solução salina isotónica (140 mM de NaCl, 5 mM de KC1) a pH 3, aquecendo a mistura a 55°C durante 30 minutos num banho com agitação. As amostras foram sujeitas a um processo de digestão gastrointestinal simulada utilizando pepsina (Sigma, P7000) (800-2500 Ul/mg proteína) e pancreatina porcina (P1750) (atividade, 43USP), e extrato de bílis (B3883). A digestão gástrica (pepsina em 0,1M de HCl/pH 3/lh, em agitação) foi efetuada em tubos de centrifugação (50 ml). Subsequentemente, o estádio intestinal (pancreatina-bílis em 0,1 M de NaHC03/pH 6,9-7/2h, em agitação) foi efetuada no compartimento superior (dador) (1,5 ml) de um sistema de bicâmara preparado com uma membrana de diálise (Spectra/Por 2.1, Spectrum Medicai, Gardena, CA) com um tamanho de poro de 15 KDa. No compartimento inferior (recetor) foi colocada uma solução salina (1 mL). Uma vez completo o processo de digestão o conteúdo em proteína total foi quantificado no sobrenadante (4000 rpm/5 min/4°C) da amostra gastrointestinal 54 ΕΡ2236598Β1 digerida e na amostra dialisada utilizando um kit comercial (Sigma, TP0200) com base no método de Lowry. 2. Análise cromatográfica das frações de gliadina após o processo de digestão in vitro.

Para analisar as gliadinas foi adaptado um método cromatográfico em fase reversa. A separação foi efetuada numa coluna BioBasic C18 (5 mm 4.6x250 mm) utilizando o equipamento 1050 HPLC de Hewlett Packard. As fases móveis utilizadas consistem em (A) Acetonitrilo (ACN, qualidade HPLC) aquosa a 15% (v/v) com ácido Trifluoroacético (TFA) 0,1 % (v/v) , e (B) ACN aquoso a 80% (v/v) com TFA 0,1% (v/v). O gradiente de eluição utilizado foi como se segue; 0-5 min., gradiente linear até 5% do solvente B; 5-12 min., gradiente linear até 20% do solvente B. A coluna foi lavada com 100% do solvente B durante 5 minutos, e foi reequilibrada utilizando as condições iniciais durante 3 minutos. As amostras foram filtradas através de uma membrana de nylon (13 mm 0,22 mm Millex GN, Millipore). Três aliquotas independentes de cada tratamento foram analisadas (100 μΐ). A absorção na região ultravioleta foi monitorizada a 210 nm. 3. Identificação das sequências de péptidos de gliadinas utilizando cromatográfia de fase reversa acoplada a electrospray-MsMs (RP-HPLC-ESI-MS/MS).

A separação cromatográfica foi realizada numa coluna BioBasic C18 (5 mm 4,6x250 mm) utilizando um sistema HPLC

Agilent acoplado a um espectrómetro de massa com uma armadilha de iões quadruplo (Esquire-LC-Ms(n), Bruker Daltonics, Billerica, MA). O gradiente de eluição 55 ΕΡ2236598Β1 cromatográfica empregue foi o descrito na secção anterior. Na análise o azoto foi utilizado como nebulizador e gás de secagem, e hélio como o gás para a colisão molecular a uma pressão aproximada de 5 x 10 3 bar. A voltagem capilar da colisão foi mantida a 4 kV. 0 espectro de massa foi

monitorizado no intervalo de massa/carga de 500 - 5000. O método mostra a análise de massa média (Ms) do espectro 15, e a análise de massa sequencial Ms(n) do espectro 5. O limite da corrente de ião para efetuar a análise sequencial de massa foi estabelecida como 5000, e os iões precursores foram isolados num intervalo m/z de 4,0 fragmentado com uma rampa de voltagem de 0,39 a 2,6 V. Os dados espectrais m/z foram processados e transformados utilizando o programa computacional de análise fornecido pelo fabricante (Data Analysis versão 3, Bruker Daltonics) . As sequências de péptidos do espectro Ms(n) foram estabelecidas utilizando programas computacionais de análise (BioTools versão 2.1 (Bruker Daltonics). 4. Efeitos da co-incubação das gliadinas gastrointestinais digeridas com bifidobactérias.

As amostras de gliadina gastrointestinal digeridas obtidas na secção 1 foram co-incubadas na presença e ausência de bifidobactérias intestinais, tais como a estirpe da invenção, situada na parte apical (dador) de uma cultura de células Caco-2 em transpoço, utilizado como modelo do epitélio intestinal. Com o propósito de estimar a redução dos efeitos tóxicos das gliadinas na presença da estirpe da invenção (IATA-ES1), a síntese das citoquinas pró-inflamatórias TNF-α e NFkB foi medida utilizando métodos ELISA na cultura de células Caco-2 da câmara inferior 56 ΕΡ2236598Β1 (recetor) na presença e ausência das bifidobactérias (Figuras 3 e 4) .

Resultados

Análise por RP-HPLC da fração de proteína inferior a 15 KDa derivados_da_diálise_das_amostras_de_gliadina gastrointestinal digeridas. A separação cromatográfica (Figura 2) revela a presença de cinco frações de péptido sendo a principal a fração #2. Os estudos de diálise dos péptidos derivados de gliadina na presença de diferentes estirpes bacterianas (i. e., estirpe da invenção (IATA-ES1) e Bifidobacterium A2, isoladas no nosso laboratório demonstrou a capacidade proteolítica destas bactérias em gliadinas e especificamente na fração #2. A estirpe que causou a redução mais importante da fração #2 foi a estirpe da invenção (IATA-ES1), que reduziu mais do que 10% da fração nas condições do estudo. EXEMPLO 9. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE ESTIRPES DO GÉNERO BIFIDOBACTERIUM REGULAREM A MATURAÇÃO INDUZIDA POR GLIADINA E FEÓTIPO PRO—INFLAMATÓRIO EM CÉLULAS DENDRÍTICAS ENVOLVIDAS NA APRESENTAÇÃO DE ANTIGÉNIO. 1. Preparação das culturas de bifidobactérias intestinais e amostras de fezes para avaliação.

As estirpes do género Bifidobacterium foram inoculadas em 10 ml de meio de crescimento MRS (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Espanha) contendo 0,05% de cisteína (MRS-C) a 1% com uma cultura de 24 h e foram incubadas durante 22 h a 37°C em anaerobiose (AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK) . As 57 ΕΡ2236598Β1 células foram recolhidas por centrifugação (6 000 g, 15 min), lavados duas vezes em PBS (10 mM de fosfato de sódio, 130 mM de cloreto de sódio, pH 7,4), e foram ressuspensos em PBS contendo 20% de glicerol. Alíquotas destas suspensões foram congeladas utilizando azoto liquido e conservados a -80°C. O número de células viáveis após o ciclo de congelamento-descongelamento foi determinado por contagem em placas de agar MRSC após incubação durante 48 h. A viabilidade foi superior a 90% e todos os casos. Cada alíquota foi utilizada para um único teste. Antes de utilizar as células como estimulo estas foram lavadas por centrifugação e foram ressuspensas em PBS. 2. Isolamento e estimulação de células dendríticas (DC) obtidas a partir de sangue periférico.

As PBMC foram isoladas a partir do sangue periférico de 4 voluntários saudáveis (idade média de 30 anos, variando de 24-40) em tubos com heparina. As PBMC foram isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As células foram lavadas com meio RPMI 1640 (Cambrex, Nova Iorque, USA) e foram ajustados para uma densidade de 1 x 106 células/ml em meio RPMI 1640 contendo também 10% de soro fetal de bovino (Gibco, Barcelona, Espanha), 2 mM de L-glutamina, 100 pg/ml de estreptomicina e 100 U/ml penicilina (Sigma). As PBMC foram incubadas em placas de 24 poços de poliestireno de fundo plano (Corning, Madrid, Espanha) na presença ou ausência de agentes de estimulação a 37°C, a 5% de o o to durante 2 4 h. como um estimulo foi utilizada gliadina (0,1 pg/ml) e IFN-γ (150 UI) na presença e ausência de bifidobactérias e outras bactérias intestinais. Como um controlo positivo foram utilizados 58 ΕΡ2236598Β1 lipopolissacáridos purificados (LPS) de E. coli 0111:B4 (Sigma, St. Louis, MO) a uma concentração de 1 mg/mL. Como um controlo negativo foi testada a produção de citoquina em PBMC não estimuladas. Cada tipo estimulo foi testado em duplicado em cada experiência. Os sobrenadantes das culturas foram recolhidos por centrifugação, fracionada e armazenada em aliquotas a -20°C até deteção da citoquina. 3. Determinação de marcadores de citoquinas e ativação celular

As concentrações de citoquinas (IFN-γ, IL-10, e TGF-β) dos sobrenadantes foram medidas utilizando kits ELISA da Bioscience (BD Biosciences, San Diego, CA) seguindo as instruções do fabricante. Os marcadores de moléculas de ativação foram detetados utilizando anticorpos contra HLA-DR, CD86, CD40 e CD83 marcados com FITC (eBioscience, San Diego, CA) e foram quantificados por citometria de fluxo (Flow cytometer EPICS® XL-MCL; Beckman Coulter, Florida).

Resultados A estirpe da invenção (IATA-ES1) reduziu pelo menos em 10% a produção de IFN-γ, a principal citoquina inflamatória que é produzida em resposta a gliadinas em doentes com doença celíaca, provocada pela estimulação das células dendríticas com gliadinas e outras bactérias intestinais potencialmente pró-inflamatórias (e.g. bacteróides e enterobactérias isolados de doentes com doença celíaca). Esta estirpe também produziu um aumento na síntese da citoquina anti-inflamatória IL-10 por células dendríticas de pelo menos 200% em comparação com o efeito produzido pela estimulação com 59 ΕΡ2236598Β1 gliadinas. A estirpe da invenção (IATA-ES1) reduziu a expressão de moléculas HLA-DR e CD86, induzidas após a incubação das células dendriticas na presença de gliadina e IFN-γ, entre 15 e 20%.

Lisboa, 25 de Março de 2013 60

Claims

ΕΡ2236598Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe de Bifidobacterium longum depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT) com o número de acesso CECT 7347.
2. Estirpe como reivindicado na reivindicação 1, na forma de células viáveis.
3. Estirpe como reivindicado na reivindicação 1, na forma de células não viáveis.
4. Combinação de microrganismos, que compreende a estirpe como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3 e pelo menos outro microrganismo.
5. Combinação de microrganismos como reivindicado na reivindicação 4, em que os outros microrganismo são B. longum ATCC 15707 ande/ou L. lactis NCD0712.
6. Sobrenadante de uma cultura ou extrato obtido do microrganismo como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3, ou da combinação de microrganismos como reivindicado nas reivindicações 4 ou 5.
7. Utilização da estirpe B. longum como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3; ou da combinação de microrganismos como reivindicado nas reivindicações 4 ou 5; ou dos sobrenadantes ou extratos como reivindicado na reivindicação 6, para a preparação de formulações concebidas para reduzir os riscos e melhorar o estado de saúde de doentes com doenças relacionadas com a tomada de glúten. 1 ΕΡ2236598Β1
8. Utilização como reivindicado na reivindicação 7, para a preparação de formulações concebidas para a prevenção e/ou tratamento de doença celíaca.
9. Utilização como reivindicado nas reivindicações 7 ou 8, em que a formulação preparada é um alimento, um nutracêutico, um suplemento, uma composição farmacêutica, um probiótico e/ou a um simbiótico.
10. Composição nutricional que compreende a estirpe B. longum como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3, ou a combinação de microrganismos como reivindicado nas reivindicações 4 ou 5, ou os sobrenadantes ou extratos como reivindicado na reivindicação 6.
11. Composição como reivindicado na reivindicação 10, que adicionalmente compreende um veículo.
12. Composição como reivindicado na reivindicação 11, em que o veículo é leite, iogurte, queijo, leite fermentado, derivados lácteos, cereais, cereais fermentados, sumos, gelados, e/ou formulações para crianças.
13. Composição como reivindicado em qualquer das reivindicações 10 a 12, em que a estirpe B. longum está presente numa quantidade de cerca de 106 cfu a cerca de 109 cfu por grama ou mililitro da composição.
14. Composição como reivindicado em qualquer das reivindicações 10 a 13, em que a referida composição pode ser encontrada na forma de um comprimido, cápsula, microcápsula, pó, solução ou pasta. 2 ΕΡ2236598Β1
15. Composição farmacêutica que compreende a estirpe de B. longum como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 3 ou a combinação de microrganismos como reivindicado nas reivindicações 4 ou 5; ou os sobrenadantes ou extratos como reivindicado na reivindicação 6, em conjunto com quantidades apropriadas de excipientes farmacologicamente aceitáveis. Lisboa, 25 de Março de 2013