CN114555635A

CN114555635A - 产生丝氨酸蛋白酶抑制剂

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Publication number: CN114555635A
Application number: CN202080047883.5A
Authority: CN
Inventors: S·杜布克斯; M·戈拉德; M·克莱里贝塞姆
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-05-27
Also published as: CA3144522A1; US20220315883A1; BR112021024311A2; JP2022538226A; AU2020300798A1; WO2021001368A1; EP3994164A1

Abstract

果糖二糖或低聚果糖用于增加长双歧杆菌长亚种中蛋白质产生的用途。

Description

产生丝氨酸蛋白酶抑制剂

技术领域

本发明涉及表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细菌、用于增加细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂产量的方法及其用途。

背景技术

谷蛋白相关疾病包括由谷蛋白引发的所有疾病。除了其它病理生理学之外，它们还包括乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症。目前，广谱谷蛋白相关疾病的发生率在全世界范围内正不断增长，尤其就乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症来讲。这两种疾病都是通过摄入谷蛋白引发的。乳糜泻涉及先天性免疫和获得性免疫两者，而非乳糜泻谷蛋白敏感症涉及先天性免疫。

终生食用不含谷蛋白的饮食是用于乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症患者的黄金标准疗法，但是该疗法可能对疾病的肠外表现有一些限制(Sedghizadeh等人，2002年，《口腔外科、口腔医学、口腔病理学、口腔放射学和牙髓病学》，第94卷第4期，第474-478页(Sedghizadeh et al.，2002，Oral Surgery，Oral Medicine，Oral Pathology，OralRadiology，and Endodontology，94(4)，474-478))。已表明，遵循严格不含谷蛋白的饮食是非常困难的，因为从谷物生长到制造加工，低水平交叉污染难以避免并且可能在整个食品生产链中发生(Mitchison等人，1991年，《胃肠病》，第32卷第3期，第260-265页(Mitchisonet al.，1991，Gut，32(3)，260-265))。此外，已描述在严格不含谷蛋白的饮食下每日仍可食用高达3g隐藏的谷蛋白(Aziz等人，2014年，《美国胃肠病学杂志》，第109卷第9期，1498页(Aziz et al.，2014，The American journal of gastroenterology，109(9)，1498))。

乳糜泻尤其流行于美国和欧洲，在那里约1％的个体的抗体测试呈阳性(Dubé等人，2005年，《胃肠病学》，第128卷第4期，第S57-S67页(Dubéet al.，2005，Gastroenterology，128(4)，S57-S67))。它是一种复杂的疾病，由各种免疫、遗传和环境因素之间的复杂相互作用引起(Alaedini和Green，2005年)。它是通过摄入小麦谷蛋白和其它相关的谷物蛋白(诸如黑麦和大麦蛋白)引发的。与乳糜泻相关联的症状是儿童的生长迟缓、易怒和青春期延迟，以及许多胃肠症状诸如不适、腹泻、粪便潜血、脂肪痢和肠胃气胀(Dubé等人，2005年；Sedghizadeh等人，2002年)。

非乳糜泻谷蛋白敏感症(也称为非乳糜泻小麦敏感症)是一种新兴病症。它被定义为由于摄入谷蛋白诱导的临床实体，其导致肠症状和/或肠外症状，这些症状可通过从饮食中去除含谷蛋白的食料而改善(Lundin和Alaedini，2012年)。除了醇溶蛋白(谷蛋白的主要细胞毒性抗原)之外，谷蛋白和含谷蛋白的谷物(小麦、黑麦、大麦以及它们的衍生物)中存在的其它蛋白/肽可在症状的发展中起作用。非乳糜泻谷蛋白敏感症是在普通人群中患病率介于0.5-13％之间(平均5％)的谷蛋白相关疾病的最常见综合征(Catassi等人，2013年，《营养物质》，第5卷第10期，第3839-3853页(Catassi et al.，2013，Nutrients，5(10)，3839-3853))。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是存在于真核细胞(Gettins，2002年，《化学评论》，第102卷第12期，第4751-4804页(Gettins，2002，Chemical reviews，102(12)，4751-4804))和原核细胞(Kantyka等人，《生物化学》，第92卷第11期，第1644-1656页(Kantyka et al.，Biochimie，92(11)，1644-1656))中的蛋白质超家族。

最近，已证实人丝氨酸蛋白酶抑制剂在谷蛋白相关疾病中起重要作用。弹力素是人丝氨酸蛋白酶抑制剂，其显示出对各种形式的弹性蛋白酶和蛋白酶的有效抑制能力(Ying和Simon，1993年，《生物化学》，第32卷第7期，第1866-1874页(Ying&Simon，1993，Biochemistry，32(7)，1866-1874))。弹力素在胃肠道的整个上皮中表达，并且其表达和诱导在患有炎性肠病和乳糜泻的患者中有所减少(Baranger、Zani、Labas、Dallet-Choisy和Moreau，2011年；Motta等人，2012年)。最近，已将弹力素鉴定为转谷氨酰胺酶2(TG2)的交联活性的底物(Baranger等人，2011年，《公共科学图书馆：综合》，第6卷第6期，第e20976页(Baranger et al.，2011，PloS one，6(6)，e20976)；Motta等人，《科学转化医学》，第4卷，第158期，第158ra144-158ra144页(Motta et al.，Science translational medicine，4(158)，158ra144-158ra144))。体外数据显示，添加弹力素适度抑制转谷氨酰胺酶2(Tg2)，因此抑制抗消化33-mer醇溶蛋白肽的脱酰胺作用，其是乳糜泻中先天性免疫应答的潜在触发因素中的一种(McCarville等人，2015年，《药理学新见》，第25卷，第7-12页(McCarvilleet al.2015，Current opinion in pharmacology，25，7-12))。

已证实，由重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的弹力素的递送减少了谷蛋白诱导的病变并且使小鼠谷蛋白敏感症模型中的肠道炎症正常化(Galipeau等人，2014年，《美国胃肠病学杂志》，第109卷第5期，第748-756页(Galipeau et al.，2014，TheAmerican joumal of gastroenterology，109(5)，748-756))。然而，提出的这种疗法基于转基因微生物(GMO)，并因此与食品应用不相容，因为消费者对GMO的接受度非常低。

最近，丝氨酸蛋白酶抑制剂已在原核细胞中报道。计算机分析显示了在不同的双歧杆菌物种中，存在编码氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白的基因，特别是在长双歧杆菌长亚种的细菌中。由长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp longum)(称为长双歧杆菌(B.longum))NCC2705编码的蛋白显示出与人丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的抗蛋白酶活性(Ivanov等人，2006年，《生物化学杂志》，第281卷第25期，第17246-17252页(Ivanov et al 2006，Journal ofBiological Chemistry，281(25)，17246-17252))。

长双歧杆菌NCC 2705根据布达佩斯条约于2001年1月29日保藏于巴斯德研究所，保藏号为CNCM I-2618。

最近已证实，通过产生丝氨酸蛋白酶抑制剂可改善小鼠谷蛋白敏感症模型中谷蛋白诱导的病理生理学的长双歧杆菌NCC 2705(CNCM I-2618)显示出其作为谷蛋白相关疾病的解决方案的潜力(McCarville等人，2017年，《应用与环境微生物学》，第83卷第19期，第e01323-17页(McCarville et al.，2017，Appl.Envoron.Microbiol.Vol.83，no.19，e01323-17))。

发明内容

本发明人惊奇地发现，果糖二糖和低聚果糖(FOS)在添加到长双歧杆菌长亚种的细菌的生长培养基中时可以增加血清的产生。

因此，在本发明的第一方面，提供了果糖二糖或低聚果糖(FOS)或它们的组合的用途，其用于增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。

在本发明的另一方面，提供了一种增加长双歧杆菌长亚种的细菌中的丝氨酸蛋白酶抑制剂产生的方法。其中所述方法包括使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长，其特征在于所述培养基包含果糖二糖或低聚果糖(FOS)或它们的组合。

根据本发明的另一方面，提供了通过使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长的方法产生的长双歧杆菌长亚种的细菌，其特征在于所述培养基包含果糖二糖或FOS或它们的组合。

相对于在不存在果糖二糖或FOS或它们的组合的情况下生长的相同长双歧杆菌长亚种菌株，根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种与增加的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平相关。

根据本发明，长双歧杆菌长亚种可以在包含果糖二糖或FOS或它们的组合的培养基中以例如0.02重量％至5重量％，优选地0.05重量％至2重量％的浓度培养。

例如，可在包含浓度为0.02重量％至5重量％、0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的果糖二糖或FOS或它们的组合的培养基中培养长双歧杆菌菌株CNCM I-2618。

在一些优选的实施方案中，果糖二糖选自蔗糖、乳果糖或它们的组合。在一些优选的实施方案中，使用蔗糖。

在一些优选的实施方案中，FOS是平均DP为2至10的短链FOS。

根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，其包含根据本文描述的方法产生的长双歧杆菌长亚种。

在一个实施方案中，该组合物为食品、医疗食品、管饲或营养补充剂。

在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、婴儿配方食品和宠物食品。

在一个实施方案中，该组合物为药物组合物，其中药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的或涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性降低的病症中使用。

根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防谷蛋白相关疾病中使用。

根据本发明的一个方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎或小麦过敏中使用。

根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防炎症性肠病中使用。

长双歧杆菌长亚种可以是任何长双歧杆菌长亚种菌株。在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种菌株可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC BAA-999、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)或它们的组合，特别是长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)。

在一些实施方案中，果糖二糖选自蔗糖、乳果糖或它们的组合。在一些优选的实施方案中，使用蔗糖。

在一些实施方案中，FOS的DP范围为2至10，优选2至8。

还应理解，当果糖二糖或FOS或它们的组合与长双歧杆菌长亚种组合施用时，果糖二糖和/或FOS还可在体内增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。

因此，根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)果糖二糖或FOS或它们的组合的组合。

根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)果糖二糖或FOS或它们的组合的组合，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症中使用。

在一个实施方案中，该组合是长双歧杆菌菌株CNCM I-2618和蔗糖的组合。

在另一个实施方案中，该组合是长双歧杆菌菌株CNCM I-2618和FOS(优选DP范围为2至10，优选2至8的FOS)的组合。

根据本发明的另一方面，还提供了长双歧杆菌长亚种，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关的病症中使用，其中长双歧杆菌长亚种与果糖二糖或FOS或它们的组合组合施用。

根据本发明的另一方面，提供了果糖二糖或FOS或它们的组合，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关的病症中使用，其中果糖二糖或FOS或它们的组合与长双歧杆菌长亚种组合施用。

在一些实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC BAA-999、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)或它们的组合。

在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株ATCC 15707(T)或它们的组合。

在一些优选的实施方案中，使用长双歧杆菌长亚种菌株长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)。

在一些实施方案中，FOS的DP范围为2至10，优选2至8。

附图说明

图1-示出了在不同碳水化合物上生长48小时的长双歧杆菌NCC 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。

图2-示出了在不同碳水化合物上生长24小时和48小时的长双歧杆菌NCC 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。

图3-示出了在不同二糖和三糖上生长48小时的长双歧杆菌NCC 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。

图4-示出了在FOS上生长16小时的长双歧杆菌NCC 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。

具体实施方式

组合物

本发明的组合物可为食品、医疗食品、管饲、营养组合物或营养补充剂的形式。术语“营养补充剂”是指旨在补充个体的一般饮食的产品。

该组合物可为医疗食物的形式。如本文所用，术语“医疗食品”是指专门配制用于医疗疾病或病症的膳食管理的食物产品。医疗食物可以在医疗监督下施用。医疗食物可用于口服摄取或管饲。

该组合物可为管饲的形式。术语“管饲”是指旨在通过饲管将营养物质直接引入个体的胃肠道的产品。管饲可通过例如穿过个体的鼻子放置的饲管(诸如鼻胃管、鼻窦管和鼻空肠管)或者直接放置到个体的腹部中的饲管(诸如，胃造口术、胃空肠吻合术或空肠造口术饲管)来施用。

该组合物可以呈药物组合物的形式并且可包含一种或多种合适的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

本文所述组合物的此类合适的赋形剂的示例可见于由A Wade和PJ Weller编辑的《药物赋形剂手册》，第2版，1994年(“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，2ndEdition，(1994)，Edited by A Wade and PJ Weller)中。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且描述于例如A.R.Gennaro编辑的《Remington的药物科学》，Mack出版公司，1985年(“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，Mack PublishingCo.(A.R.Gennaro edit.1985)。

合适的载体的示例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的示例包括乙醇、甘油和水。

可参照预期的施用途径和标准药物实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂的选项。药物组合物可包含以下物质作为载体、赋形剂或稀释剂或除了载体、赋形剂或稀释剂之外还包含以下物质：任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂和/或增溶剂。

合适的粘结剂的示例包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的示例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。

可以在组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至风味剂。防腐剂的示例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

营养学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂包括在食品工业中作为标准使用的适合人类或动物食用的那些。典型的营养学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂对于本领域的技术人员来说是熟悉的。

组合物可为片剂、糖衣丸、锭剂、胶囊、胶丸、粉末、颗粒、溶液、乳液、悬浮液、包衣颗粒、喷雾干燥颗粒或丸剂的形式。

在一个另选的实施方案中，组合物可为用于局部施用的组合物的形式，诸如用于局部施用的凝胶、霜剂、膏剂、乳液、悬浮液或溶液。

对于本领域的技术人员显而易见的是，理想的剂量将取决于待治疗的个体、其健康状况(例如性别、年龄或体重)以及施用途径。理想使用的剂量将因此改变，但可由本领域的技术人员容易地确定。

然而，一般来讲，优选的是本发明的组合物每日剂量包含10⁶cfu至10¹⁰cfu和/或10⁶至10¹⁰个长双歧杆菌长亚种细胞。其还可包含每克组合物干重10⁶cfu至10¹¹cfu和/或10⁶至10¹¹个长双歧杆菌长亚种细胞。

长双歧杆菌(BIFIDOBA CTERIUM LONGUM)

丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因及其周围在长双歧杆菌长亚种内高度保守。长双歧杆菌长可以是任何长双歧杆菌长亚种菌株。在一些实施方案中，长双歧杆菌长亚种菌株可选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC BAA-999(可作为BB536，购自森永乳业有限公司(Morinaga MilkIndustry Co.Ltd))、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)，长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-103、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2334、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3864、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3853或它们的组合。

菌株已存放在下表(表1)所指示的保藏机构，并且已经得到以下保藏日期和保藏号：

表1

CNCM指法国巴黎巴斯德研究所国立微生物培养物保藏中心(法国巴黎第15区红色医生路28号巴斯德研究所，邮编F-75724)(Collection nationale de cultures demicro-organismes，Institut Pasteur，28，rue du Dr Roux，F-75724Paris Cedex 15，France)。ATCC是指美国标准菌库(美国弗吉尼亚周马纳萨斯大学大道10801号，20110-2209(10801University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A))。DSM是指德国莱布尼茨植物遗传和作物研究所(德国布伦瑞克Inhoffenstr.7B，D-38124(Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，Germany))。NCIMB是指NCIMB有限公司(苏格兰阿伯丁BuckburnLtd，Craibstone Estate弗格森大楼，AB21 9YA(Ferguson Building，Craibstone Estate，Buckburn，Aberdeen AB21 9YA，Scotland))。

菌株1、2、6、7、9、11-13已由瑞士韦威雀巢大街55号雀巢公司，1800(Nestec S.A.，avenue Nestlé 55，1800Vevey，Switzerland)保藏。此后，Nestec S.A.已合并到Sociétédes Produits Nestlé S.A。因此，根据《布达佩斯条约》第2(ix)条，Société des ProduitsNestlé S.A.是Nestec S.A.的继承者。所有其它菌株都是可商购的。

果糖二糖和FOS

本发明人惊奇地发现，果糖二糖和低聚果糖(FOS)可增加长双歧杆菌亚种细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。。

如本文所用，术语“低聚糖”是指聚合度(DP)在2至20范围内的碳水化合物。

“聚合度”或“DP”是指低聚糖或多糖链中糖单元的总数。

如本文所用，术语“果糖二糖”是指含有至少一种果糖分子的二糖。

合适的果糖二糖的示例包括蔗糖(由一个葡萄糖分子和一个果糖分子构成)、乳果糖(由一个半乳糖构成和一个果糖分子)、姜黄糖(由葡萄糖和一个果糖分子构成)。

如本文所用，术语“低聚果糖”(FOS)是指包含两个或更多个果糖分子的非消化低聚糖。本发明的低聚果糖的DP为2至200，优选地DP为2至100，例如DP为2至60，更优选地DP为2至20，或DP为2至10。在一些优选的实施方案中，FOS是短链FOS，其DP在2至10的范围内，包括端值在内，优选地在2至8的范围内，包括端值在内。

优选地，基于单体亚单元，FOS的糖单元的至少30％，优选地至少60％，更优选至少90％是果糖单元。在一些优选的实施方案中，FOS由由β-1，2-键连接的果糖单体亚基构成，任选地具有末端-站立葡萄糖子单元。优选地，具有2至8(包括端值在内)的DP。

由于其糖苷键的配置，低聚果糖(FOS)在很大程度上抵抗唾液和肠道消化酶的水解。FOS被分类为益生元、不可消化的碳水化合物，其通过刺激结肠中有益细菌的生长和/或活性而有利地影响宿主。

长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为例如0.02重量％至5重量％的果糖二糖或FOS或其混合物的培养基中培养。例如，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为0.02重量％至5重量％、0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的果糖二糖或FOS或其混合物的培养基中培养。

可将果糖二糖或FOS或其混合物添加到常规培养基中，该常规培养基包含至多8重量％，优选至多6重量％，例如至多4重量％的适于维持长双歧杆菌生长的另一种糖，诸如但不限于葡萄糖。即使存在葡萄糖，果糖二糖也可诱导长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。优选地，发酵结束时的培养基含有小于0.4重量％的葡萄糖，诸如0重量％至0.3重量％的葡萄糖。适于长双歧杆菌生长的常规培养基是本领域技术人员众所周知的。

在一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种可任选地在葡萄糖存在下，在包含浓度为0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的果糖二糖或FOS的培养基中培养。优选地，发酵结束时的培养基含有小于0.4重量％的葡萄糖，诸如0重量％至0.3重量％的葡萄糖。

在一个实施方案中，蔗糖以上述浓度使用。

在一个实施方案中，FOS以上述浓度使用。

用于产生培养物粉末的方法

属于菌种长双歧杆菌的菌株在厌氧条件下生长。厌氧条件下的发酵方法是公知的。根据待生长的微生物，技术人员能够鉴定发酵培养基的合适组分并基于常识调整发酵条件。发酵培养基通常包含

-氮源，诸如酵母提取物；

-碳源，诸如糖；

-微生物所需的各种生长因子(例如矿物质、维生素等)以及

-水。

用于长双歧杆菌的典型生长培养基的非限制性示例为补充有0.05％半胱氨酸的MRS(De Man、Rogosa和Sharpe)培养基(MRSc)。

发酵优选以两个步骤进行，发酵剂发酵在主发酵步骤之前进行。发酵培养基对于发酵剂发酵和主发酵可以是不同的，或者可以是相同的。

该方法的第二步是生物质的浓缩。这也可使用本领域技术人员已知的方法进行，诸如例如离心或过滤。基于生物质的总干重(即发酵培养基和产生的微生物的总量)计，浓缩后生物质的总固体含量优选地为10重量％至35重量％，优选地为14重量％至35重量％。

任选地，浓缩可在洗涤步骤之前或与洗涤步骤组合以去除发酵培养基的残余物和/或在发酵期间产生的化合物。例如，可通过浓缩生物质，将浓缩的生物质重悬于缓冲液诸如磷酸盐缓冲液或类似组合物中并重新浓缩生物质来进行洗涤。

例如，可应用全文以引用方式并入的WO2017/001590中描述的方法。

组合

在本发明的一个方面，提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)果糖二糖或FOS或它们的组合的组合。

如本文所用，术语“组合”是指长双歧杆菌长亚种和果糖二糖或FOS或它们的组合的组合施用，其中双歧杆菌长亚种和果糖二糖和/或FOS可同时或按顺序施用。

如本文所用，术语“同时”或“同时地”用于表示两种药剂同时(即，在同一时间)施用。

术语“顺序”或“按顺序”用于表示两种药剂相继施用，其中长双歧杆菌长亚种或果糖二糖或FOS或它们的组合可以首先施用。

药剂可作为单独的制剂或作为单个组合制剂来施用。

当化合物被共同配制时，即共同配制在相同的组合物或制剂中时，它们只能被同时施用。当化合物被配制在单独的组合物或制剂中时，它们可以被同时施用或依次施用。相同制剂或单独制剂中的药剂的同时施用也可被描述为两种化合物的共同或联合施用。

在一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种和果糖二糖或FOS或它们的组合是混合在一起的。在另一个实施方案中，长双歧杆菌菌株长亚种和果糖二糖或FOS或它们的组合以试剂盒的形式存在，该试剂盒包含这两种药剂的制剂，以及任选地，向对有需要的受试者同时或按顺序施用该制剂的说明。

治疗

根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种菌株或包含该菌株的组合物可用于在治疗或预防涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的谷蛋白相关疾病或病症中使用。

例如，根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种菌株或包含该菌株的组合物可用于在治疗或预防炎症性肠病、乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎和小麦过敏中使用。

优选地，该疾病是谷蛋白相关疾病。谷蛋白相关疾病涵盖由谷蛋白引发的疾病。术语“与谷蛋白敏感症相关的病症”和“谷蛋白相关疾病”在本文中可互换使用。谷蛋白相关疾病包括乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎和小麦过敏。

乳糜泻

乳糜泻是最常见的免疫介导的疾病之一。它是世界范围内的病症，尤其流行于美国和欧洲，在那里约1％的个体的抗体测试呈阳性。乳糜泻是一种复杂的疾病，由各种免疫、遗传和环境因素之间的复杂相互作用引起。它是通过摄入小麦谷蛋白和其它相关的谷物蛋白(诸如黑麦和大麦蛋白)引发的。与乳糜泻相关联的症状是儿童的生长迟缓、易怒和青春期延迟，以及许多胃肠症状如不适、腹泻、粪便潜血、脂肪痢肠胃气胀。

临床证据显示，与乳糜泻病变密切相关的II类人白细胞抗原(HLA-DQII)在约95％的乳糜泻患者中表达。在肠腔中，谷蛋白被部分消化，形成抗蛋白水解33-mer谷蛋白肽。在穿过小肠屏障后，通过带负电荷的转谷氨酰胺酶2(TG2)将它们去酰胺化(Sollid，2000年，《免疫学年鉴》，第18卷第1期，第53-81页(Sollid，2000，Annual review of immunology，18(1)，53-81))，然后它们与HLA-DQ2.5/8的带正电结合位点结合(Dieterich等人，1997年，《自然医学》，第3卷第7期，第797-801页(Dieterich et al.，1997，Nature medicine，3(7)，797-801))。显示那些特异性谷蛋白肽的HLA-DQ2.5/8向辅助T细胞和其它免疫细胞发送信号，在小肠中引起进一步损伤。针对谷蛋白的抗体和针对结缔组织组分(TG2)的自身抗体也与乳糜泻进展相关联(Alaedini和Green，2005年，《内科医学年鉴》，第142卷第4期，第289-298页(Alaedini&Green，2005，Annals of internal medicine，142(4)，289-298))。

非乳糜泻谷蛋白敏感症

非乳糜泻谷蛋白敏感症(也称为非乳糜泻小麦敏感症)是一种新兴病症。它被定义为由于摄入谷蛋白诱导的临床实体，其导致肠症状和/或肠外症状，这些症状可通过从饮食中去除含谷蛋白的食料而改善(Lundin和Alaedini，2012年)。非乳糜泻谷蛋白敏感症的发病尚未被充分了解。已表明，除了醇溶蛋白(谷蛋白的主要细胞毒性抗原)之外，谷蛋白和含谷蛋白的谷物(小麦、黑麦、大麦以及它们的衍生物)中存在的其它蛋白/肽可在症状的发展中起作用。非乳糜泻谷蛋白敏感症是在普通人群中患病率介于0.5-13％之间的谷蛋白相关疾病的最常见综合征(Catassi等人，2013年，《营养物质》，第5卷第10期，第3839-385页(Catassi et al.，2013，Nutrients，5(10)，3839-385))。非乳糜泻谷蛋白敏感症的诊断通过排除其它谷蛋白相关疾病来进行。

疱疹样皮炎

疱疹样皮炎是一种慢性起泡皮肤自身免疫性病症，其特征在于存在皮肤病变，该皮肤病变具有广泛且对称的分布，主要在摩擦较大的区域中，并且主要影响两个肘部、膝盖、臀部、踝部，并且也可影响头皮和身体的其它部位。这些病变是水泡-结痂型的，并且当它们剥落时，它们发展成有色区域或者慢性且强烈的灼热、瘙痒和起泡皮疹。

发病年龄是可变的。它可始于儿童和青少年时期，但也可在其生命的任何年龄不明显地影响两种性别的个体。

患有疱疹样皮炎的人具有不同程度的肠病变，范围从较温和的粘膜损伤到存在绒毛萎缩。

小麦过敏

小麦过敏的胃肠症状类似于乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症，但在暴露于小麦和症状发作之间存在不同的间隔。在食用含小麦的食品后小麦过敏会快速发作(从几分钟到几小时)，并且可导致过敏症。

谷蛋白共济失调

谷蛋白共济失调是谷蛋白相关疾病。患有谷蛋白共济失调时，在小脑中发生损伤，小脑是大脑的平衡中心，控制协调和复杂运动如行走、说话和吞咽。谷蛋白共济失调是散发性特发性共济失调的最常见起因之一。它占据未知来源共济失调的40％和所有共济失调的15％。

谷蛋白共济失调是由于遗传易感性个体摄入谷蛋白而引发的免疫介导的疾病。在患有散发性特发性共济失调的所有患者的鉴别诊断中应考虑它。治疗的效果取决于从共济失调发病直到诊断所经过的时间。由于个体暴露于谷蛋白所导致的小脑中神经元的死亡是不可逆的。

早期诊断和用不含谷蛋白的饮食治疗可改善共济失调并阻止其进展。少于10％的患有谷蛋白共济失调的人呈现任何胃肠症状，但约40％具有肠损伤。谷蛋白共济失调的敏感标记物包括抗醇溶蛋白抗体。免疫球蛋白A(IgA)在小肠中和在肠外位点处紧靠转谷氨酰胺酶2(TG2)沉积证明是另外可靠的。

施用

本文所述的长双歧杆菌菌长亚种或组合物优选地经肠施用。

经肠施用可以是口服、胃和/或直肠施用。

一般来讲，本文所述的组合或组合物的施用可例如通过口服途径或另一种途径进入胃肠道，例如可通过管饲施用。

在一个另选的实施方案中，本文所述的组合施用或组合物的施用可以是局部施用。

个体可以是哺乳动物，诸如人类、犬科动物、猫科动物、马科动物、山羊、牛科动物、绵羊、猪、鹿科动物和灵长类动物。优选地，个体是人类。

现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。

除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，1989年，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，第二版，冷泉港实验室出版社；Ausubel，F.M.等人，(1995年和定期补充)，《Current Protocols in Molecular Biology》，第9、13和16章，JohnWiley&Sons；Roe，B.、Crabtree，J.和Kahn，A.，1996年，《DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques》，John Wiley&Sons；Polak，J.M.和McGee，J.O’D.，1990年，《InSitu Hybridization：Principles and Practice》，牛津大学出版社；Gait，M.J.，1984年，《Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach》，IRL出版社；以及Lilley，D.M.AndDahlberg，J.E.，1992年，《Methods in Enzymology：DNA Structures Part A：Synthesisand Physical Analysis of DNA》，学术出版社。这些一般性文本均以引用的方式并入本文。

实施例

实施例1：由蔗糖进行的长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导

长双歧杆菌菌株CNCM I-2618(NCC 2705)在不含糖的MRS+5mML-半胱氨酸(MRSc)碱基中在微型生物反应器(Biolector)(生长条件-厌氧，37℃)中生长，向其中添加不同的碳水化合物。

使用配有pH传感器和溶解氧(DO)传感器的48孔微量滴定板在微型生物反应器(德国m2p-labs Aachen公司(m2p-labs Aachen，Germany))中培养菌株。将其连续摇动24小时和48小时以防止细菌聚集。通过离心收获培养物并去除上清液。将沉淀重悬于补充有halt蛋白酶抑制剂(西格玛公司(Sigma))的PBS中并且使用玻璃珠裂解。然后收集含有可溶性和不溶性材料的裂解物。使用Pierce BCA试剂盒(Thermofisher)测量总蛋白质含量，并且使用ELISA测定丝氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白浓度。

如图1所示，与所测试的所有其它糖相比，单糖果糖被示出为增加长双歧杆菌NCC2705丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。

如图2中所示，果糖能够诱导长双歧杆菌NCC 2705中的丝氨酸蛋白酶抑制剂比半乳糖更高的量值。然而，由于该菌株花费更多时间切换到基于果糖的方案，导致延迟生长(由三角形表示，表示通过600nm处的光密度测量的培养密度)，因此与在半乳糖上生长时相比，该菌株需要更多时间达到相同的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。

实施例2：在葡萄糖存在下由果糖二糖进行的长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705) 丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导

长双歧杆菌NCC 2705在不含糖的MRSc的碱基中在微型生物反应器(如实施例1中所述)中培养，其中添加不同的二糖和三糖，浓度为0.5重量％和1重量％。在生长48小时后收集培养物并且分析总体丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平(如实施例1中所述)。

图3示出了果糖二糖和三糖能够诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生，并且比测试的其它二糖诱导的程度更大。对于棉子糖(三糖)，与1重量％的浓度相比，仅获得浓度为0.5重量％的丝氨酸蛋白酶抑制剂水平的显著增加。不希望受到任何理论的束缚，应认为这是由于在将三糖以1重量％使用时发酵结束时存在高水平的残留葡萄糖。令人惊讶的是，发现即使在1重量％的浓度下，蔗糖也能够强烈诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。

实施例3：由短链低聚果糖(FOS)进行的长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC 2705)丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导

长双歧杆菌NCC 2705在不含糖的MRSc的碱基中在微型生物反应器(如实施例1中所述)中培养，其中添加不同的短链低聚果糖(FOS)，浓度为1重量％。在生长16小时后收集培养物，并且分析总丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平(如实施例1中所述)。

所用的FOS是(i)来自美国Ingredion公司(Ingredion Inc，USA)的NutraFloraP95 FOS，一种具有葡萄糖-果糖(GF)链的短链FOS，其中DP为3至5并且包含GF2、GF3和GF4分子；(ii)来自Beneo的Orafti P95，一种DP为2至8的短链FOS。

图4示出了FOS能够诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生，在很大程度上控制葡萄糖生长。

Claims

1.果糖二糖、低聚果糖(FOS)或它们的组合用于增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白产生的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述长双歧杆菌长亚种在包含浓度为0.02重量％至5重量％的果糖二糖、低聚果糖(FOS)或它们的组合的培养基中培养。

3.用于增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平的方法，其中所述方法包括在培养基中生长长双歧杆菌长亚种，其特征在于所述培养基包含果糖二糖、FOS或它们的组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养基包含浓度为0.02重量％至5重量％的所述果糖二糖、FOS或它们的组合。

5.根据权利要求1或2所述的用途或根据权利要求3或4所述的方法，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC BAA-999、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)或它们的组合。

6.根据权利要求1、2或5所述的用途或根据权利要求3、4或5所述的方法，其中所述长双歧杆菌长亚种是长双歧杆菌菌株CNCM I-2618(NCC 2705)。

7.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的用途或根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述果糖二糖或FOS选自蔗糖、乳果糖以及它们的组合。

8.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的用途或根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述果糖二糖或FOS是具有在2至10范围内的DP的FOS。

9.通过在培养基中生长长双歧杆菌长亚种的方法产生的长双歧杆菌长亚种，其特征在于所述培养基包含果糖二糖、FOS或它们的组合。

10.通过根据权利要求9所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，其中所述培养基包含浓度为0.02重量％至5重量％的果糖二糖、FOS或它们的组合。

11.通过根据权利要求9或10所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC BAA-999(可作为BB536，购自森永乳业有限公司)、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-103、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2334、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3864、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3853或它们的组合。

12.组合物，所述组合物包含根据权利要求9至11中任一项所述的方法产生的所述长双歧杆菌长亚种。

13.根据权利要求9至11中任一项所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种或根据权利要求12所述的组合物，用于在治疗或预防炎症性肠病、乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎或小麦过敏中使用。

14.(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)果糖二糖、FOS或它们的组合的组合，用于在治疗或预防炎症性肠病、乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎或小麦过敏中使用。

15.根据权利要求14所述的用于使用的组合，其中所述长双歧杆菌长亚种选自长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2169、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2171、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC BAA-999(可作为BB536，购自森永乳业有限公司)、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC15708、长双歧杆菌长亚种菌株DSM 20097、长双歧杆菌长亚种菌株NCIMB 8809、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2618(NCC 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-2170、长双歧杆菌长亚种菌株ATCC 15707(T)、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-103、长双歧杆菌长亚种菌株CNCMI-2334、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3864、长双歧杆菌长亚种菌株CNCM I-3853或它们的组合。

16.根据权利要求14或15所述的组合，其中所述果糖二糖或FOS选自蔗糖、乳果糖或它们的组合。

17.根据权利要求14或15所述的组合，其中所述果糖二糖或FOS是具有在2至10范围内的DP的FOS。