ES2343499B1 - Microorganismos para mejorar el estado de salud de individuos con desordenes relacionados con la ingesta de gluten. - Google Patents
Microorganismos para mejorar el estado de salud de individuos con desordenes relacionados con la ingesta de gluten. Download PDFInfo
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Abstract
Microorganismos para mejorar el estado de salud
de individuos con desórdenes relacionados con la ingesta de
gluten.
La presente invención aporta una nueva cepa del
género Bifidobacterium, sus componentes celulares, moléculas
secretadas y compuestos metabólicos y las combinaciones de éstos
entre sí y con otras bifidobacterias y bacterias lácticas en forma
de diversos preparados (alimentos funcionales y nuevos alimentos,
probióticos, simbióticos, suplementos, nutracéuticos, y
formulaciones farmacéuticas) destinados a la reducción de riesgos y
mejora del estado de salud de los pacientes que sufren enfermedad
celíaca y otros desórdenes asociados a la ingesta de gluten. Sus
mecanismos de acción incluyen: (i) la regulación de la respuesta
inmunológica innata y adaptativa; (ii) la reducción de la
concentración de epitopos tóxicos en la luz intestinal; (iii) el
fortalecimiento de la función barrera defensiva frente a bacterias
perjudiciales, y (iv) el aporte de actividades enzimáticas
quefavorecen la digestión.
Description
Microorganismos para mejorar el estado de salud
de individuos con desórdenes relacionados con la ingesta de
gluten.
La presente invención pertenece al sector de la
Industria Alimentaria y Farmacéutica. Más concretamente, esta
invención se enmarca dentro del campo de los probióticos y productos
derivados en forma de alimentos funcionales y nuevos alimentos,
probióticos, simbióticos, nutracéuticos o suplementos alimentarios y
formulaciones farmacéuticas con aplicaciones clínicas.
La enfermedad celíaca es una enteropatia,
afección del intestino, de carácter autoinmune causada por la
intolerancia permanente a las proteínas del gluten de los cereales,
que padecen los individuos genéticamente predispuestos. El espectro
clínico de la enfermedad es amplio e incluye formas típicas,
atípicas, silentes y potenciales. Las formas típicas se presentan
con mayor frecuencia durante los primeros años de vida
(6-24 meses) y cursan con sintomatología
principalmente intestinal y alteraciones asociadas (malabsorción,
diarrea crónica, pérdida de peso, distensión abdominal, retraso en
el crecimiento, etc.). Actualmente es la enfermedad crónica más
común, con una prevalencia del 0,7 al 2,0% en la población general y
del 15 al 20% en familiares de primer grado (Book et al.
2003. Prevalence of celiac disease among relatives of sib pairs with
celiac disease in U.S. families. Am J Gastroenterol.
98:377-81; Fasano y Catassi. 2005. Coeliac disease
in children. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 19:
467-78). Además, la ingesta de gluten y la
enfermedad celíaca está asociada al desarrollo de otros desórdenes
como por ejemplo el síndrome de Down, la diabetes mellitus tipo 1,
la dermatitis herpetiforme, la miopatía, la esclerosis múltiple, la
artritis, el autismo, la esquizofrenia, la depresión, los linfomas,
y la ataxia (Hernández y Green. 2006. Extraintestinal manifestations
of celiac disease. Curr Gastroenterol Rep. 8:383-9).
La relación entre la ingesta de gluten y las alteraciones
psiquiátricas, neurológicas y del comportamiento se considera fruto
de la generación de péptidos bioactivos, como por ejemplo las
exorfinas que poseen actividad opioide (De Santis 1997.
Schizophrenic symptoms and SPECT abnormalities in a coeliac patient:
regression after a gluten-free diet.J Intern Med.
242: 421-3).
Las proteínas del gluten (gliadinas y prolaminas
análogas y gluteninas) constituyen el principal factor ambiental
desencadenante de la enfermedad celíaca y otros desórdenes
asociados. Estas proteínas contienen secuencias peptídicas ricas en
prolina y glutamina, que las hace más resistentes a las enzimas
digestivas que otras proteínas de la dieta, pudiendo persistir en la
luz intestinal. En individuos susceptibles, estos péptidos son
responsables de una reacción anómala que implica tanto a la
inmunidad innata como adaptativa y que, globalmente, origina
inflamación crónica de la mucosa intestinal, aumento de los
linfocitos intraepiteliales, hiperplasia de las criptas, y un
deterioro progresivo de las vellosidades intestinales e incluso su
desaparición total. Los péptidos tóxicos generados tras la ingestión
del gluten atraviesan el epitelio intestinal y son reconocidos por
las moléculas HLA-DQ2 o HLA-DQ8 de
las células presentadoras de antígenos, preferentemente tras su
desamidación por acción de la transglutaminasa tisular. Así son
presentados a los receptores de las células T produciendo su
activación. Esto supone la expresión del antígeno CD4, llamado
también helper (Th), y su diferenciación en subpoblaciones,
implicando así a la inmunidad adquirida. La subpoblación Th2
interacciona con las células B que se diferencian en células
plasmáticas y producen anticuerpos anti-gliadina,
anti-endomisio y
anti-transglutaminasa tisular. La subpoblación Th1
es la responsable de un aumento de la secreción de citoquinas
pro-inflamatorias (principalmente
IFN-\gamma) y de la relación
IFN-\gamma/IL-10 (Salvati et
al 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin
dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac
intestinal mucosa. Gut. 54:46-53). Los péptidos del
gluten también pueden desencadenar una respuesta en el epitelio
intestinal mediada por la citoquina IL-15,
involucrando a la inmunidad innnata (Green y Jabri 2006. Celiac
disease. Annu Rev Med. 57:207-21). Las gliadinas
ingeridas estimulan la producción de IL-15 en las
células epiteliales, lo que favorece la expansión clonal de los
linfocitos T CD8 intraepiteliales citotóxicos y la expresión de
IFN-\gamma (Jabri et al. 2000. Selective
expansión of intraepithelial lymphocytes expressing the
HLA-E-specific natural killer
receptor CD94 in celiac disease. Gastroenterology.
118:867-79; Mention et al., 2003. Interleukin
15: a key to disrupted intraepithelial lymphocyte homeostasis and
lymphomagenesis in celiac disease. Gastroenterology.
125:730-45; Forsberg et al. 2007. Concomitant
increase of IL-10 and
pro-inflammatory cytokines in intraepithelial
lymphocyte subsets in celiac disease.Int Immunol. 2007;19,
993-1001). La composición de la microbiota
intestinal de pacientes celíacos también presenta un desequilibrio
en relación a la de controles sanos, caracterizado por un predominio
de bacterias potencialmente pro-inflamatorias y
alteraciones en la composición en especies de bacterias
acidolácticas y bifidobacterias (Sanz et al., 2007.
Differences in faecal bacterial communities in coeliac and healthy
children as detected by PCR and denaturing gradient gel
electrophoresis. FEMS Immunol Med Microbiol.
51(3):562-8. Nadal et al., 2007.
Imbalance in the composition of the duodenal microbiota of children
with coeliac disease. J Med Microbiol. DOI
10.1099/jmm.0.47410-0). En la luz y epitelio
intestinal, la combinación del gluten con un aumento de bacterias
perjudiciales puede actuar como desencadenante o bien favorecer el
proceso patológico y las reacciones
pro-inflamatorias en casos de enfermedad celiaca
activa, así como en otros trastornos asociados. Asimismo, la
presencia o ausencia de determinadas especies bacterianas puede
favorecer o proteger frente a la toxicidad del gluten.
La enfermedad celiaca presenta una elevada
incidencia y severidad; sin embargo, actualmente no existe ninguna
terapia para estos pacientes. La única alternativa es el
mantenimiento de por vida de una dieta estricta exenta de gluten. Su
seguimiento es difícil, los enfermos siguen sufriendo sintomatología
gastrointestinal, deficiencias nutritivas y mayores riesgos de salud
(enfermedades autoinmunes, osteoporosis, infertilidad, cáncer, etc.)
y el equilibrio de su ecosistema intestinal no se restablece
totalmente (Nadal et al., 2007. Imbalance in the composition
of the duodenal microbiota of children with coeliac disease. J Med
Microbiol. DOI 10.1099/jmm.0.47410-0). Además, los
individuos que presentan enfermedad celiaca refractaria
(5-10%) no responden a esta pauta dietética.
Las alternativas terapéuticas o coadyuvantes que
actualmente se encuentran en fase de investigación para el
tratamiento de la enfermedad celiaca incluyen la administración oral
de enzimas proteolíticas obtenidas a partir de plantas o
microorganismos para acelerar la digestión gastrointestinal de los
péptidos del gluten (Shan et al. 2005. Enzyme treatment of
foodstuffs for Celiac Sprue. 20050249719/A1; Marti et al.
2006. Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes
in whole gluten. 20060286601/A1; Stepniak y Koning. 2006. Enzymatic
gluten detoxification: the proof of the pudding is in the eating!
Trends Biotechnol. 24:433-4; Gass et al.
2007. Combination enzyme therapy for gastric digestión of dietary
gluten in patients with celiac sprue. Gastroenterology.
133:472-80). Su efectividad se ha demostrado en
sistemas modelo utilizando preparaciones de proteínas y péptidos o
sus equivalentes recombinantes, pero aún se requiere la realización
de estudios que demuestren su efectividad in vivo en
individuos que ingieran gluten tal y como está presente en los
alimentos. Pese a las posibles bondades de esta terapia como
adyuvante a la dieta exenta de gluten, sus efectos serán altamente
dependientes del momento de la ingesta del preparado enzimático.
Otra propuesta similar es la administración por vía oral de
lactobacilos con actividad proteolítica frente a los péptidos del
gluten (Bronstad et al., 2004. Composition for lowering the
concentration of intestinal pathogenic peptides. US 20040247581 ó
PCT/NO02/00354). Sin embargo, la eficacia de esta estrategia sólo se
basa en la reducción de la concentración de éstos péptidos sin
abordar ningún otro aspecto como los posibles efectos inmunológicos.
Como demuestran los últimos trabajos científicos, en individuos de
riesgo se debe demostrar la ausencia de reacciones inmunes adversas
derivadas del uso de lactobacilos (Ezendam y van Loveren. 2007.
Lactobacillus casei Shirota administered during lactation increases
the duration of autoimmunity in rats and enhances lung inflammation
in mice. Br J Nutr. 31-8). Otras alternativas
propuestas incluyen el desarrollo de compuestos inhibidores de la
transglutaminasa tisular (Khosla et al., 2006.
Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof
WO2007025247), anticuerpos capaces de capturar los péptidos de las
gliadinas (Fox, 2007. Antibody therapy for treatment of diseases
associated with gluten intolerance. 20070184049/A1), compuestos que
bloqueen los sitios de unión de los péptidos del gluten a las
moléculas HLA-DQ2 o HLA-DQ8 (Sollid
et al. 2007. Drug therapy for Celiac Sprue. 20070161572/A1);
Peakman y Chicz. 2007. Peptide epitopes recognized by disease
promoting CD4+ T lymphocytes. 20070142622/A1), antagonistas de
citoquinas proinflamatorias como el IFN-\gamma
(Maroun et al., 2007. Interferon antagonists useful for the
treatment of interferon related diseases. 20070160609/A1), la
admistración de citoquinas reguladoras recombinantes (Salvati et
al., 2005. Recombinant human interleukin 10 suppresses gliadin
dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac
intestinal mucosa. Gut. 2005; 54:46-53), inhibidores
de moléculas de adhesión implicadas en las reacciones inflamatorias,
y antagonistas de la zonulina responsable de los aumentos en la
permeabilidad paracelular (Paterson y Ginski. 2007. Formulations for
a tight junction effector US20070196501/A1; Sollid y Khosla. 2005.
Future therapeutic options for celiac disease. Nat Clin Pract
Gastroenterol Hepatol. 2:140-7; Paterson et
al. 2007. The safety, tolerance, pharmacokinetic and
pharmacodynamic effects of single doses of AT-1001
in coeliac disease subjects: a proof of concept study. Aliment
Pharmacol Ther. 26:757-66). Estas estrategias
suponen la modificación de moléculas implicadas en múltiples
procesos biológicos por lo que su manipulación puede dar lugar a
efectos secundarios no deseados. En el campo agroalimentario se
están desarrollando estrategias para evitar la presencia de epitopos
tóxicos en los alimentos que ingerimos mediante la manipulación
genética de determinadas variedades de trigo y la utilización de
enzimas y bacterias lácticas dotadas de actividad proteolítica
durante los procesos de fermentación de cereales que degraden los
epitopos tóxicos. De este modo, se pretende introducir mejoras en la
dieta de los pacientes celíacos y proporcionarles una mayor variedad
de productos pero sin prevenir o tratar la enfermedad (Rizzello
et al. 2007. Highly efficient gluten degradation by
lactobacilli and fungal proteases during food processing: new
perspectives for celiac disease. Appl Environ
Microbiol.73:4499-507).
El uso de cepas pertenecientes al género
Bifidobacterium como probióticos o preparados farmacéuticos para el
tratamiento y prevención de la enfermedad celiaca y los desórdenes
asociados no se han propuesto con anterioridad y es la base de la
presente invención. Las ventajas de bidifobacterias específicamente
seleccionadas para este fin son múltiples. Las bifidobacterias
tienen una capacidad especial para colonizar el tracto intestinal de
los recién nacidos, contribuyendo de forma significativa al
desarrollo de sus defensas (inmunológicas y de otra naturaleza) y a
la tolerancia oral a los antígenos de la dieta. Este grupo
bacteriano es uno de los constituyentes mayoritarios de la
microbiota intestinal en los primeros años de vida, especialmente en
niños que reciben lactancia materna (representando hasta el 91%;
(Harmsen, et al. 2000. Analysis of intestinal flora
development in breast-feed and
formula-feed infants by using molecular
identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol.
Nutr. 30: 61-67; Biavati, et al. 2001. The
family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.), The
Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, Nueva York). A su
vez, la lactancia materna parece ejercer un efecto protector frente
al desarrollo de la enfermedad celiaca en la infancia que puede
estar asociado con la protección ejercida por las bifidobacterias
intestinales. Los integrantes de este género poseen una maquinaria
enzimática especialmente adaptada para co-existir en
intestino aportando nutrientes esenciales al hospedador (Klijn et
al. 2005. Lessons from the genomes of bifidobacteria. FEMS
Microbiol Rev. 29:491-509). Asimismo, las cepas del
género Bifidobacterium se consideran globalmente inductoras de
respuestas inmunológicas reguladoras, con un carácter menos
pro-inflamatorio que los lactobacilos (Zeuthen et
al. 2006. Lactic acid bacteria inducing a weak
interleukin-12 and tumor necrosis factor alpha
response in human dendritic cells inhibit strongly stimulating
lactic acid bacteria but act synergistically with
gram-negative bacteria. Clin Vaccine Immunol.
13(3):365-75). La estrategia propuesta,
basada en una selección específica de bifidobacterias para elaborar
formulaciones destinadas a mejorar el estado de salud y riesgos de
individuos con enfermedad celíaca y otros desórdenes asociados a la
ingesta de gluten, es por tanto una alternativa idónea a las
propuestas con anterioridad.
La presente invención aporta una nueva cepa del
género Bifidobacterium (IATA-ES1), sus
componentes celulares, moléculas secretadas y compuestos
resultantes de su metabolismo y las combinaciones de éstos entre sí
y con otros microorganismos, en forma de preparados destinados a la
reducción de riesgos y mejora de la salud y calidad de vida de
individuos celíacos y con otros desórdenes asociados a la ingesta de
gluten (alergia, autismo, ataxia, diabetes, esclerosis múltiple,
etc.).
La bifidobacteria objeto de la invención,
Bifidobacterium IATA-ES1, fue aislada a
partir de heces de lactantes sanos e identificadas por secuenciación
del gen del ARNr 16S. La nueva cepa posee propiedades
inmunomoduladoras deseables para regular las respuestas
pro-inflamatorias de tipo Th1 características de la
enfermedad celíaca y enfermedades asociadas (esclerosis múltiple,
diabetes, ataxia, etc.), así como de las reacciones alérgicas de
tipo Th2 que pueden originarse como consecuencia de la ingesta de
proteínas de trigo y otros cereales. La cepa se caracterizan por
inducir baja producción de la citoquina Th1
IFN-\gamma y de la citoquina
pro-inflamatoria IL-1 y alta
producción de las citoquinas reguladoras IL10 y
TGF-\beta en células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs). El perfil de citoquinas inducido por esta cepa
no es una característica común a todas las bifidobacterias y
bacterias lácticas intestinales humanas y la hace especialmente
idónea para modular la anómala respuesta inmune que originan las
proteínas del gluten en individuos susceptibles. Su combinación con
otros microorganismos como por ejemplo la cepa B. longum
ATCC15707 puede potenciar la síntesis de la citoquina reguladora
IL-10 beneficiosa para controlar el proceso de
inflamación característico de estas patologías. Las bacterias no
viables (inactivadas por diversos procedimientos como calor,
congelación-descongelación, radiación, etc.)
mantienen las características inmuno-
moduladoras.
moduladoras.
Esta cepa es capaz de transportar e hidrolizar
los péptidos del gluten responsables de estos desórdenes reduciendo
la concentración de los epitopos tóxicos y su poder patogénico. La
bifidobacteria objeto de la patente posee peptidasas específicas
para hidrolizar sustratos que contienen prolina comunes en las
proteínas del gluten. La combinación de cepas de bifidobacterias que
poseen peptidasas de distinta especificidad permite que se
complemente su acción, favoreciendo la degradación de epitopos
tóxicos. Las combinaciones de bifidobacterias con otros
microorganismos como Lactococcus lactis NCD0712, que posee
una proteinasa anclada a la superpie celular, también potencia los
efectos hidrolíticos debidos exclusivamente a la acción de las
bifidobacterias.
La cepa objeto de la invención es capaz de
modular la respuesta inmune provocada por los péptidos del gluten
mediante: (i) la inducción de la síntesis de citoquinas reguladoras
(IL-10), (ii) la reducción de la producción de las
citoquinas IFN-\gamma, IL-1,
IL-8 e IL-15 derivadas de la
respuesta inmune innata y adaptativa y (iii) la inhibición de vía
pro-inflamatoria mediada por el factor nuclear
\kappaB (Ejemplo 3, Tabla 3).
La cepa objeto de la invención y los compuestos
derivados de esta son capaces de inhibir bacterias patógenas
asiladas de la microbiota intestinal de celíacos, con potencial
pro-inflamatorio y factores de virulencia
favoreciendo el restablecimiento del equilibrio intestinal (Ejemplo
4, Tablas 4 y 5). Estas cepas además son capaces de inhibir la
respuesta pro-inflamatoria de las bacterias
intestinales de paciente celíacos activos y con dieta exenta de
gluten, reduciendo la síntesis de citoquinas
pro-inflamatorias (TNF-\alpha e
IFN-\gamma y activando la de citoquinas
reguladoras (IL-10).
Las bifidobacterias objeto de la invención
poseen actividades metabólicas (por ejemplo: fosfatasa, esterasa,
lipasa, galactosidasa, glucosidasa y
N-acetil-glucosaminidasa) que
favorecen la digestión de nutrientes y mejoran el síndrome de
malabsorción y desnutrición propio de pacientes celíacos.
La cepa objeto de la presente invención poseen
capacidad de adhesión a mucina (1-4%) y es estable
en las condiciones de estrés gastrointestinal (pH ácido y alta
concentración de bilis; Ejemplo 5, Tabla 6 y Tabla 7) y en las
condiciones de los procesos tecnológicos de conservación y
elaboración de alimentos (refrigeración, liofilización,
fermentación, etc.). In vivo es capaz de sobrevivir el
tránsito intestinal en humanos tras su administración por vía oral.
Todas estas propiedades garantizan su persistencia y efectividad
prolongada en el intestino y su uso como probióticos y simbióticos
(combinaciones de pro y pre-bióticos). También
garantizan su uso en forma de alimentos funcionales, alimentos
nuevos, suplementos, nutracéuticos, y fármacos para la reducción de
riesgos y mejora del estado de salud y calidad de vida de los
sujetos con enfermedad celíaca así como el de otros trastornos
asociados a la ingesta de
gluten.
gluten.
\vskip1.000000\baselineskip
El objeto de la presente invención es un
microorganismo útil para la producción de formulaciones que reduzcan
los riesgos y mejoren el estado de salud de sujetos que padecen o
son susceptibles de padecer desórdenes relacionados con la ingesta
de gluten mediante diversos mecanismos de acción, caracterizado por
ser un microorganismo no modificado genéticamente, aislado y
seleccionado de la flora intestinal natural de individuos sanos por
sus propiedades antiinflamatorias y reguladoras, en adelante
microorganismo objeto de la presente invención.
Sus múltiples mecanismos de acción incluyen por
ejemplo, y sin que limite el alcance de la invención: (i) la
regulación de la respuesta inmunológica innata y adaptativa
ocasionada por los péptidos tóxicos e inmunogénicos del gluten; (ii)
la reducción de la concentración de epitopos tóxicos en la luz
intestinal mediante el transporte e hidrólisis de los péptidos del
gluten; (iii) el fortalecimiento de la función barrera defensiva
frente a bacterias pro-inflamatorias y con factores
de virulencia aisladas del tracto gastrointestinal de los pacientes
celíacos, y (iv) el aporte de actividades enzimáticas, adicionales a
las peptidasas, que favorecen la digestión y aporte de nutrientes en
síndromes de malabsorción típicos de estos pacientes. Este
microorganismo podría ejercer efectos beneficiosos adicionales a los
mencionados, de manera ilustrativa y sin que limite el alcance de la
invención, reduciendo el estrés oxidativo asociado a la inflamación,
regulando la permeabilidad intestinal, favoreciendo la colonización
de bacterias beneficiosas Gram-positivas con
funciones protectoras, regulando la función de células presentadoras
de antígenos, inhibiendo la interacción de los péptidos tóxicos con
las células epiteliales e inmunocompententes del hospedador,
interaccionando con las metaloproteasas, regulando el ciclo celular
y la apoptosis, regulando el crecimiento y la diferenciación celular
y regulando las funciones neuroendocrinas. (De Stefano et
al., 2007. Lycopene, quercetin and tyrosol prevent macrophage
activation induced by gliadin and IFN-gamma.Eur J
Pharmacol. 2;566 (1-3):192-9; Silano
et al., 2007. A decapeptide from durum wheat prevents celiac
peripheral blood lymphocytes from activation by gliadin peptides.
Pediatr Res. 61(1):67-71; Gross et al.
2007. Role of neuropeptides in inflammatory bowel disease. Inflamm
Bowel Dis.
3(7):918-32).
3(7):918-32).
El microorganismo objeto de la presente
invención consiste esencialmente en cepas pertenecientes al género
Bifidobacterium. Las ventajas de las bifidobacterias específicamente
seleccionadas para la formulación de alimentos, alimentos nuevos,
probióticos, simbióticos, suplementos, nutracéuticos, y
formulaciones farmacéuticas para el tratamiento de la enfermedad
celiaca y los desórdenes asociados son múltiples. Las
bifidobacterias tienen una habilidad especial para colonizar el
tracto intestinal de los recién nacidos, contribuyendo de forma
significativa al desarrollo de sus defensas (inmunológicas y de
otra naturaleza) y a la tolerancia oral a los anfígenos de la dieta
tal y como se ha puesto de manifiesto en estudios realizados por
ejemplo con Bifidobacterium breve UCC2003 (Fujii et al.,
2006. Bifidobacterium breve enhances transforming growth factor
betal signalling by regulating Smad7 expression in preterm infants.
J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006
Jul;43(1):83-8), con Bifidobacterium
longum BB536 (Iwabuchi et al., 2007. In vitro Th1
cytokine-independent Th2 suppressive effects of
bifidobacteria. Microbiol Immunol. 2007;51
(7):649-60); así como con otras especies y distintas
cepas de la misma especie de este género (Young et al. 2004.
Bifidobacterial species differentially affect expression of cell
surface markers and cytokines of dendritic cells harvested from cord
blood. Clin Diagn Lab
Immunol.11(4):686-90).
Este grupo bacteriano es uno de los
constituyentes mayoritarios de la microbiota intestinal en los
primeros años de vida favorecido por la lactancia materna
(representando hasta el 91%; (Harmsen, et al. 2000. Analysis
of intestinal flora development in breast-feed and
formula-feed infants by using molecular
identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol.
Nutr. 30: 61-67; Biavati, et al. 2001. The
family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.), The
Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, Nueva York). A su
vez, la lactancia materna ejerce un efecto protector frente al
desarrollo de la enfermedad celíaca en la infancia que puede estar
asociado con la protección ejercida por las bifidobacterias
intestinales frente al desarrollo de otras enfermedades de base
inmunológica; como por ejemplo las enfermedades atópicas, cuya
incidencia se ha asociado a una reducción en la población de
bifidobacterias (Kalliomäki et al., 2001. Distinct patterns
of neonatal gut microflora in infants in whom atopy was and was not
developing.J Allergy Clin Immunol. 107:129-34). Los
integrantes de este género poseen una maquinaria enzimática
especialmente adaptada para co-existir en intestino
aportando nutrientes esenciales al hospedador (Klijn et al.
2005. Lessons from the genomes of bifidobacteria. FEMS Microbiol
Rev. 29:491-509). Asimismo, las cepas del género
Bifidobacterium se consideran globalmente inductoras de respuestas
inmunológicas reguladoras, con un carácter menos
pro-inflamatorio que los lactobacilos y otras
bacterias comensales (Zeuthen et al. 2006. Lactic acid
bacteria inducing a weak interleukin-12 and tumor
necrosis factor alpha response in human dendritic cells inhibit
strongly stimulating lactic acid bacteria but act synergistically
with gram-negative bacteria. Clin Vaccine Immunol.
13 (3):365-75.). La administración de
bifidobacterias también regula la permeabilidad del epitelio
intestinal reduciendo las posibilidades de acceso de patógenos y
antígenos de la dieta, según se ha visto en trabajos realizados por
ejemplo con niños prematuros alimentados con fórmulas infantiles
suplementadas con Bifidobacterium lactis: la incorporación de
esta bifidobacteria contribuyó a reducir significativamente la
permeabilidad intestinal (Stratiki et al., 2007, The effect
of a bifidobacter supplemented bovine milk on intestinal
permeability of preterm infants.Early Hum Dev.
83(9):575-9).
83(9):575-9).
Las evidencias anteriormente expuestas, ponen de
manifiesto la importancia del género Bifidobacterium para el
adecuado funcionamiento de la fisiología intestinal incluyendo los
procesos digestivos y defensivos (inmunológicos y no inmunológicos)
involucrados en la tolerancia (ausencia de respuesta patológica) a
las proteínas del gluten, o lo que es lo mismo, cómo estas bacterias
pueden evitar el desarrollo de trastornos asociados a la ingesta de
gluten, cuestión que resulta generalizable a las diferentes especies
y cepas del género Bifidobacterium.
Un objeto particular de la presente invención
consiste en que el microorganismo pertenece a la especie
Bifidobacterium longum. Como ejemplo, y sin que limite el
alcance de la invención, la cepa ha sido aislada a partir de heces
de lactantes sanos e identificadas por secuenciación del gen del
ARNr 16S (Ejemplo 6). El fragmento secuenciado (1437 bases) se
amplificó por PCR utilizando los cebadores 27f y 1401r y para la
secuenciación se emplearon además los cebadores 530f y
U-968f de acuerdo con los procedimientos descritos
por otros autores (Satokari et al., 2001. Bifidobacterial
Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific
PCR and Denaturating Gradient Gel Electro-
phoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Molecular Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-226). Mediante el alineamiento de la secuencia obtenida con las existentes en las bases de datos (GenBank) se detectó máxima similitud con las secuencias equivalentes de 14 cepas distintas de la especie B. longum y entre ellas Bifidobacterium longum BG3 (número de acceso
AY735403.1).
phoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Molecular Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-226). Mediante el alineamiento de la secuencia obtenida con las existentes en las bases de datos (GenBank) se detectó máxima similitud con las secuencias equivalentes de 14 cepas distintas de la especie B. longum y entre ellas Bifidobacterium longum BG3 (número de acceso
AY735403.1).
De esta manera se evidencia que B. longum
presenta propiedades idóneas para la aplicación del objeto de la
invención de manera análoga a como otras cepas de este género y
especie podrían hacerlo, ejerciendo los mismos efectos beneficiosos
en individuos con trastornos asociados a la ingesta de gluten.
En otro objeto particular de la presente
invención el microorganismo objeto de la presente invención se
caracteriza por ser una cepa de bacteria que pertenece a la especie
Bifidobacterium longum (IATA-ES1) Un cultivo
de Bifidobacterium IATA-ES1 ha sido depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjassot
(Valencia), el día 20 de diciembre de 2007, correspondiéndole el
número de depósito CECT 7347. Esta cepa pertenece a la especie B.
longum de acuerdo con la homología de la secuencia del gen del
ARNr 16S con otras actualmente disponibles en las bases de datos
(GenBank), como se describe en el ejemplo 6. Ésta constituye un
ejemplo, a modo ilustrativo sin que limite el alcance de la
invención, de una cepa del género Bifidobacterium que posee las
propiedades y aplicaciones objeto de la presente invención, lo que
se puede hacer extensivo a otras cepas y especies de este
género.
género.
Otro objeto adicional lo constituye el
microorganismo de la presente invención caracterizado porque se
puede combinar con otros microorganismos para mejorar sus
propiedades protectoras y metabólicas mediante acciones sinérgicas o
complementarias, como el aumento de la síntesis total de citoquinas
reguladoras y sus tipos, el aumento de la capacidad inhibitoria
frente a bacterias patógenas, y el aumento del aporte de peptidasas
y otras enzimas que favorezcan la digestión incrementando su
concentración total o aumentando su tipo y especificidad.
Otro objeto de la presente invención comprende
la combinación de bifidobacterias con otros microorganismos, de
forma complementaria y/o sinérgica, favoreciendo las respuestas
inmunoreguladoras y la degradación de péptidos tóxicos e
inmunogénicos del gluten. Como ejemplo de microorganismos, la cepa
Bifidobacterium longum ATCC 15707 puede reforzar el efecto
inmunomodulador de la cepa Bifidobacterium
IATA-ES1 debido a su alta capacidad para inducir la
síntesis de IL-10 como se demuestra en la tabla 1
(Ejemplo 1); esta acción complementaría además la de la inducción de
TGF-\beta sólo producida por la segunda cepa
(Tabla 1, ejemplo 1). Por otro lado, la cepa Lactoccocus
lactis NCD0712 puede complementar e intensificar la degradación
de los péptidos del gluten debida a las bifidobacterias y así
reducir la concentración de epitopos tóxicos del gluten y sus daños
intestinales y extraintestinales debido a que posee, además de
peptidasas intracelulares, actividad proteolítica extracelular. La
intensificación de la actividad proteolítica se demuestra en el
ejemplo 2 y en la figura 1, en la que se puede apreciar una
desaparición casi total de las bandas de proteína tras la incubación
conjunta de los digeridos de gliadinas con suspensiones celulares de
Bifidobacterium IATA-ES1 y Lactoccocus
lactis NCD0712 (Figura 1, panel B, carreras 3 y 4). Esta
hidrólisis fue superior a la obtenida sólo con la cepa
Bifidobacterium IATA-ES1 (Figura 1, panel A
carreras 3 y 4).
Otro objeto particular de la presente invención
consiste en la utilización del microorganismo objeto de la presente
invención así como de sus equivalentes no viables inactivados por
distintos procedimientos (congelación, calor, radiación, etc.) con
fines inmunomoduladores.
El microorganismo no viable inactivado por
distintos procedimientos (congelación, calor, radiación, etc.) sigue
pudiéndose utilizar con fines inmunomoduladores. Los efectos
inmunomoduladores de las bifidobacterias son ejercidos, al menos en
parte, por constituyentes estructurales (ADN, componentes de la
pared celular, etc.). Esto hace posible que las bifidobacterias
mantengan parte de sus propiedades inmunomoduladoras sin que
mantengan necesariamente la viabilidad (Lammers et al., 2003.
Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA:
IL-1 and IL-10 response in human
peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 38:
165-72). Así, en el ejemplo 3 y en la tabla 3, se
demuestra que suspensiones celulares de la cepa
Bifidobacterium IATA-ES1, inactivadada
mediante ciclos de congelación y descongelación, pueden modular la
respuesta proinflamatoria desencadenada por las gliadinas cuando se
con-incuban con células mononucleares de sangre
periférica, reduciendo la síntesis de citoquinas
pro-inflamatorias (por ejemplo
IFN-\gamma) y aumentando la síntesis de citoquinas
reguladoras (por ejemplo
IL-10).
IL-10).
Además, los compuestos estructurales,
resultantes del metabolismo, moléculas secretadas del microorganismo
objeto de la presente invención, obtenidos por técnicas que pueden
ser llevados a cabo por un experto medio del área y combinaciones de
los mismos, pueden ser también utilizables. Por ejemplo técnicas
físico-químicas y biotecnológicas entre las que se
encuentran la centrifugación, filtración, liofilización,
precipitación, sonicación, disrupción celular mecánica y química,
extracción de compuestos a partir de cultivos con enzimas y/o
agentes químicos, la separación por técnicas cromatografías a partir
del microorganismo objeto de la presente invención y la clonación de
los genes que codifican dichos compuestos y su
sobre-expresión.
En el ejemplo 1 y tabla 1 se demuestra que los
componentes estructurales que forman parte de la envoltura celular
de las bifidobacterias son responsables al menos en parte de la
inducción de la producción de citoquinas reguladoras
(IL-10 e TGF-\beta). En el ejemplo
3 y tabla 3 en el que se han co-incubado digeridos
de gliadinas y suspensiones de células no viables de la cepa
Bifidobacterium IATA-ES1 se demuestra también
que componentes estructurales de estas células son capaces de
reducir la respuesta pro-inflamatoria ocasionada por
las gliadinas y de aumentar la síntesis de citoquinas reguladoras
(IL-10). Asimismo, componentes estructurales,
metabolitos y sustancias secretadas por la cepa
Bifidobacterium IATA-ES1 ejercen un efecto
inhibidor sobre el crecimiento de patógenos aislados de celíacos,
tal y como se demuestra en el ejemplo 4 y tabla 4. En dicho ejemplo
se ha evaluado el efecto inhibidor de cultivos celulares de esta
cepa mediante la técnica de la doble capa en la que tanto las
células como los metabolitos y productos secretados se ponen en
contacto con el microorganismo patógeno, de modo que los efectos
inhibidores pueden deberse a la acción sinérgica de todos estos
componentes. Además, se ha evaluado el efecto inhibidor de los
metabolitos y compuestos secretados por la bifidobacteria al medio
de cultivo utilizando como agente inhibidor los sobrenadantes de
cultivo libres de células, previamente liofilizados. Así, se ha
demostrado que los compuestos liberados al medio de cultivo ejercen
un efecto inhibidor frente a patógenos aislados de celíacos (Tabla
5).
En una realización particular de la presente
invención, el microorganismo, sus componentes celulares, compuestos
resultantes de su metabolismo, moléculas secretadas y sus
combinaciones se caracterizan porque actúan sobre la regulación de
la respuesta inmunológica innata y adaptativa causada por los
péptidos nocivos del gluten.
La cepa ES1 de la presente invención se ha
seleccionado por sus propiedades inmunomoduladoras deseables para
regular las respuestas pro-inflamatorias de tipo Th1
características de la enfermedad celíaca y enfermedades asociadas
(el síndrome de Down, la diabetes mellitus tipo 1, la dermatitis
herpetiforme, la miopatía, la esclerosis múltiple, la artritis, el
autismo, la esquizofrenia, la depresión, los linfomas y la ataxia),
así como de las reacciones alérgicas de tipo Th2 que pueden
originarse como consecuencia de la ingesta de proteínas de trigo y
otros cereales. Las cepas se caracterizan por inducir baja
producción de la citoquina Th1 IFN-\gamma (por
ejemplo <100 pm/ml) y de la citoquina
pro-inflamatoria IL-1 (por ejemplo
<150 pm/ml) y alta producción de las citoquinas reguladoras IL10
(por ejemplo > 800 pm/ml) y TGF-\beta (por
ejemplo >50 pmol/m) en células mononucleares de sangre periférica
(PBMCs; Ejemplo 1, Tabla 1). El perfil de citoquinas inducido por
estas bifidobacterias no es una característica común a todas las
bifidobacterias y bacterias lácticas intestinales humanas (Ejemplo
1, Tabla 1) y la hace especialmente idónea para modular la anómala
respuesta inmune que originan las proteínas del trigo en individuos
predispuestos y pacientes con enfermedad activa. La detección de
estos efectos inmunomoduladores mediante el uso de suspensiones
celulares de la cepa seleccionada como estimulante en estos ensayos
(Ejemplo 1 y tabla 1) indican que los componentes estructurales que
forman parte de la envoltura celular de esta bifidobacteria son
responsables al menos en parte de los mismos, incluyendo la
inducción de la producción de citoquinas reguladoras
(IL-10 e TGF-\beta) que pueden
reducir los efectos tóxicos e inmunogénicos de los péptidos del
gluten. Además, en el ejemplo 3 y tabla 3 se demuestra que el uso de
suspensiones celulares de la cepa Bifidobacterium
IATA-ES1 no viables (inactivadas por ciclos de
congelación-descongelación)
co-incubadas con digeridos de gliadinas son capaces
de reducir la síntesis de citoquinas
pro-inflamatorias (por ejemplo
INF-\gamma e IL-15) ocasionada por
las gliadinas y de aumentar la síntesis de citoquinas reguladoras
(por ejemplo INF IL-10). Por tanto, se demuestra que
componentes estructurales de las células de la bifidobacteria pueden
regular las respuestas inmunológicas anómalas ocasionadas por el
gluten, sin que sea estrictamente necesario el mantenimiento de la
viabilidad de la bacteria.
El microorganismo objeto de la presente
invención, sus componentes celulares, compuestos resultantes de su
metabolismo, moléculas secretadas y sus combinaciones se
caracterizan porque actúan sobre el fortalecimiento de la función
barrera defensiva frente a bacterias perjudiciales, por ejemplo
pro-inflamatorias y con factores de virulencia,
aisladas del tracto gastrointestinal de los pacientes celíacos.
Las cepas seleccionadas son capaces de inhibir
bacterias con potencial patogénico y tóxico aisladas del intestino
de individuos celíacos (Ejemplo 4, Tablas 4 y 5). Dichos patógenos
incluyen, entre otros, cepas de Escherichia coli que
codifican factores de patogenicidad (por ejemplo fimbrias) y
pertenecen a grupos filogenéticos virulentos (por ejemplo el B2),
cepas de Bacteroides y de otros géneros productores de
metaloproteasas que contribuyen a la lesión tisular, y cepas
hemolíticas aisladas de biopsias duodenales. En el ejemplo 4 y tabla
4 se demuestra el efecto inhibidor de cultivos celulares totales de
esta cepa frente a patógenos aislados de celíacos por la técnica de
la doble capa, de modo que estos efectos pueden ser debidos a
componentes estructurales, metabolitos y sustancias secretadas por
la cepa Bifidobacterium IATA-ES1. En la tabla 5, se
muestra además el efecto inhibidor de los sobrenadantes libres de
células de los cultivos de esta cepa que contienen sólo los
metabolitos y compuestos secretados por la bifidobacteria a este
medio. En ambos casos los halos de inhibición obtenidos con la cepa
seleccionada son mayores a los obtenidos con otras cepas utilizadas
con fines comparativos. Así, la cepa objeto de la patente puede
contribuir al restablecimiento del ecosistema intestinal y reducir
la carga antigénica de origen microbiano que favorecería el proceso
inflamatorio y aumentaría la permeabilidad del epitelio. Asimismo,
la cepa seleccionada es capaz de inhibir la síntesis de citoquinas
pro-inflamatorias (por ejemplo
IFN-\gamma y TNF-\alpha)
estimulada por la microbiota intestinal de individuos celíacos en
células mononucleares de sangre periférica. Por ejemplo,
concentraciones de IFN-\gamma de 90,8 y de
TNF-\alpha de 1966,3 pmol/ml producidas por PBMCs
bajo la estimulación de la microbiota de celíacos pueden ser
reducidos a valores de 8,2 pmol/ml y 295,2, respectivamente, en
presencia de Bifidobacterium IATA-H1. Esta cepa
también es capaz de estimular la síntesis de citoquinas reguladoras
(IL-10), reducida por el contrario por la microbiota
intestina de pacientes celíacos. Así, por ejemplo valores de
IL-10 de 49,3 pmol/ml inducidos por la microbiota de
celíacos pueden verse incrementados hasta valores de 107,5 pmol/ml
por estimulación de la cepa Bifidobacterium IATA-H1.
A través de este mecanismo inmunomodulador la cepa seleccionada
pueden contribuir a restablecer el equilibrio intestinal y evitar la
sobre estimulación provocada por la microbiota perjudicial que junto
a la ocasionada por el gluten puede contribuir a que se desencadene
un circulo vicioso, que perpetúe la inflamación.
\newpage
En otra forma particular de realización de la
presente invención el microorganismo se caracteriza por ser capaz de
transportar los péptidos del gluten resultantes de la digestión
gastrointestinal, reduciendo la concentración de epitopos
nocivos.
La cepa IATA-ES1 posee capacidad
para captar los péptidos tóxicos derivados de la digestión
gastrointesntinal de las gliadinas, tanto los productos resultantes
de la digestión gástrica por acción de la pepsina (P), como
intestinal por acción de la tripsina (T) y pancreatina (X) (Ejemplo
2, Figura 1). La incubación de las gliadinas en presencia de
bacterias viables de las cepas seleccionadas reduce su concentración
y la presencia de epitopos tóxicos determinados con el anticuerpo R5
por ELISA sándwich y por tanto sus posibles efectos nocivos en el
intestino y a nivel extraintestinal. Por ejemplo, la concentración
de eptiopos tóxicos de un digerido de gliadinas con pepsina tripsina
y pancreatina (como se indica en el Ejemplo 2) de 234 9 ppm de
gluten determinados por ELISA sándwich fue reducida a 169 pmm de
gluten tras ser incubado con suspensiones celulares de la cepa
Bifidobacterium IATA-ES1. La capacidad de las cepas
seleccionadas para captar los oligopéptidos derivados de la
digestión de las gliadinas se reproduce en condiciones intestinales
y en presencia de sales biliares. Esta capacidad se ponencia
mediante la co-incubación con Lactococcus
lactis NCD0712 que, pese a que no llega a colonizar el intestino
grueso, puede actuar como coadyuvante en las primeras etapas de la
hidrólisis del gluten ingerido por acción de su proteasa anclada a
la pared y otras peptidasas (Ejemplo 2, figura 1). La
intensificación de la actividad proteolítica por acción de
Lactoccocus lactis NCD0712 se demuestra en la figura 1 en la
que se puede apreciar una desaparición casi total de las bandas de
proteína tras la incubación conjunta de de los digeridos de
gliadinas con suspensiones celulares de Bifidobacterium
IATA-ES1 y Lactoccocus lactis NCD0712 (Figura
1, panel B, carreras 3 y 4). Esta hidrólisis fue superior a la
obtenida sólo con la cepa Bifidobacterium
IATA-ES1 (Figura 1, panel A carreras 3 y 4). También
puede potenciarse la actividad de las bifidobacterias sobre el
gluten mediante su co-incubación con proteasas y
peptidasas de Lactococcus lactis NCD0712 en forma de
extractos.
extractos.
La cepa seleccionada Bifidobacterium
IATA-ES1 puede modular la respuesta inmunológica
anormal ocasionada por la interacción de los péptidos tóxicos del
gluten con las células inmunocompententes del individuo no sólo
mediante el metabolismo de los péptidos que actúan como antígenos
nocivos sino también mediante mecanismos de inmunoregulación
(Ejemplo 3, Tabla 3). Las suspensiones bacterianas viables o
inactivadas de las cepas seleccionadas con-incubadas
con PBMCs en presencia de digeridos gastrointestinales de gliadinas
son capaces de contrarrestar el efecto proinflamatorio de estas
proteínas en distintas fases de la digestión, por acción de la
pepsina (P) gástrica y de la tripsina (T) y pancreatina (X)
intestinales. Esta cepa es capaz de inducir la reducción de la
producción del IFN-\gamma, de las citoquinas
pro-inflamatorias IL-1 e
IL-8 IL15 y responsables de la respuesta innata, así
como de aumentar la síntesis de la citoquina reguladora
IL-10 (Ejemplo 3, Tabla 3). Estos efectos son
debidos al menos en parte a la inhibición de las distintas
subunidades del factor nuclear (NF) \kappaB, p50, p65 (RelA),
c-Rel y Rel B determinadas mediante un ensayo ELISA
(Trans AM NF\kappaB, Active Motive, Bélgica). La inhibición de
este factor transcripcional supone la inhibición de la expresión de
un gran número de genes pro-inflamatorios
constituyendo un punto clave de control de los procesos de
inflamación y específicamente del que se produce en la enfermedad
celíaca (Jelínková et al., 2004. Gliadin stimulates human
monocytes to production of IL-8 and
TNF-alpha through a mechanism involving
NF-kappaB. FEBS Lett.
571(1-3):81-5).
E1 microorganismo objeto de la presente
invención, sus componentes celulares junto a los compuestos
resultantes de su metabolismo, moléculas secretadas y sus
combinaciones se caracterizan por ser capaces de hidrolizar los
péptidos del gluten mediante su actividad peptidásica, reduciendo la
concentración de epitopos nocivos.
La cepa seleccionada posee peptidasas de amplia
especificidad y con especificidad por sustratos que contienen
prolina, que son muy abundantes en las gliadinas y limitan su
hidrólisis por enzimas convencionales (Ejemplo 2, Tabla 2).
Concretamente, la cepa seleccionada Bifidobacterium
IATA-ES1 es una de las que posee mayor actividad
iminopeptidasíca (>300 U/mg proteína); asimismo, presentan
actividad prolil-endopeptidasas (>8 U/mg
proteína),
X-prolil-dipeptidil-peptidasa
(>15 U/mg proteína), prolidasa y prolinasa (>15 U/mg)
proteína. También poseen actividad tripeptidásica (>130 U/mg
proteína frente al sustrato
Gleu-Gly-Gly) y
leucil-aminopeptidásica (>70 U/mg proteína). La
actividad de esta cepa frente a sustratos que contienen prolina,
como Pro-pNA, es superior a la detectada en otras
bacterias lácticas y especialmente el cociente de actividad
Pro-pNA/Leu-pNA (Di Cagno et
al. 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours
and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue
patients. Appl Environ Microbiol. 70:1088-96; De
Angelis et al. 2006. VSL#3 probiotic preparation has the
capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for Celiac
Sprue. Biochim Biophys Acta. 2006
1762(1):80-93), lo que favorece la hidrólisis
específica de los péptidos del gluten que poseen un alto contenido
en prolina.
El microorganismo objeto de la presente
invención, sus componentes celulares, compuestos resultantes de su
metabolismo, moléculas secretadas y sus combinaciones posee
actividad metabólica adicionales a las peptidasas (por ejemplo:
fosfatasa, esterasa, lipasa, galactosidasa, glucosidasa y
N-acetil-glucosaminidasa) que ayudan
a digerir los nutrientes que ingerimos con la dieta, y mejoran el
síndrome de malabsorción y desnutrición propio de pacientes
celíaco.
Finalmente, otra realización particular es el
uso del microorganismo de la presente invención, sus componentes
celulares, compuestos resultantes de su metabolismo, moléculas
secretadas y sus combinaciones y la combinación con otros
microorganismos, en la producción de formulaciones para la reducción
de riesgos y mejora del estado de salud de pacientes con
enfermedades relacionadas con la ingesta de gluten.
Las formulaciones elaboradas mediante el
microorganismo objeto de la presente invención puede desarrollarse
industrialmente dando lugar a, entre otras y sin que limite el
alcance de la invención, diferentes formas de presentación al
consumidor: alimentos, alimentos nuevos suplementos, nutracéuticos,
composiciones farmacéuticas, probióticos y/o simbióticos.
La cepa Bifidobacteirum IATA-ES1
posee capacidad de adhesión (1-4%) a mucina y es
resistente al pH ácido del estómago (2,0; 2,5 y 3,0) ya las altas
concentraciones de sales biliares (0,5; 1,0; 2,0; y 3,0%) presentes
en el intestino delgado, que constituyen las principales barreras
biológicas que limitan la supervivencia de los probióticos a su paso
por el tracto gastrointestinal así como durante los procesos de
fermentación de alimentos y su período de almacenamiento (Ejemplo 5,
Tabla 6). Por ejemplo, esta cepa mantiene una viabilidad y capacidad
de crecimiento del 56-86% tras 90 min de incubación
a pH 2.0-2.5. Por lo tanto, esta cepa cuenta con
mayores posibilidades de sobrevivir y ser funcionales que otros
aislados y así como algunos probióticos actualmente comercializadas
como se observa en la Tabla 6. Esta cepa además resiste el tránsito
gastrointestinal in vivo. Tras su administración en forma de
leche fermentada durante 4 semanas a dosis de
107-108 ufc/ml en dos tomas diarias se recupera en
heces y su concentración respecto a la inicial (sin ingestión de
productos probióticos) aumenta al menos en 1 unidad logarítmica. Las
bifidobacterias seleccionadas crecen y se mantienen viables en
diversos alimentos y bebidas, constituyendo vehículos idóneos para
su aporte. Por ejemplo, son capaces de fermentar y coagular la
leche, podrían ser utilizadas para la elaboración de leches
fermentadas y otros derivados lácteos. También resisten los
tratamientos tecnológicos de producción y conservación de alimentos,
suplementos y formulaciones farmacéuticas, como por ejemplo la
liofilización y las temperaturas de refrigeración, lo que garantiza
su explotación industrial.
Un objeto particular de la presente invención
comprende el uso del microorganismo de la presente invención en la
elaboración de formulaciones en forma de un alimento.
De esta manera el microorganismo objeto de la
presente invención, formaría parte de un alimento formulado para
aportar, más allá de su valor nutricional habitual, un efecto
beneficioso sobre la reducción de riesgos y mejora del estado de
salud de pacientes con enfermedades relacionadas con la ingesta de
gluten.
Otro objeto particular de la presente invención
comprende el uso del microorganismo objeto de la presente invención
en la elaboración de preparados en forma de nutracéuticos. Definidos
como sustancias naturales bioactivas presentadas en una matriz no
alimenticia, que en este caso ejercería efectos beneficiosos en
pacientes con enfermedades relacionadas con la ingesta de gluten,
reduciendo sus riesgos y mejorando su estado de salud.
En el caso del uso del microorganismo objeto de
la presente invención para la obtención de un suplemento dietético o
alimentario, incluiría en su composición el microorganismo o los
compuestos bioactivos derivados del mismo a fin de complementar la
dieta con fines saludables y, en este caso concreto, con el fin de
ejercer efectos beneficiosos sobre los pacientes con enfermedades
relacionadas con la ingesta de gluten, reduciendo sus riesgos y
mejorando su estado de salud.
Otro objeto particular de la presente invención
comprende el uso del microorganismo en la elaboración de preparados
farmacéuticos. De esta forma se utilizaría en la preparación de
composiciones biológicamente activas, capaces de ser utilizadas como
medicamentos ejerciendo un efecto beneficioso sobre la reducción de
riesgos y mejora del estado de salud de pacientes con enfermedades
relacionadas con la ingesta de gluten.
En esta ocasión, el microorganismo objeto de la
presente invención se utilizaría en la preparación de probióticos
y/o simbióticos (combinaciones de probióticos y prebióticos), que
contendrían estos microorganismos vivos o liofilizados, mantendrían
su actividad biológica en el intestino e ingeridos en cantidades
adecuadas ejercerían un efecto beneficiosos sobre los individuos con
enfermedades relacionadas con la ingesta de gluten, reduciendo sus
riesgos y mejorando su estado de salud.
Un último objeto particular de la presente
invención sería su uso como nuevo alimento. Entendiendo como tal
cualquier alimento o ingrediente que no se haya usado de forma
habitual para consumo humano en la Unión Europea a partir del 15 de
mayo de 1997, que ejercería efectos beneficiosos en pacientes con
enfermedades relacionadas con la ingesta de gluten, reduciendo sus
riesgos y mejorando su estado de salud.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Análisis del perfil de proteínas de
las diferentes digestiones de gliadinas por
SDS-PAGE. Panel A: 1) control de gliadinas tras la
digestión con pepsina (G-P); 2) control de gliadinas
tras la digestión con pepsina y tripsina
(G-P-T); 3) G-P
incubadas con Bifidobacterium IATA-ES1; 4)
G-P-T incubadas con
Bifidobacterium IATA-ES1. Panel B: 1) control
G-P; 2) control
G-P-T; 3) G-P
incubadas con Bifidobacterium IATA-ES1 y
Lactococcus lactis NCD0712.; 4)
G-P-T incubadas con
Bifidobacterium IATA-ES1 y Lactococcus
lactis NCD0712.
Las cepas se inocularon en 10 ml de caldo MRS
(Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España) conteniendo un 0.05% de
cisterna (MRS-C) al 1% con un cultivo de 24 h y se
incubaron durante 22 h a 37ºC en anaerobiosis. (AnaeroGen; Oxoid,
Basingstoke, UK). Las células se recogieron por centrifugación
(6,000 g, 15 min), se lavaron dos veces en PBS (10 mM sodium
phosphate, 130 mM sodium chloride, pH 7.4), y se
re-suspendieron en PBS conteniendo un 20% de
glicerol. Alícuotas de estas suspensiones se congelaron con
nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC. El número de viables
tras el ciclo de congelación-descongelación se
determinó mediante recuento en placas de MRSC tras incubar 48 h. La
viabilidad fue superior al 90% en todos los casos. Cada alícuota se
utilizó para un solo ensayo. A fin de evaluar los efectos de
bacterias muertas, algunas de las alícuotas se inactivaron por frío
(3 ciclos de congelación a -20ºC y descongelación) y por calor (30
min a 80ºC). Los valores de pH de los sobrenadantes obtenidos se
ajustaron a 7.2 con NaOH y se esterizaron por filtración
(0.22-\mum tamaño de poro, Millipore, Bedford, MA)
para eliminar la posible presencia de células viables. Alícuotas de
los sobrenadantes libres de células se conservaron a -80ºC hasta su
uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PBMCs se aislaron de sangre periférica de 4
voluntarios sanos (edad media 30 años, intervalo
24-40) en tubos con heparina. El aislamiento de
PBMCs se realizó por centrifugación en gradiente de Ficoll (Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ). Las células se lavaron con medio RPMI
1640 (Cambrex, New York, USA) y se ajustaron a una densidad de 1 x
10^{6} células/ml en medio RPMI 1640 conteniendo además 10% de
suero fetal bovino (Gibco, Barcelona, España), 2 mM de
L-glutamina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100
U/ml penicilina (Sigma). Las PBMCs se incubaron en placas de
poliestireno de fondo plano de 24 pocillos (Corning, Madrid, España)
en presencia o ausencia de agentes estimulantes a 37ºC, al 5% de
CO_{2}, durante 24 h. Como estímulo se utilizaron suspensiones
bacterias vivas y muertas de 1 x 10^{6} CFU/ml, y volúmenes de
sobrenadantes de 150 \mul. Como control positivo se uso
lipopolisacárido (LPS) purificado de E. coli O111:B4 (Sigma,
St. Louis, MO) a una concentración de 1 \mug/ml. Como control
negativo se ensayó la producción de citoquinas en PBMCs no
estimuladas. Cada tipo de estímulo fue ensayado por duplicado en
cada experimento. Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron
por centrifugación, se fraccionaron y se almacenaron en alícuotas a
-20ºC hasta la detección de citoquinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones de citoquinas
(IL-1, IFN-\gamma,
IL-10, y TGF-\beta) de los
sobrenadantes se midieron mediante kits ELISA de Bioscience (BD
Biosciences, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones de la
casa comercial.
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\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de las cepas para hidrolizar las
proteínas y péptidos derivados del gluten se ha llevado a cabo
mediante la cuantificación de la actividad de peptidasas
intracelulares de amplio espectro y específicas para hidrolizar
secuencias peptídicas que contienen prolina, presentes en los
péptidos responsables de las respuestas inmunológicas y tóxicas del
gluten. Las células de cultivos bacterianos de 16-18
horas crecidos en MRSC, se recogieron por centrifugación (9000 x g
por 10 minutos a 4ºC) se lavaron dos veces con tampón Tris 50 mM a
pH 7 y se resuspendieron en el mismo tampón concentrándose 10 veces
respecto al volumen del cultivo inicial. La ruptura de las células
se realizó mecánicamente en un Bead-Beater (Biospec
Products, USA) adicionando 2 volúmenes de bolitas de vidrio por cada
volumen de células y aplicando 2 pulsos de 1,5 minutos. El
sobrenadante obtenido tras centrifugar (8000 g, 10 min) para
eliminar células y fragmentos insolubles se utilizó como extracto
enzimático para los ensayos de actividad. Los sustratos ensayados
fueron los siguientes: Leu-paranitroanilida (-pNA)
para detectar aminopeptidasas de amplia especificidad,
Leu-Leu-Gly para detectar
aminopeptidasas y tripeptidasas de amplia especificidad,
Suc-Ala-Pro-pNA para
detectar prolil-endopeptidasas,
Pro-AMC para detectar iminopeptidasas,
Gly-Pro-AMC para detectar
X-prolil-dipeptidil-peptidasas;
Val-Pro para detectar prolidasas, y
Pro-Gly para detectar prolinasas. En el caso de
sustratos derivados de la paranitroanilida, la mezcla de reacción
consistió en 200 \mul de tampón fosfato 50 mM, a pH 7,2
conteniendo una concentración 0,5 mM del sustrato y 50 \mul del
extracto enzimático. La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante
un máximo de 30 min. La hidrólisis del sustrato y liberación de la
paranitroanilina se monitorizó a 419 nm en un espectrofotómetro (550
Microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). La
hidrólisis de los péptidos se determinó mediante el ensayo de la
L-amino acido oxidasa (Hejgaard, 1978, Rapad assay
to detect peptidases in column effluent fractions using
L-amino acid oxidase. Analytical Biochem 90:
835-839). Se incubaron 100 \mul del tampón de
reacción conteniendo una concentración 0.5 mM con 50 \mul del
extracto enzimático durante 20 min. Tras este período se añadieron
100 \mul del reactivo de la L-amino ácido oxidasa
y tras 5 minutos de incubación se midió la absorbancia a 530 nm. La
concentración de la proteína se midió por el método de Bradford
utilizando el kit comercial de BioRad (Hercules, CA, USA). Una
unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima capaz de
hidrolizar 1 \mumol de sustrato a 37ºC durante 1 minuto. Las
actividades se expresaron en U/mg de proteína.
La capacidad de las cepas para transportar e
hidrolizar los péptidos derivados de la digestión de las gliadinas
se determinó mediante electroforesis. En este caso, las suspensiones
celulares se ajustaron a una densidad óptica de 4 a 655 nm,
equivalente a 10^{9} UFC/ml y se incubaron con tres hidrolizados
distintos de gliadinas a una concentración final de
300-600 \mug/ml en PBS al que se adicionó un 0.2%
de glucosa. Los hidrolizados de gliadinas (Sigma, St. Louis, MO) se
obtuvieron simulando el proceso de digestión gastrointestinal del
siguiente modo: A) 100 g de gliadinas se digirieron en un litro de
HCL 0,2 N (pH: 1,8) con 2 g de pepsina purificada a 37º durante 2 h
(a este hidrolizado se le denominará G-P). B) La
digestión resultante, se digirió con tripsina adicionando 2 g de
tripsina después de ajustar el pH a 8 con NaOH 2N (a este
hidrolizado se le denominará G-P+T. C) El doble
digerido fue luego tratado con 2 g de pancreatina y agitado durante
2 horas a pH 8 (a este hidrolizado se le denominará
G-P+T+x). Tras cada etapa de digestión se centrifugó
a 10,000 g durante 10 min, y se guardó el sobrenadante para los
ensayos siguientes a -20ºC. La inactivación de los digeridos se
realizó mediante incubación a 100ºC durante 30 minutos. Las
suspensiones bacterianas se incubaron en presencia de los tres
hidrolizados de gliadinas (A, B y C) durante 6 horas, a 37ºC, en
anaerobiosis. Los cambios en viabilidad durante las incubaciones se
determinaron utilizando el sistema comercial LIVE/DEAD BacLight Kit
(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) para microscopía
siguiendo las instrucciones del fabricante. El recuento de bacterias
vivas (verdes) y muertas (rojas) se efectuó en un microscopio de
epifluorescencia. BX 51 Olympus microscope (Tokyo, Japan). En todos
los casos se detectaron mínimas pérdidas de viabilidad
(0,0-11,5%) tras la incubación. Tras el período de
incubación se centrifugo para eliminar las células y proteínas
insolubles y los sobrenadantes se esterizaron por filtración
(0.22-\mum tamaño de poro, Millipore, Bedford, MA)
para eliminar la posible presencia de células viables. La capacidad
de las cepas para transportar y utilizar los distintos hidrolizados
de gliadinas se determinó valorando la desaparición de bandas en
geles convencionales de poliacrilamida al 15% y en geles
Tris-Tricine (Ready gels 10-20%
linear gradient, 4% stacking gel, Bio-Rad,
Barcelona, España) para separación de péptidos. Las proteínas se
visualizaron por tinción Coomassie Brilliant Blue
R-250. La reducción de epitopos tóxicos derivada del
transporte y digestión de gliadinas por acción de las bacterias
seleccionadas se evaluó mediante ensayo ELISA sándwich R5 (Centro
Nacional de Biotecnología, Madrid).
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Suspensiones de la cepa seleccionada
(10^{6}-10^{9} UFC/ml), así como otras incluidas
con fines comparativos, fueron incubadas con los distintos
hidrolizados de gliadinas (P, P+T y P+T+P), obtenidos tal y como se
describe en el ejemplo 3, y PBMCs a una concentración de 10^{6}
cfc/ml durante 24 h. Como estímulos control se utilizaron los
distintos hidrolizados de gliadinas sin bacterias y LPS de E.
coli O111:B4. También se detectó la producción basal de
citoquinas sin adicionar ningún estímulo. El procedimiento de
aislamiento de PBMCs, estimulación y detección de citoquinas fue el
descrito en el ejemplo 1.
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La actividad antimicrobiana de las cepas del
género Bifidobacterium seleccionadas previamente en función
de sus propiedades inmunomoduladoras por el procedimiento descrito
en el Ejemplo 1, se determinó mediante dos métodos: (i) por la
técnica de la doble capa y (ii) por la técnica de difusión en
agar.
La actividad antibacteriana de cada cepa se
evaluó globalmente mediante la técnica de la doble capa utilizando
como microorganismos indicadores bacterias aisladas de la flora
intestinal de pacientes celíacos y con potencial patogénico. Las
bifidobacterias se sembraron en placas de MRS-C en
líneas de unos 2 cm y se incubaron en condiciones óptimas durante 16
h y su desarrollo posterior se inhibió con cloroformo. El
microorganismo indicador se inoculó a una concentración de
10^{4}-10^{5} CFU/ml en 10 ml de agar semisólido
adecuado, se vertió sobre la capa de agar del microorganismo
protector y se incubó a 37ºC en anaerobiosis. Tras 24 h se midieron
los halos de inhibición alrededor de las líneas del cultivo de las
bifidobacterias.
A fin de evaluar la actividad antibacteriana
debida a la secreción de compuestos de naturaleza proteica se
utilizó la técnica de difusión en agar. 10 ml de caldo
MRS-C se inocularon al 1% con un cultivo de 24 h de
cada bifidobacteria y se incubaron durante 16 h a 37ºC. Los
sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (12.000 g, 15 min,
4ºC) y se concentraron por liofilización. Los liófilos se
resuspendieron en 1 ml de tampón fosfato 50 mM a pH 6.5, se
neutralizaron con NaOH hasta alcanzar un pH de 6,5 para eliminar los
efectos de los ácidos orgánicos generados por fermentación, y se
esterilizaron por filtración. Estas muestras constituyeron los
extractos crudos en los que se determinó la posible actividad de
proteínas antibacterianas producidas por las bifidobacterias. El
microorganismo indicador se inoculó a una concentración de
10^{4}-10^{5} células/ml en 10 ml de agar
semisólido adecuado y se vertió sobre una capa sólida de agar del
mismo medio. Tras solidificar, se perforaron pocillos de 5 mm, a los
que se añadieron 40 \mul del extracto libre de células y
neutralizado de cada bifidobacteria. Se dejó difundir 4 h a 4ºC y,
posteriormente, se incubó en las condiciones óptimas para el
microorganismo indicador o patógeno. Tras la incubación se midieron
los halos de inhibición alrededor del pocillo.
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La resistencia de las bifidobacterias aisladas a
las condiciones ácidas de los jugos gástricos, que constituyen la
primera barrera biológica que limita la viabilidad de los
probióticos tras su ingestión, se confirmó para cada una de las
cepas recuperadas. Para ello se prepararon suspensiones de células
(10^{8} células/ml) de cada cepa en PBS, conteniendo 3 g/l de
pepsina (Sigma, St. Louis, MO) y ajustada a pH 2 con HCl y se
incubaron a 37ºC durante un total de 120 min. A distintos tiempos
(0, 90 y 120 min), incluyendo el tiempo medio de vaciado gástrico
(90 min), se tomaron alícuotas para determinar la viabilidad
mediante recuentos en placas de agar MRS-C.
Posteriormente se estudió la tolerancia de las cepas resistentes al
pH ácido a otras condiciones de estrés, como la bilis, el NaCl y las
altas temperaturas. Para conocer la tolerancia de las cepas objeto
de estudio a la bilis, se evaluó su capacidad para crecer en
MRS-C, al que se adicionaron diversas
concentraciones (0,5-1,5%) de
Ox-gall (Sigma, St. Louis, MO). Alícuotas de 200
\mul de cada medio, inoculadas al 1% con cultivos de 24 h, se
cargaron en placas multipocillo y se incubaron a 37ºC. El
crecimiento se monitorizó mediante medidas de absorbancia a 655 nm
en un espectrofotómetro 550 Microplate Reader
(Bio-Rad, Hercules, CA).
Se procedió al aislamiento de cepas del género
Bifidobacterium a partir de heces de lactantes sanos que no
hubieran ingerido alimentos que contuvieran bifidobacterias durante
al menos el mes anterior al análisis y que no hubieran sido
sometidos a tratamientos con antibióticos. Las muestras se
mantuvieron a 4ºC y se analizaron sin que transcurrieran más de dos
horas desde su recogida. Dos gramos de cada una de ellas se
diluyeron en tampón fosfato 10 mM conteniendo una concentración de
NaCl 130 mM (PBS) y se homogeneizaron en un stomacher
Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres, UK),
durante 3 min y se diluyeron en agua de peptona. Alícuotas de 0,1 ml
de diversas diluciones decimales se inocularon en MRS agar (de Man
Rogosa and Sharpe; Scharlau, Barcelona) conteniendo un 0,05% de
cisteína (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), y 80
\mug/ml de mupirocina. Tras una incubación de 48 h a 37ºC en
condiciones de anaerobiosis (AnaeroGen, Oxoid, UK) se seleccionaron
colonias aisladas y su identidad se confirmó por estudio de su
morfología bajo tinción de Gram. La identidad de los aislados se
confirmó mediante PCR específica de género, de acuerdo con la
metodología descrita por Kaufman et al. (1997, Identification
and quantification of Bifidobacterium species isolated from
food with genus-specific 16S
rRNA-targeted probes by colony hybridization and
PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273),
utilizando los cebadores (LM26 y LM3) que amplifican un fragmento de
1,35 kb del gen del ARN ribosómico 16S. Además, se secuenció el gen
del ARN 16S a partir de ADN total. El fragmento secuenciado se
amplificó utilizando los cebadores 27f y 1401r y se purificó
utilizando el sistema comercial GFX™PCR (Amershan, Bioscience, UK).
Para la secuenciación se emplearon además los cebadores 530f y
U-968f de acuerdo con los procedimiento descritos
por otros autores (Jonson, 1994. Similarity analysis of rRNAs. In
Methods for General and Molecular Bacteriology; Gerhard, P.; Murray,
R. G.E.; Wood, W.A.; Krieg, N.R., Eds. American Society for
Microbiology, Washington, DC. Pp 683-700; Satokari
et al., 2001. Bifidobacterial Diversity in Human Feces
Detected by Genus-Specific PCR and Denaturating
Gradient Gel Electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67,
504-513; Favier et al. 2002. Molecular
Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates.
Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-22). La
secuenciación se realizó utilizando un secuenciador automático de
ADN ABI 3700 (Applied Biosystem, Foster City, CA). La búsqueda de
secuencias más próximamente relacionadas se realizó en la base de
datos GenBank utilizando el algoritmo BLAST (Altschul et al.,
1990. Basic local alignment search tool. J. Mol Biol. 215,
403-410).
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Microorganismos para la reducción de
riesgos y mejora del estado de salud de pacientes con enfermedades
relacionadas con la ingesta de gluten
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1437
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bifidobacterium sp.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (17)
1. Microorganismo perteneciente a la cepa
bacteriana de la especie Bifidobacterium longum con el número
de depósito CECT 7347 útil para la producción de formulaciones que
reduzcan los riesgos y mejoren el estado de salud de sujetos con
desórdenes relacionados con la ingesta de gluten mediante diversos
mecanismos de acción, caracterizado por ser un microorganismo
no modificado genéticamente, aislado y seleccionado de la flora
intestinal natural de individuos sanos por sus propiedades
antiinflamatorias e inmuno-reguladoras.
2. Microorganismo según la reivindicación 1,
caracterizado porque ejerce sus propiedades inmunomoduladoras
tanto en su forma viable como no viable sobre la inmunidad innata y
adaptativa.
3. Combinación de microorganismos
caracterizada porque comprende el microorganismo según las
reivindicaciones 1 ó 2 y otro microorganismo para mejorar sus
propiedades beneficiosas.
4. Combinación de microorganismos según la
reivindicación 3, donde el otro microorganismo es Bifidobacterium
longum ATCC 15707 y/o Lactoccocus lactis NCD0712.
5. Componentes celulares, metabolitos, moléculas
secretadas y sus combinaciones caracterizados porque se
obtienen a partir del microorganismo según las reivindicaciones 1 ó
2 o a partir de la combinación de microorganismos según las
reivindicaciones 3 ó 4 mediante técnicas
físico-químicas y biotecnológicas entre las que se
encuentran la centrifugación, filtración, liofilización,
precipitación, sonicación, disrupción celular mecánica y química,
extracción de compuestos a partir de cultivos con enzimas y/o
agentes químicos, la separación por técnicas cromatografías y la
clonación y sobre expresión de los genes que codifican las moléculas
bioactivas.
6. Microorganismo según las reivindicaciones 1 ó
2, combinación de microorganismos según las reivindicaciones 3 ó 4 o
componentes celulares según la reivindicación 5,
caracterizado porque actúa sobre la regulación de la
respuesta inmunológica innata y adaptativa causada por los péptidos
nocivos del gluten.
7. Microorganismo según las reivindicaciones 1 ó
2, combinación de microorganismos según las reivindicaciones 3 ó 4 o
componentes celulares según la reivindicación 5,
caracterizado porque actúa sobre el fortalecimiento de la
función barrera defensiva frente a bacterias perjudiciales aisladas
del tracto gastrointestinal de los pacientes celíacos.
8. Microorganismo según las reivindicaciones 1 ó
2 o combinación de microorganismos según las reivindicaciones 3 ó 4,
caracterizado por ser capaz de transportar los péptidos del
gluten resultantes de la digestión gastrointestinal, reduciendo la
concentración de epitopos nocivos.
9. Microorganismo según las reivindicaciones 1 ó
2, combinación de microorganismos según las reivindicaciones 3 ó 4 o
componentes celulares según la reivindicación 5,
caracterizado por ser capaz de hidrolizar los péptidos del
gluten mediante su actividad peptidásica, reduciendo la
concentración de epitopos nocivos.
10. Microorganismo según las reivindicaciones 1
ó 2, combinación de microorganismos según las reivindicaciones 3 ó
4 o componentes celulares según la reivindicación 5,
caracterizado porque proporciona actividades enzimáticas
adicionales a las peptidasas, que favorecen la digestión y aporte de
nutrientes en síndromes de malabsorción y desnutrición típicos de
los pacientes celíacos.
11. Uso del microorganismo, de la combinación de
microorganismos o de los componentes celulares según las
reivindicaciones anteriores, en la producción de formulaciones para
la reducción de riesgos y mejora del estado de salud de pacientes
con enfermedades relacionadas con la ingesta de gluten.
12. Uso según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formulación elaborada es un
alimento.
13. Uso según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formulación elaborada es un
nutracéutico.
14. Uso según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formulación elaborada es un
suplemento.
15. Uso según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formulación elaborada es un preparado
farmacéutico.
16. Uso según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formulación elaborada es un
probiótico y/o simbiótico.
17. Uso según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formulación elaborada es un nuevo
alimento.
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