TW201336989A - 雙歧桿菌ｃｅｃｔ７７６５及彼於預防及／或治療過重、肥胖症及相關病徵之用途 - Google Patents

Abstract

本發明關於假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株、其細胞組分、代謝物及分泌分子、彼等與其他微生物之組合及包含該等上述產物之組成物、以及假小鏈雙歧桿菌種之菌株的用途、或該CECT7765菌株於預防及/或治療肥胖症、過重、高血糖症及糖尿病(尤其是第2型糖尿病)、肝脂肪變性或脂肪肝、血脂異常、代謝徵候群、與肥胖症和過重相關的免疫系統功能失調、及與肥胖症和過重相關之腸內微生物叢組成失衡之用途。

Description

雙歧桿菌CECT7765及彼於預防及/或治療過重、肥胖症及相關病徵之用途

本發明關於醫藥組成物或製劑的治療活性領域和食品領域。特定地，本發明關於假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株、其細胞組分、代謝物及分泌分子、彼等與其他微生物之組合及包含該等上述產物之組成物、以及假小鏈雙歧桿菌種之菌株的用途、或該CECT7765菌株於預防及/或治療肥胖症、過重、高血糖症及糖尿病(尤其是第2型糖尿病)、肝脂肪變性或脂肪肝、血脂異常、代謝徵候群、與肥胖症和過重相關的免疫系統功能缺陷、及與肥胖症和過重相關之腸內微生物叢組成失衡之用途。

由於不斷增長的患病率和發病率，過重和肥胖症已成為當今主要的公共健康問題之一。過重和肥胖症包括例如代謝徵候群、高血壓、血脂異常、糖尿病、心血管疾病、動脈粥樣硬化、肝脂肪變性或脂肪肝及某些癌症類型。

肥胖症係由能量消耗與攝入之間的長期不平衡所導致，此造成體內脂肪的過量增加。神經內分泌系統所合成的多肽和激素能在不同的周圍組織和器官與中樞神經系統之間傳遞，該過程有關能量平衡的控制，且中樞神經系統總體能調節體重。脂肪組織產生的信號(瘦素)和胰腺產生的信號(胰島素)係長期消耗控制的基礎(Konturek et al.,2004.J Physiol Pharmacol.,55：137-154)。胰島素是調節 脂肪組織正常工作及其中甘油三酯累積與葡萄糖攝入的最重要激素。脂肪儲藏在正常的胰島素敏感之脂肪組織中且藉由刺激脂蛋白脂肪酶和抑制脂肪分解以回應胰島素和其他激素(瘦素)。然而，脂肪酸在與肥胖症相關的脂肪組織之過量累積降低胰島素敏感性，且以甘油三脂形式存在的游離脂肪酸累積轉移至某些器官和組織(肝臟、肌肉、心臟等)，並導致瘦素產量或敏感性的改變，增加促發炎細胞因子合成，此增加相關疾病(代謝徵候群、心血管疾病等)的發病風險。胰島素傳訊對於中樞神經系統的能量平衡控制和葡萄糖穩態亦是必需的，此取決於彼與其他調節因子(例如瘦素)的相互作用，彼等一起作為食欲減退因子進而減少消耗(Gerozissis K.,2004.Eur J Pharmacol.,490(1-3)：59-70)。瘦素是一種主要由脂肪組織合成的激素/脂肪因子並亦能由其他組織(諸如胃)微量合成，且瘦素的分泌係由胰島素刺激。在中樞神經系統之濃度下，瘦素可抑制食欲，增加能量消耗並參與許多重要的過程(諸如胰腺β細胞功能)以利於胰島素分泌(La Cava A,Matarese G.The weight of leptin in immunity.Nat Rev Immunol.2004 May；4(5)：371-9)。在周圍濃度下，瘦素藉由減少脂肪酸和甘油三酯的合成並增加脂肪氧化而發揮作用。不過，在肥胖症個體內，該脂肪因子的周圍濃度異常地高，導致脂肪因子抗性發展。除能作為代謝病症的標記外，肥胖個體內高瘦素濃度可調節免疫應答並導致肥胖症相關之發炎。

肥胖症同樣被認為係一種輕度慢性炎症，其特徵在於 脂肪組織和全身性的細胞因子、脂肪因子及其他促發炎蛋白的高產量，其導致代謝病症，諸如個體會永久罹患之第2型糖尿病(Tilg and Moschen,2006.Nat Rev Immunol.,6：772-783)。與肥胖症和代謝病症相關的發炎因子特別地包括促發炎細胞因子TNF-α和IL6及巨噬細胞趨化蛋白MCP1。特別地，TNF-α降低參與胰島素作用的基因的表現(例如胰島素受體的基因表現)，減弱胰島素傳訊且抑制胰島素刺激的脂蛋白脂肪酶的作用。MCP1有利於巨噬細胞對增重相關之脂肪組織的浸潤，此導致增加促發炎細胞因子(TNF-α)的產生並發生胰島素抗性和肝脂肪變性。使用基於抗TNF-α抗體的藥物能改善此等病症(諸如脂肪變態、胰島素抗性及第2型糖尿病)亦證明促發炎細胞因子在該過程中發生作用(Tilg and Moschen,2006.Nat Rev Immunol.,6：772-783)。

肥胖症同樣以不同免疫系統細胞(諸如巨噬細胞、樹突細胞及T細胞)的功能改變為特徵，並與針對病原體和其他抗原的防禦缺陷、手術後感染及併發症的高風險性有關。脂肪組織巨噬細胞具有較低的吞噬能力及降低的呼吸爆發，此等過程皆參與先天免疫系統對抗傳染原的應答(Zhou et al.,2009.Proc Natl Acad Sci USA,106(26)：10740-5)。此外，樹突細胞刺激T細胞的功能受到干擾，且該過程參與適應性免疫應答，例如疫苗接種中產生抗體及感染的情況下記憶性T細胞的應答(Karlsson et al.,2010.J Immunol.,184：3127-33)。

與高能量食品消耗和低體力活動相關的社會變化被認為是全球性肥胖症發生率增高的主要原因。儘管如此，基於低熱量飲食並增加體力運動的傳統治療在肥胖症控制中效果有限，通常只導致有限的、暫時性體重下降。使用藥物策略亦同樣不能令人滿意，因為會產生副作用。因此，仍尋找能改進治療和預防此等疾病的新干預策略。

集落於人小腸內的微生物叢被認為是參與肥胖症和相關疾病的一種新因素，其係藉由彼之調節代謝和個體免疫功能的能力而發生作用(Sanz et al.,2010.Proc Nutr Soc.,14：1-8)。檢測與肥胖症相關的微生物叢組成的改變提供對腸道生態系統有目的的操作，其可作為控制肥胖症的另一方法(Ley et al.,2006.Nature,444：1022-1023；Nadal et al.,2008.Int J Obes.,33(7)：758-67)。於此意義上，不同的刊物或專利皆提出使用乳酸菌和雙歧桿菌菌群以治療肥胖症或相關病症。WO 2007/043933提出乳酸桿菌F19和NCFB1748及乳酸雙岐桿菌Bb12菌株可用於控制體重並以醱酵乳的形式降低食欲；然而，此等效果係由醱酵乳內所含的乳蛋白和鈣所引起而非由菌株本身所引起，且此等效果只是基於與小腸代謝相關之基因表現的調控；雖然如此，肥胖症涉及許多其他器官和組織。US 20100061967 A1亦提出使用能調控肽表現的細菌，該肽僅能於調節胃腸道的飽食。另一專利申請案WO 2009153662提出對糖尿病施予雙歧桿菌和乳酸桿菌僅係基於此等微生物能降低周圍組織發炎的能力，並未對考慮中樞神經系統濃度或其他涉及 該等病症的起源和發展過程的效果。US 20100150890提出益生菌於刺激交感神經系統功能之用途，藉以加速代謝和能量消耗；雖然如此，某些肥胖症患者亦發生交感緊張增加。US 20100111915提出益生菌於預防兒童肥胖症之一般用途，此係基於彼之雙歧化效果(即增加腸內雙歧桿菌之總量)，但未提出任何有關雙歧桿菌之一般簡單增加可調控能導致肥胖症發生的特定過程之機理；此外，亦考慮雙歧桿菌之性質對每一菌株皆具有特殊性。此外，上述專利文獻之研究並未使用雙歧桿菌屬菌株，而是使用乳酸桿菌屬菌株或乳酸桿菌屬菌株與乳酸雙歧桿菌Bb12的組合，及對飲食之改良，因此該等效果不能歸因於雙歧桿菌(US 20100111915；Luoto et al.,2010.Br J Nutr.,103(12)：1792-9；Luoto et al.2010.Int J Obes(Lond).Mar 16)，且該等菌株係與本發明之菌株不同。另一專利申請案US 20050112112提出自單糖和雙糖產生聚合物的微生物之用途，該微生物能減少個體對該等化合物的特異性吸收，藉由使用此等物質(諸如殼聚糖與雙歧桿菌之組合)能特異地降低膽固醇吸收(JP10306028)，此等皆屬減少與飲食的特殊組分相關的肥胖症所導致之問題的部分方法。

因此，尋找能預防及/或治療諸如過重、肥胖症及相關病症(諸如糖尿病、血脂異常、肝脂肪變性及代謝徵候群)之疾病的更為合適之策略仍為一個問題，該策略能共同作用於與免疫系統失調的關係及與葡萄糖代謝和周圍及中樞濃度的胰島素抗性的聯結，及與不同慢性病症有關的 血液和周圍組織中脂質累積之改變的聯結。

本發明關於假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株、其細胞組分、代謝物及分泌分子、彼等與其他微生物的組合、包含上述產物的組成物、及該菌株於預防及/或治療過重及/或肥胖症及相關病症(諸如糖尿病、高血糖症、肝脂肪變性、代謝徵候群或免疫系統功能失調(其導致其他病症(諸如感染)))之用途。本發明亦關於該菌株於預防及/或治療與過重及/或肥胖症無關的上述病症之用途。

屬於假小鏈雙歧桿菌種的CECT7765菌株，與同種的其他菌株或其他雙歧桿菌屬菌種和其他乳酸菌屬之菌株相比，具有更佳的免疫性質。與同種的其他菌株相比，CECT7765菌株能顯著降低巨噬細胞TNF-α促發炎細胞因子的產生(大約降低2.5至12.6倍；表1)；此外，彼亦降低MCP1的產生(大約降低1.2至38.2倍；表1)。正如述於先前技術部分，藉由巨噬細胞合成的該等細胞因子和趨化因子直接與諸如肥胖症、糖尿病、血脂異常及其他相關代謝病症有關。另外，CECT7765菌株誘導抗發炎性細胞因子(諸如IL10)的合成且與此等病症的負相關率係高於其他雙歧桿菌屬菌株(提高1.9至4.8倍；表2)。所選擇細菌的免疫性並非為所有乳酸桿菌和雙歧桿菌屬的細菌菌株所共有，因此與肥胖症和過重一起或獨立出現時，此等性質使得所選擇細菌尤其適用於預防和治療過重及/或肥胖症 及相關病症，因為該等疾病的共同特徵皆與低濃度慢性發炎相關。

與現有技術不同，本發明達到使用多因子之方式以治療肥胖症，且本發明藉由作用於新的關鍵標靶以預防及/或治療該病症或相關病症，而該等病症並未描述表明能用其他任何已知的雙歧桿菌屬菌株進行治療。最令人感興趣的是，本發明自始至終皆表明未有任何一個已知的上述菌屬或菌種的菌株被證明對上述病症顯現同時且有效之治療。

因此，本發明為現有技術提供一種具有高價值的假小鏈雙歧桿菌菌株，其能用於治療過重及/或肥胖症及特定相關病症，例如但不限於糖尿病、肝脂肪變性、血脂異常或代謝徵候群。

本質上，使用本發明的假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株的優點如下：

-對肥胖和非肥胖個體施用假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株均能減小脂肪細胞的體積(見實施例4)。特別地，施用CECT7765菌株的肥胖動物小體積脂肪細胞(1000-2000 μm²)增多，然未施用CECT7765菌株的肥症動物則是大體積脂肪細胞(4000-6000 μm²)增多(實施例4，圖5)。

CECT7765菌株減小脂肪細胞體積的事實證明其對治療脂肪細胞肥大是有效的，且若脂肪細胞肥大持續時間過長且脂肪細胞數目過多，則將導致過重和肥胖症。此係因為大體積脂肪細胞會分泌更高濃度的生長因子，該生長因 子在前體脂肪細胞分化之過程中誘發脂肪生成並產生反饋回路。此外，肥大脂肪細胞亦會產生異常的高濃度發炎性細胞因子和趨化因子(TNF-α、MCP-1、IL-6、抵抗素等)，該等因子會抑制肝細胞的胰島素傳訊，並引起胰島素抗性和其他併發症。脂肪細胞增大的體積亦與肝臟的脂肪酸供給量增加有關，此種增加會導致肝脂肪變性及其他併發症。因此，該菌株能預防或改善該等相關病症。

-對肥胖和非肥胖個體施用本發明的菌株能導致肝臟脂肪累積的下降(實施例4，圖6)。具體地，該菌株降低第4級最大脂肪含量肝細胞的數量(>66%)並增加第3級肝細胞(34-66%脂肪含量)；雖然如此，在未施用該菌株的肥胖動物中，上述類型的肝細胞比例恰好相反，即最大脂肪含量肝細胞數量占絕大多數。在對照組動物中，施用該菌株增加第2級肝細胞(脂肪含量<33%)的數量，並減少第3級肝細胞(34-66%脂肪含量)的數量，此與未接受該菌株治療的動物之情況恰好相反。此證明施用該菌株減少因飲食或不因飲食所誘導的肝臟脂肪之總累積。

因此，CECT7765菌株能用於預防及/或治療肝脂肪變性。該病症被認為是與高能量飲食和肥胖症(存在於60-90%的肥胖個體)相關的病症，但是亦存在非由過重及/或肥胖症所引起的情況，且非限制性實例係由感染和營養或遺傳性代謝病症所引起的情況。

-假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株減少腸上皮細胞中乳糜微粒的數量，亦即減少飲食中能被吸收且以乳糜微粒形 式藉由淋巴和血液到達周圍組織的脂肪之量(實施例6，圖7)。同樣地周圍血液甘油三酯濃度的降低反映該特性(實施例5)。除能成為過重及/或肥胖症的原因之外，乳糜微粒亦能引起脂肪組織中脂肪累積，且自飲食中增加脂肪吸收可能會成為其他病症的原因而不會引起過重或肥胖症，例如但不限制本發明的範圍之動脈粥樣硬化、血脂異常、代謝徵候群、心血管疾病及其他某些由脂肪代謝和葡萄糖代謝所衍生的疾病。血脂異常不僅可為由飲食中的脂肪攝入引起之後果且亦可為由其他代謝病症(諸如並不是必然與肥胖症相關的脂肪細胞胰島素抗性)引起之後果，該抗性使脂肪細胞釋出將被肝臟利用的脂肪酸，進而提高甘油三酯的合成和分泌並增高周圍血液甘油三酯。血脂異常同樣出現在具有遺傳性患病傾向的個體，且亦不必然與肥胖症、胰島素抗性或飲食中的脂肪攝入有關。因此，CECT7765菌株對於預防及/或治療與飲食中過量脂肪攝入有關的疾病和預防及/或治療血脂異常(例如高甘油三酯血症和高膽固醇血症)係有效的。

CECT7765菌株調控葡萄糖代謝病症並增加與胰島素合成和功能相關的周圍血糖濃度(高血糖症)(實施例5)。在其他原因中，因為胰島素抗性或胰島素合成的缺乏亦會發生葡萄糖增高，但是此並不必然與肥胖症有關。

對肥胖和非肥胖個體，CECT7765菌株改善先天和適應性免疫系統細胞的功能，增強彼等對傳染原、抗原或過敏原的應答能力。特別地，對給予高脂肪飲食誘導的肥胖 症動物模型施予該菌株能改善巨噬細胞之吞噬作用和細胞因子合成的功能(實施例3，圖2和3)。本發明的菌株亦改善適應性免疫系統之樹突細胞和T細胞的功能(實施例3，圖4)。

因此，CECT7765菌株具有額外的積極效果，因為其對預防和治療感染及改善諸如在疫苗接種和免疫過程的保護性應答係有效的，此係因為免疫系統的這些功能在過重和肥胖個體中發生改變。此外，本發明的菌株可用於治療或預防其他與肥胖症和過重相關或者不相關的免疫抑制(基本上屬巨噬細胞、樹突細胞及T細胞者)的疾病(例如糖尿病)。

-相較於未接受該菌株治療的個體，接受CECT7765治療的肥胖症或正常體重個體能降低促發炎蛋白之周圍和中樞濃度。因此，本發明的菌株亦能減少周圍系統和中樞神經系統之TNF-α合成，該物質的合成在肥胖或其他病症之個體係上升的，此導致發生胰島素和瘦素抗性，進而抑制彼等的食欲抑制效果(降低饑餓感)和調節體重和葡萄糖代謝的功能(實施例3)。該菌株亦降低肥胖個體的周圍血液瘦素濃度，該等個體之周圍血液瘦素係升高的，且其對發炎係有效的，並同時增高正常體重個體的瘦素濃度，在該等個體內其對於降低食欲和消耗並增加能量消耗、脂肪氧化及降低體重係起負作用的(實施例3，圖8)。

因此，CECT7765菌株調控蛋白和激素(細胞因子、趨化因子及脂肪因子)的產生，該等物質的合成在肥胖症和 其他相關的疾病(諸如但不限於糖尿病、血脂異常、代謝徵候群、心腦血管疾病及脂肪變性)或者非必然與過重及/或肥胖症相關的其他疾病之個體內(無論是在周圍血液或是中樞神經系統中)被改變，因此能用於治療和預防該等病症。

此外，藉由標準化與過重和肥胖症相關的改變及由此等改變所導致的發炎效應，CECT7765菌株可修復消化道微生物叢的組成，此與增重、胰島素抗性、代謝內毒素症、肝脂肪變性及腸道屏障功能的改變有關(實施例3)。本發明的菌株亦能用於降低病原性或免疫系統有害性(opportunistic)腸桿菌的過度生長，該等菌株直接或間接地與其他潛在病症有關，或者該等菌株具有誘發此等病症的風險。因此，CECT7765菌株亦可用於預防和治療感染及與腸內微生物叢改變有關的疾病。

本發明的一方面關於寄存編號為CECT7765的假小鏈雙歧桿菌菌株。該菌株已於2010年7月21日寄存於Colección Española de Cultivos Tipo(西班牙生物材料培育中心；CECT)且給予寄存編號CECT7765。該國際寄存機構的地址是：Universidad de Valencia/Edificio de Investigación/Campus de Burjassot/46100 Burjassot(巴倫西亞)。

本發明的CECT7765菌株的科學分類如下：界：細菌/門：放線菌/目：雙歧桿菌目/科：雙歧桿菌科/屬：雙歧桿菌屬/種：假小鏈雙歧桿菌。

該菌株的特徵在於：

-CECT7765細菌氧化或醱酵的物質是：D-阿拉伯糖、核糖、B-甲基-D-木糖苷、半乳糖、D-葡萄糖、α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙醯基葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖及木糖醇。

-CECT7765具有下述酶催化活性：正-硝基苯基-ßD-吡喃半乳糖苷酶和精氨酸二水解酶。

-該菌株生長的溫度範圍介於31至42℃之間，最適生長溫度是37℃。

-該菌株生長的pH範圍是5至8，最適生長pH是7。

此外，該菌株在胃腸應激條件下呈穩定(酸性pH和高膽汁濃度)。在胃條件(胃蛋白酶3g/l，pH值3和2.5)下培養平均胃排空時間(2h)後，其活力為64-95%，在膽汁鹽的存在下(0.5和1%)，其生長保持於80-90%。其亦能抵抗技術保護的操作條件(冷凍、冷凍乾燥等)和食品製備條件(冷藏、冷凍乾燥、醱酵等)，且亦能在不同的工業範圍的微生物生產培養基上生長。例如，該菌株在牛奶和MRS商業實驗用培養基中能等同生長，且在GEM工業生產培養基中具有更好的對數單位。體內口服給藥後，其能在小腸運輸中存活，根據初始施用量並取決於個體及分析的樣本類型和施用後的時間，表示其僅降低1-2個對數單位。所有該等特徵皆確保其在腸內的活力、持久性及有效性。

本發明的另一優選實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌 CECT7765菌株的衍生菌株，其中該菌株能保持或改進本發明該等能力。該衍生微生物可藉由天然方法或有意地藉由本領域已知的突變產生，例如但不限於在突變或應激誘導劑的存在下培養原始微生物，或者藉由基因工程的方法修飾特定基因。根據更優選的實施態樣，假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株的衍生菌株是經過基因修飾的突變株。術語突變菌株或衍生菌株在使用中係無差別的。

假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株或其任何突變株或衍生物可以任何一種能產生該效果的形式使用，例如根據本發明優選的實施態樣，假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株係以活細胞的形式(可經培養或不經培養的)，或者根據本發明的另一優選的實施態樣，該菌株係以非活細胞的形式(可由本領域之已知技術失活的“死”細胞，例如但不限於加熱、冷凍或紫外線照射)。

下文中提到的在優選實施態樣中該假小鏈雙歧桿菌菌種的任何細菌菌株都被認為是“本發明的菌株”或“發明的菌株”。

本發明的另一方面關於包含本發明菌株的微生物組合。該微生物組合是本發明菌株的一組細胞，或是至少一種本發明菌株的細胞與同種不同菌株或者不同種或者其他分類學微生物組群中的一組細胞所組成的。該微生物組合中細胞可以是非活性或活性細胞，且在任何生長或發展狀態的階段(潛伏期、指數期、穩定期等)，並不考慮彼等的形態。

本發明優選的實施態樣關於微生物組合，其中該微生物組合包括至少一種不是本發明菌株的微生物，例如但不限於能夠成為該組合的部分的微生物係：

-至少一種其他的雙歧桿菌屬菌株，非限制性實例是長雙歧桿菌CECT7347菌株或者其他假小鏈雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌長形亞種、長雙歧桿菌嬰兒亞種、乳雙歧桿菌乳亞種、乳雙歧桿菌動物亞種或青春雙歧桿菌種菌株。

-至少一種腸道、食品或環境來源的乳酸菌。該乳酸菌選自下列細菌，其包含但不限於：乳桿菌屬、乳球酸屬、腸球菌屬、丙酸桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬(weissella)、片球菌屬或鏈球菌屬。

-至少一種其他腸道、食品或環境來源的原核生物系統發生群(phylogenetic group)、屬或種，例如但不限於：古細菌、厚壁菌、硬壁菌、變形菌、放線菌、疣微菌、梭桿菌、產甲烷菌、螺旋體、纖維桿菌、脫鐵桿菌、異常球菌、棲熱菌、藍細菌、甲烷桿菌、消化鏈球菌、瘤胃球菌、糞球菌屬、Subdoligranulum、Dorea、丹毒絲菌、Anaerofustis、兼性雙球菌、羅斯氏菌(Roseburia)、Catenibacterium、小桿菌、Anaerotruncus、葡萄球菌、微球菌、丙酸桿菌、大腸桿菌、普拉梭菌、擬桿菌、parabacteroides、普氏菌、真細菌、疣微菌(Akkermansia)、芽孢桿菌、丁酸弧菌或梭狀芽孢桿菌；

-至少一種真菌或酵母菌株，例如但不限於：酵母菌 屬、念珠菌屬、畢赤酵母屬、德巴厘酵母屬、球擬酵母屬、麯黴屬、根黴菌屬、毛黴菌屬或青黴菌屬。

下文中提到的之前的段落中所描述的任何微生物組合都被認為是“本發明的微生物組合”或“發明的微生物組合”。

本發明的另一方面關於由本發明的菌株或本發明的微生物組合所獲得的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合。本發明亦包括由CECT7765菌株或與其他食品、植物製品和藥物成分一起的本發明之微生物組合所得到的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合。

細菌的細胞組分可包括細胞壁組分(例如但不限於肽聚糖)、核酸、膜組分、或其他諸如蛋白質、脂質和碳水化合物及彼等之組合，例如脂蛋白、糖脂或糖蛋白。代謝物包含因細菌在生長過程、加工處理(例如但不限於食品或藥物的製備過程)及產品儲藏或胃腸運輸的代謝活動中所產生或經修飾的任何分子。該等代謝物的實例包括但不限於：有機酸和無機酸、蛋白質、多肽、胺基酸、酶、脂類、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、維生素、鹽、金屬或核酸。分泌分子包括任何細菌在生長過程、加工處理(例如食品或藥物的製備過程)及產品儲藏或胃腸運輸中所排出或釋放的任何分子。這些分子的實例包括但不限於有機酸和無機酸、蛋白質、多肽、胺基酸、酶、脂類、碳水化合物、脂蛋白、糖脂、糖蛋白、維生素、鹽、金屬或核酸。

本發明的另一方面關於包含本發明的菌株或微生物組合及其細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合的組成物。

組成物通常定義係一組組分，其包含至少任何濃度的本發明的菌株，或至少本發明菌株的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合。

醫藥組成物是一組組分，其包含至少任何濃度的本發明的菌株，或至少本發明菌株的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合，其具有至少一種能改進個體體力或心理狀態的應用，其包含改進健康狀況。

術語“藥物製劑”的含義有限，只是指“醫藥組成物”，正如本發明所定義者，因為藥物製劑對個體必須包含保護性或治療性效果，例如生理效果。術語“藥物製劑”將在下文中定義。

本發明之另一優選實施態樣關於組成物，其中該組成物是醫藥組成物。在更優選的實施態樣中，醫藥組成物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體及/或賦形劑。

術語“賦形劑”是指能幫助吸收本發明的組成物中任意一組分的物質，其能夠固定該組分，或者於給予黏稠性或增加口味使其味道佳的意義上，其有助於醫藥組成物的製備。因此，賦形劑應當具有能夠保持組分相互連接的功能(例如澱粉、糖或纖維素)，增甜功能，著色功能，保護藥物製劑的功能，例如將其與空氣及/或水汽隔離，作為藥片、膠囊或其他存在形式的填充物，例如磷酸氫鈣，分解 功能，以便幫助組分的溶解和腸道吸收，此等賦形劑並不排除該段中未提及的任何一種類型的賦形劑。因此，術語“賦形劑”定義這樣的物質，其包括在格林形式(galenic forms)中，加入賦形劑至活性成分，或者彼等的組合，以確保製備和穩定性，修飾醫藥組成物的感官特性或確定醫藥組成物的理化性質和生物活性。“藥學上可接受的”賦形劑必須允許醫藥組成物中化合物的發揮活性，亦就是必須與該組分相容。

“格林形式或劑量形式”是指適於構成藥物製劑的活性成分和賦形劑。其是由醫藥組成物的製造商所提供的方式及施用的方式加以決定。

“載體”或媒質優選為惰性物質。載體的功能是便於加入其他化合物以確保更好的劑量和施用或者給予醫藥組成物黏稠度和形狀。因此，載體係用於藥物製劑中，將本發明的醫藥組成物的組分稀釋至特定的體積或重量，或者即便不稀釋該組分，亦能夠產生更好之劑量或施用，或者給予藥物製劑黏稠度和形狀。當呈現形式是液體時，藥學上可接受載體是稀釋劑。

此外，賦形劑和載體必須是藥學上可接受者，亦就是允許並評價賦形劑和載體，以使彼等對所施用的有機體無害。

在另一更優選的實施態樣中，醫藥組成物進一步包含其他活性物質。除了需要之治療效果外，其中該醫藥組成物可能亦需要施用其他治療劑，因為額外的根本原因使得 極需要且強烈建議使用本發明的化合物與其他治療劑的組合。術語“活性成分”是指任意的，不考慮是人、動物、植物或者化學來源或其他類型者，能為組成藥物製劑並貢獻合適活性的物質。

在各種情況下，藥物產品的呈現形式將適應於所使用的施用類型，因此本發明的組成物能夠在治療有效量下，以溶液形式或者其他臨床上所允許的劑量形式呈現。本發明的醫藥組成物可以製備成固體、半固體、液體或氣體形式，例如藥片、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、針劑、吸入劑、凝膠、微球或氣溶膠。根據本發明更優選的實施態樣，本發明的醫藥組成物以適合口服施用的形式呈現。

適合口服施用的形式是指能夠允許口服施用的物理條件。該適合口服施用的形式選自但不限於：滴劑、糖漿、草藥茶、酏劑、懸浮液、即時懸浮液、可飲用小瓶、藥片、膠囊、顆粒、扁囊劑、藥丸、小球、錠劑、片劑或冷凍乾燥製劑。

醫藥組成物的另一可能者係適合經舌下、鼻、鞘內、支氣管、淋巴、直腸、經皮或吸入的方式施用。本發明的菌株、微生物組合及自上述菌株或微生物組合所獲得的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合可與例如但不限於脂質體或膠團相連接。

在此意義上，表述“治療有效量”是指醫藥組成物中成分的量，此量係指施予哺乳動物(優選為人)時，足以引起 預防及/或治療如下定義的疾病或哺乳動物(優選為人)的感興趣的病理條件。隨著以任何形式存在的本發明菌株、本發明的微生物組合及自上述菌株或微生物組合所獲得的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合的活性不同，治療有效量亦為不同，治療有效量亦會隨著化合物的代謝穩定性和化合物作用的持久性、患者的年齡、體重、健康狀況、性別和飲食、施用的方法和時間、排泄率、藥物的組合、特定疾病和病理條件的嚴重程度以及正在接受治療的個體的不同而不同，但是此可根據本領域技術人員的知識和本說明書加以確定。

本發明另一優選的實施態樣關於組成物，其中該組成物是營養組成物。本發明更優選的實施態樣關於營養組成物，其中該組成物是食品、營養品、補充物、益生菌或共生菌。

本發明的術語“營養組成物”是指食品，在不考慮食用該食品的個體的時候，有利地影響有機體的一或多種功能，以使其能夠提供更好之健康狀況和狀態。因此，該營養組成物可用於預防及/或治療疾病或疾病導致的因素。因此，本發明的術語“營養組成物”可為功能性食品或為特殊營養目的的食品或藥物食品的近義詞。

正如所使用者，術語“營養物”是指食品中分離的物質，並以對健康具有有利影響的劑量形式使用。

正如所使用者，術語“益生菌”是指活的微生物，當其以合適的量提供時，對於宿主有機體的健康有益。

正如所使用者，術語“共生菌”是指那些含有益生素和益生菌的混合物的食品。其通常包含利於生長及/或代謝活性的益生組分，及總體與諸如但不限於雙歧桿菌與低聚果糖或低聚半乳糖相組合的益生菌效果。

術語“補充劑/物”是“膳食補充劑/物”、“營養補充劑/物”或“食品補充劑/物”之任意近義詞，是一種“食品成分”，旨在補充飲食。膳食補充劑/物的某些實例包括但不限於維生素、礦物質、植物產品、胺基酸和食品組分，例如酶、內分泌腺萃取液。其並不是速食食品的替代物或作為膳食或飲食的單一組分，而是作為飲食的補充。

根據更優選的實施態樣，食品選自：乳製品、植物產品、肉類產品、點心、巧克力、飲料或嬰兒食品。乳製品選自但不限於：醱酵乳產品(例如但不限於優酪乳或乳酪)或非醱酵乳產品(例如但不限於霜淇淋、奶油、人造奶油、乳清)。植物產品選自但不限於醱酵或不醱酵的任何形式的穀物。飲料可包括但不限於任何果汁或非醱酵乳。

本發明的另一更優選實施態樣關於本發明的任意組成物，其中該組成物含有濃度為每克或每毫升最終組成物中10³至10¹⁴菌落形成單位(cfu)的菌株。菌株濃度是合適之治療有效量或營養有效量的濃度。營養組成物和藥用組成物可以製成但不限於固態、半固態、液態或氣態的形式，諸如片劑、膠囊、微膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、糊劑、栓劑、針劑、吸入劑、凝膠、微球或氣溶膠。

以下的任何組成物可作參考，一般組成物、醫藥組成 物或營養組成物，正如之前用術語“本發明的組成物”或“發明的組成物”所定義者。

本發明的另一方面關於假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株於製備醫藥組成物、藥物製劑或營養組成物之用途。本發明的另一方面關於本發明的菌株或本發明的微生物組合或其細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合或本發明的組成物於製備營養組成物、藥物製劑或營養組成物之用途。在該段中所定義的任何醫藥組成物都能用於製備藥物製劑。

本發明的藥物製劑可供人或獸使用。“人類使用的藥物製劑”是指任意的物質或物質組合，其具有能治療或預防人疾病的特性，或者為恢復、糾正或修改生理功能或能建立醫學診斷的目的，藉由發揮藥理學、免疫學或代謝的作用，使用或施用於人體。“獸醫使用的藥物製劑”是指任意的物質或物質組合，其具有能治療或預防動物疾病的特性，或者為恢復、糾正或修改生理功能或能建立獸醫診斷的目的，藉由發揮藥理學、免疫學或代謝的作用，施用於動物。用於添加至飼料中而製備的“加藥飼料的預混合物”同樣被認為是“獸醫藥物製劑”。

本發明的另一優選實施態樣關於本發明的假小鏈雙歧桿菌菌株、CECT7765菌株、或本發明的微生物組合、或其細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑或營養組成物以預防及/或治療過重、肥胖症或治療及/或預防任何與之相關的病理 或功能異常(例如免疫系統功能失調)之用途。

正如所能理解者，“治療”是指控制由個體(優選哺乳動物，更優選人)的疾病或病理狀況所產生的效應，其包括：(i)抑制疾病或病理情況，亦即阻止彼的發展；(ii)緩解疾病或病理情況，亦即使疾病或病理情況或其症狀之發生復原；(iii)穩定疾病或病理情況。

正如所理解者，術語“預防”包括預防疾病的發生，亦即預防個體(優選哺乳動物，更優選人)發生疾病或病理情況，特別是當該個體具有患病的潛在風險。

正如所使用者，術語“過重”係指病理之特徵在於個體的體重指數BMI等於或大於25。BMI是個體的體重與身高關係的測量值。BMI的計算公式如下：體重(kg)/身高²(m)。過重的特徵是25BMI<30。

當BMI等於或大於30時，個體就是“肥胖症”。肥胖症分為不同的等級，而BMI>40的個體被認為是病態肥胖症。肥胖症是一種臨床狀態，在人和其他哺乳動物中，脂肪組織中能量的累積超出健康的極限。脂肪累積導致不同組織中的脂肪沉積、過重、肥胖症及一系列與上述過重或肥胖症相關的病症，例如但不限於第2型糖尿病和妊娠期糖尿病、血脂異常(尤其是高脂血症和高膽固醇血症)、心血管疾病、高血壓、脂肪肝(尤其是非酒精性脂肪肝或肝脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化或肝炎)、代謝徵 候群、癌症、感染等。上述病症及其與過重或肥胖症之間的聯結係屬本領域所習知者(諸如例如WO/2010086454或WO/2008119110)。因此，使用藥物製劑、醫藥組成物或營養組成物以預防及/或治療與肥胖症相關的病症是合理的，此係因為已廣泛證實該聯結，因此正如本領域技術人員所能預期者，使用假小鏈雙歧桿菌菌株或本發明的菌株能預防因過重及/或肥胖症所導致的疾病之發生。

儘管BMI通常被用於確定個體是否罹患肥胖症，然而亦有其他參數可達到此目的。絕對腰圍(罹患肥胖症的個體中，男性>102cm(中度肥胖症)，女性>88cm)或者腰臀比(罹患肥胖症的個體中，男性>0.9，女性>0.85)亦被用於測量肥胖症。另外一可選的確定是否罹患肥胖症的方法是測量體脂的比例(罹患肥胖症的個體中，男性的體脂約為>25%，女性的體脂約為>30%)。中度肥胖症(主要是男性或腰部肥胖症，以較高的腰臀比例為特徵)是代謝徵候群的重要危險因素，其能強烈使個體傾向於罹患不限於心血管疾病和第2型糖尿病的一系列變化和危險因素。

肥胖症對於健康的影響被認為是不同細胞和組織中脂肪重量增加的結果，此外進一步還是慢性發炎和免疫系統功能失調的結果，其與代謝病症一起是上述不同病症的原因。

本發明的另一優選實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之組合之用途；或者 本發明的組成物於製備藥物製劑或製備營養組成物之用途，藉以減少肥胖症或過重個體中脂肪組織的生長和分化，及過重或肥胖症前期階段，進而用於預防及/或治療脂肪細胞肥大。正如實施例4和圖5所證實者，本發明的菌株減小脂肪細胞的體積及生命的某個階段(尤其在兒童和青年時期)脂肪細胞體積的增大(肥大)(尤其利於成年階段過重和肥胖症及其他併發症的發生)。特別地，對肥胖動物施予CECT7765菌株會導致小體積脂肪細胞數目的增多及大體積脂肪細胞數目的減少(實施例4，圖5)。

本發明的另一實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合、或者本發明的組成物於製備藥物製劑或製備營養組成物之用途，藉以用於治療肝脂肪變性或脂肪肝。正如本發明實施例4所證實者，對肥胖症動物模型和對照組動物(非肥胖症)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株能降低高脂肪累積的肝細胞數目。總之，此意謂本發明的菌株能降低肝臟的脂肪累積。

假小鏈雙歧桿菌菌株或本發明的菌株能用於治療或預防肝脂肪變性或脂肪肝，該等疾病在前述段中定義為與過重及/或肥胖症相關的疾病。本發明亦關於預防及/或治療與肝脂肪變性惡化相關的病症，其例如但不限於非酒精性肝炎、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、晚期肝疾病或肝癌。此外，假小鏈雙歧桿菌菌株或本發明的菌株能用於該 等或其他的與肝臟脂肪累積和發炎相關的病症，然而此等病症並不是肥胖症或過重之個體必然會發生的而是其他疾病所產生的結果。該等疾病包括例如但不限於營養障礙(例如但不限於吸收不良、蛋白質卡路里營養不良或非經腸營養)、遺傳或非遺傳性代謝病症(例如但不限於第2型糖尿病、無β脂蛋白血症或系統性肉鹼缺乏症)、接觸藥物(例如但不限於類皮質激素或布洛芬)或毒素(例如但不限於酒精))引起的疾病、因感染引起的慢性或急性肝炎、肝硬化、肝纖維化、晚期肝疾病、肝癌或腺垂體障礙。特別是，脂肪變性影響約50%的第2型糖尿病患者。

本發明的另一優選實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合、或本發明的組成物於製備能預防及/或治療因血脂濃度且優選地作為對照組而被用於標準化血液濃度的血液甘油三酯的改變所引起的疾病(例如血脂異常)的藥物製劑或營養組成物之用途。該藥物製劑或營養組成物優選地係用於治療血脂異常。血脂異常優選地係高甘油三酯血症或高膽固醇血症。血脂異常是一類病理狀態，其唯一共同因素是脂質代謝病症，繼發血脂和脂蛋白濃度改變。血脂異常可與或者不與肥胖症、高脂肪飲食的消耗及脂肪吸收的增加有關。反之，在其他病理中，此等改變又與心血管疾病和糖尿病的高風險相關。如實施例5所證實者，在正常和肥胖個體中，本發明的菌株降低脂肪吸收和血液甘油三酯濃度，其證 明對上述的應用係有效。

本發明的另一優選實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑或製備營養組成物之用途，其與未經處理之對照組相比，能減少自飲食所吸收的脂肪量。

如實施例6所示，本發明的菌株減少腸上皮細胞中乳糜微粒的數量，亦即減少來源於飲食的脂肪，而該脂肪被吸收超過50%(實施例6，圖7)。乳糜微粒是飲食來源的脂類的包裝形式且是自腸道向週邊組織所使用的淋巴和血液運輸的形式，藉由此機制，所施用的菌株能限制吸收及在有機體內累積。飲食中脂肪吸收，除藉由增加脂質在脂肪組織中累積使之成為過重及/或肥胖症的原因之外，同樣亦能引起其他的不造成肥胖的疾病，例如但不限制本發明的範圍：動脈粥樣硬化，其特點是動脈粥樣斑增厚動脈內膜，其中脂肪積聚和血脂異常，其特點是改變血脂濃度(甘油三酯及/或膽固醇和相關的脂蛋白)，與高心血管疾病風險相關的疾病，或其他的由脂質代謝與糖代謝的關係改變所造成的病變(例如但不限於胰島素抗性或糖尿病)。

本發明優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合、或本發明的組成物於製備供預防及/或治療因相對於對照組高血糖症 濃度引起之疾病的藥物製劑或營養組成物之用途，因此與未經處理之對照組相比，其能降低個體血糖濃度(高血糖症)並維持血糖的正常生理濃度並調節餐後血糖反應。

無論肥胖症或非肥胖症，胰島素抗性(個體雖然產生足夠的胰島素，然而身體並不能對此進行正常回應)或因缺乏胰島素之合成能引起空腹血糖(高血糖症)的增加及餐後血糖反應的改變，此等導致其他的代謝病症或與藥物的相互作用。本發明的實施例5之優選實施態樣提供實驗支援。術語“由高血糖症濃度引起的疾病”是指比健康個體的正常葡萄糖濃度更高的血糖濃度所導致的健康的改變，亦即空腹時，血糖濃度大約為72至110 mg/dl或者4-7毫莫耳/l，或者餐後一個半小時的血糖濃度大約是<180 mg/dl(或10毫莫耳/l)。該值是近似均值，此係因為必須要考慮每個個體的條件特徵的不同。由高血糖症濃度所引起的疾病包括但不限於：神經病(損傷四肢及/或器官的神經)、視網膜病(損傷眼睛的視網膜)，腎病(損傷可導致腎功能衰竭的腎臟)、心血管疾病(例如高血壓或心肌梗死)、腦血管疾病(例如腦血栓症)。

本發明另一優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或其組合、或本發明的組成物於製備供特異性預防及/或治療糖尿病的藥物製劑或營養組成物之用途。更優選的實施例關於預防及/或治療第2型糖尿病，雖然不是必然的，該病症亦與過重及/或肥胖 症有關。

第2型糖尿病係以胰島素產生和組織中胰島素敏感性的相對缺乏及因此產生的缺乏周圍葡萄糖的利用為特徵。第2型糖尿病占糖尿病患者的80%至90%。該疾病通常在成年時期發生且通常與肥胖症有關。然而，某些藥物和其他原因可能導致此類型的糖尿病。例如，糖尿病常與長期施用類皮質激素有關，常與未進行治療的血友病有關，但妊娠期糖尿病未必與肥胖症有關。

本發明另一優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或其組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑或營養組成物之用途，藉以降低肥胖症或過重個體或者過重或肥胖症前期之脂肪組織的生長和分化，進而用於預防及/或治療代謝徵候群。代謝徵候群係一組代謝病症，其同時增加糖尿病和心血管疾病的風險且包括肥胖症、血脂異常(例如甘油三酯血症和高膽固醇血症)與高血糖症之組合。正如之前的實施例所證實者，本發明的菌株能用於預防和同時治療該等疾病，進而能預防和治療代謝徵候群。

本發明另一優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或其組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑和營養組成物之用途，藉以預防及/或治療相較於對照組與先天性和適應性免疫系統的改變相關 之疾病，因此與對照組相比較能用於改善先天性和適應性免疫系統的功能。該等病症優選地為過重、肥胖症及導致此等免疫功能改變的相關疾病。實施例3提供相關的實驗資料。

術語“與先天性和適應性免疫應答降低相關的疾病”是指先天性和適應性免疫系統的功能呈現免疫抑制的疾病。

本發明另一優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或其組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑或營養組成物之用途，藉以預防及/或治療相攪於對照組與高濃度促發炎蛋白所產生之相關疾病之用途。實施例2和3顯示相關的實驗資料。

促發炎蛋白的實例包括但不限於：細胞因子、趨化因子及脂肪因子。促發炎蛋白優選地選自IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16、TNF-α、MCP1及瘦素，或者彼等的任何組合。促發炎蛋白更優選地選自TNF-α、IL-6、MCP1或瘦素或彼等的任何組合。

術語“與促發炎蛋白高濃度相關的疾病”是指因至少一種參與不同組織的發炎反應(促發炎症)的蛋白產生所引起的疾病。某些與促發炎蛋白高濃度相關的疾病亦與過重及/或肥胖症有關，例如但不限於第2型糖尿病、妊娠糖尿病、代謝徵候群、脂肪肝、非酒精性肝炎、高血壓、血脂異常、心血管疾病、動脈粥樣硬化，脂肪性肝炎或癌症。其他與促發炎蛋白高濃度相關的疾病並不與過重及/或肥 胖症相關或者在非肥胖症的時候亦能出現，例如但不限於前述疾病(例如糖尿病)和其他諸如變應性發炎的疾病。

本發明另一優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或其組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑或營養組成物之用途，其相較於未經處理之對照組能降低肥胖個體的瘦素濃度及/或增加非肥胖個體內該激素的濃度。在非肥胖個體內，瘦素的增加會導致消耗減少及能量消耗增加和脂肪氧化。相反地，在肥胖個體內，瘦素濃度的減少會導致代謝病症正常化並減輕發炎。

本發明另一優選的實施態樣關於假小鏈雙歧桿菌菌株、或本發明的菌株、或本發明的微生物組合、或其相應的細胞組分、代謝物、分泌分子或其組合、或本發明的組成物於製備藥物製劑或營養組成物之用途，藉以修復腸道內微生物叢的組成或者減少腸道內腸桿菌的濃度。在更優選的實施態樣中，腸道內微生物叢的組成之修復或者腸道內腸桿菌濃度之減少是在過重個體、肥胖個體或患有與之相關的疾病的個體內實施。

作為一個非限制性實例，與未經處理之對照組相比較，腸道內微生物叢的修復可以基於腸道內腸桿菌濃度的減少和雙歧桿菌及/或乳桿菌的增加。如實施例3.6所觀察者，施用本發明的菌株導致結腸中雙歧桿菌總濃度增加至少一個對數單位且諸如腸桿菌的潛在致發炎性細菌降低至少 0.5個對數單位。此亦意謂能自腸道向周圍組織(例如肝臟)傳送的促發炎信號減少，進而肥胖或非肥胖個體內此等周圍組織會受到不同病症的影響。

本說明書和申請專利範圍中所使用的術語“包含”及彼的變體並未試圖排除其他技術特徵、附加物、組分或步驟。對於本領域技術人員而言，本發明的其他目的、優點及特徵能部分地自本說明書及本發明的實驗推論。下述的圖式及實施例係用於詳細說明而非限制本發明。

本案發明人藉由實施下述之檢測以說明本發明。本發明所提供的下述特定實施例僅為說明本發明之精神。該等實施例僅作為說明目的而不能被解釋為對所請求專利的發明之任何限制。因此，該等實施例並非試圖限制本申請案的範圍。

實施例1：假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株的分離和鑑定

假小鏈雙歧桿菌屬菌株係自健康的母乳餵養小鼠的糞便中分離，該等小鼠在進行分析前至少一個月內未食用含有雙歧桿菌的食品，亦未經抗生素處理。樣本保持於4℃下，在採集後不到2小時內進行分析。2g樣品溶解於含有130mM濃度的NaCl(PBS)的10mM磷酸緩衝液中，使用Lab-Blender 400振盪器(stomacher)(Seward Medical,London,UK)均質化3分鐘，稀釋在蛋白腖水中。不同十 進位稀釋的0.1ml的等分試樣接種在含有0.05%半胱胺酸(Sigma,St.Louis,MO；MRS-C)和80 μg/ml莫匹羅星(mupirocin)的MRS瓊脂(Man Rogose and Sharpe；Scharlau,Barcelona)中。經37℃厭氧條件下(AnaeroGen,Oxoid,UK)培養48小時後，選擇分離的菌落，藉由革蘭氏染色研究其形態，從而確定彼等的特性。分離菌落的特性係藉由對總DNA的16S RNA基因進行定序而確定。使用引子27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’：序列號2)和1401r(5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’：序列號3)擴增該片段序列，並使用GFX^TMPCR商業系統(Amershan,Bioscience,UK)進行純化。進一步利用引子530f(5’-GTGCCAGCAGCCGCGG-3’：序列號4)和U-968f(5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’：序列號5)，根據其他作者描述的方法進行定序(Gerhard et al.,2001.Appl.Environ.Microbiol.,67：504-513；Satokari et al.,2001.Appl.Environ.Microbiol.67,504-513；Favier et al.,2002.Appl.Environ.Microbiol.,68：219-22)。定序使用ABI3700自動DNA序列分析儀(Applied Biosystem,Foster City,CA)。

CECT7765菌株的16S核糖體RNA基因的1.28kb的序列係如序列號1所示。可在GenBank資料庫中使用BLAST演算法搜尋與之高度相關的序列(Altschul et al.,1990.J.Mol Biol.,215：403-410)。

根據序列號1與彼之最相近序列進行對比的結果，其 他的假小鏈雙歧桿菌(例如假小鏈雙歧桿菌B1279菌株，GenBank登錄號NR_037117.1)與彼具有99%同一性。此等結果表示本發明的菌株極可能屬於上述菌種。

菌種的鑑定同樣可利用先前研究所描述的DGGE進行(Satokari et al.,2001.Applied and Environmental Microbiology,67,504-513)。利用引子Bif164和Bif662-GC擴增16S rRNA基因(520pbb)的序列，之後使用通用突變檢測系統電泳設備(Bio-Rad,Richmond,CA)分離該擴增的片段。在凝膠中建立45-55%的變性梯度，其中100%代表7M尿素和40%甲醯胺(體積/體積)。將電泳遷移率與作為參考的其他菌種的菌株進行比較。

如圖9所示，本發明菌株的條帶的電泳遷移率(凝膠道I1：假小鏈雙歧桿菌CECT7765)與另一相同種作為參考菌株者相吻合(假小鏈雙歧桿菌CECT5776)。

本發明的菌株的分子特徵係藉由RAPD分析鑑定，所使用的引子是M13(5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'：序列號6)和Del(5'-CCGCAGCCAA-3'：序列號7)，且依據上述的方法(Hoffmann et al.,1998.Zentralbl Bakteriol.288,351-60；Svec et al.,2010.Antonie Van Leeuwenhoek.98：85-92)。隨機擴增DNA片段的結果證明本發明的菌株(假小鏈雙歧桿菌CECT7765)不同於其他相同種類的菌株。

實施例2：根據活體外調節涉及低級慢性發炎的巨噬細胞 回應的能力選擇假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株

2.1.腸道細菌培養物和懸浮液的製備

將菌株接種於10ml含有0.05%的1%半胱胺酸(MRS-C)的MRS醱酵液(Scharlau Chemie S.A.,Barcelona,Spain)中，培養24小時，接著在37℃的厭氧條件(AnaeroGen；Oxoid,Basingstoke,UK)下培養22小時。離心收集細胞(6,000 g,15分鐘)，用PBS(10 mM磷酸鈉，130 mM氯化鈉，pH 7.4)洗滌兩次，隨後用含有20%甘油的PBS重懸。此等懸浮液的等分試樣在液態氮中冷凍，且保存於-80℃下。藉由在MRSC瓊脂平板上培養48小時後確定冷凍-解凍後的活細胞數目。所有情況下之活力皆大於90%。每個等分試樣用於單獨實驗。為評估死細菌的效力，將其中某些等分試樣進行冷凍失活(3-20℃的冷凍和解凍循環)和熱失活(80℃下30分鐘)。使用NaOH調節以獲得的懸浮液的pH值至7.2，過濾除菌(022 μm孔徑，Millipore,Bedford,MA)以除去任何可能存在的活細菌。直到使用前，等分試樣都儲藏在-80℃下。

2.2.巨噬細胞的培養和刺激

從Raw264.7小鼠巨噬細胞系中得到的細胞在補充添加10%胎牛血清(Gibco,Barcelona,Spain)、鏈黴素(100 μg/ml,Sigma)及青黴素(100 U/ml,Sigma)的杜爾貝克改良伊格爾培養基(DMEM,Sigma,USA)中生長。為實施刺激實驗，細胞在24孔平底聚苯乙烯盤(Corning,Madrid,Spain)中以10⁶細胞/ml的濃度於37℃和5%CO₂條件下進行培養 。1 x 10⁶菌落形成單位(efu)/ml的活菌和死細菌的懸浮液和150μl體積的上清液作為刺激物。使用1 μg/ml從大腸桿菌O111：B4(Sigma,St.Louis,MO)純化的脂多糖(LPS)作為陽性對照組。未受刺激的PBMCs中產生的細胞因子作為陰性對照組。每個實驗中，每種類型的刺激都進行雙重複。離心收集培養上清液並經分級，且在-20℃下儲藏至等分試樣檢測細胞因子和趨化因子。

2.3.細胞因子和趨化因子的測定

根據製造商的說明書，使用ELISA套組(BD Biosciences,San Diego,CA)測量上清液中細胞因子(TNF-α、IL-6、IL10及MCP1)的濃度。

特別地，本發明的目的菌株選自乳桿菌屬或雙歧桿菌屬，因為彼之誘導低濃度促發炎分子(TNF-α和IL-6)和趨化分子(MCP1)的能力，該等分子都涉及巨噬細胞向脂肪組織的遷移及與肥胖症相關的慢性發炎，該肥胖症能導致胰島素和瘦素的抗性(表1)。CECT7765菌株是能誘導產生低濃度TNF-α和IL-6的菌株，且其亦是僅有的2個能誘導低濃度MCP1菌株之一(表1)。選擇本發明的菌株亦因為其能藉由巨噬細胞誘導高濃度的抗發炎性及調節性細胞因子的合成(IL-10，表2)，其能降低肥胖情況下的發炎(表2)。所選擇細菌的免疫性質不同於其他任何乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的腸道細菌，且亦不同於相同菌種的其他菌株，因此此等特徵能使該菌株特別適合治療和預防過重、肥胖 症和相關改變及前面所討論的其他疾病。

TNF-α、IL-6及MCP1的增加係與過重、肥胖症和相關病症有關，但並不是僅僅與該等疾病相關，其亦與由TNF-α、IL-6及MCP1相對於對照組的升高所導致的任何疾病相關，正如本說明書中前述段落所討論者。

實施例3. 施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株對免疫系統細胞的功能、周圍血液和中樞神經系統的免疫和內分泌參數及腸道微生物叢組合和發炎性特性的影響

3.1.本發明目的菌株的培養物的製備

CECT7765菌株在補充有0.05%(w/v)半胱胺酸的MRS醱酵液(Scharlab,SL-Barcelona,Spain)中生長，於37℃和厭氧條件下經培養22小時(AnaeroGen；Oxoid,Basingstoke,UK)。離心(6,000g，15分鐘)收集細胞，經磷酸鹽緩衝液(PBS、10 mM磷酸鈉、130 mM氯化鈉、pH 7.4)洗滌，重懸於10%脫脂奶中。在液態氮中冷凍上述懸浮液的等分試樣，並在使用前保存於-80℃下。藉由在含有0.05%半胱胺酸的MRS瓊脂平板上培養48小時後確定活細胞的數目，其約為90%。每個等分試樣僅解凍一次。

3.2.肥胖動物模型和抽樣

使用C57BL-6成年雄性小鼠(6-8周；Harlan Laboratories)。在控制溫度(23℃)和40-50%大氣濕度下，12小時明/12 小時暗週期飼養小鼠。C57BLACK6小鼠(即C57BL-6或黑6)在人疾病研究中係一種被廣泛使用於基因操控的實驗室小鼠的近親品系。

藉由餵養高脂肪飲食(HFD)的方式產生肥胖動物組，高脂肪飲食提供脂質(60/脂肪，Harlan Laboratories)形式的60%能量，而非肥胖動物施予常規飲食。小鼠能自由獲得水和食物。每週一次監控體重。根據動物倫理委員會標準實施該實驗。

上述動物隨機分為4組(n=6隻/組)：常規飲食飼養組(對照組)，施用本發明目標菌株的對照組(對照組菌株)，高脂肪飲食(肥胖)飼養組，施用CECT7765菌株(肥胖症菌株)的肥胖症組。藉由胃管以每天10⁸cfu/天之劑量施予該菌株7周。對照組和肥胖症組係同樣方式施予水作為安慰劑。

此後，麻醉動物，頸椎脫臼法處死，提取不同的生物樣本。使用ELISA確定周圍血液的免疫參數(細胞因子、脂肪因子和趨化因子)。測量腦樣本上清中的促發炎細胞因子(TNF-α)的濃度，之後該腦樣本經均質機(polytron)均質化後可進行如前述的ELISA實驗。同樣提取糞便樣本，為確定施予本菌株對於微生物組成物的影響及其對活體外培養的巨噬細胞、樹突細胞及T細胞的免疫回應刺激的效果，該等細胞可藉由下述方法得到。

3.3.評估對於巨噬細胞的影響

為表示施予CECT7765菌株對改善先天免疫系統細胞應答的影響，藉由腹腔無菌注射杜爾貝克改良伊格爾培養基溶液(DMEM)(SigmaTM-St.Louis,MO/USA)獲得巨噬細胞，該培養基補充有10%胎牛血清、100μg/ml鏈黴素和100 U/ml青黴素(Sigma Chemical Co.)，該胎牛血清在56℃下失活30分鐘(Gibco,Barcelona,Spain)。從每個實驗組小鼠中獲得的巨噬細胞經DMEM培養基調整其濃度為1x10⁵細胞/ml，在37℃和5%CO₂條件下培養1小時後，使用不含血清的DMEM洗滌孔槽以除去未附著的細胞。繼續培養附著的細胞24小時，之後每組小鼠都經糞便(在PBS中稀釋1/9)刺激，使用1 μg/ml鼠傷寒沙門氏菌LPS(Sigma Chemical Co,Madrid,Spain)作為陽性對照組。在平行實驗中，評估未受刺激的巨噬細胞以獲得基準細胞因子產量。刺激後，收集上清液並使用ELISA(Ready SET Go！Kit,BD Bioscience,San Diego,CA,USA)確定下述細胞因子的濃度：TNF-α、IL6及IL-10。

3.4.評估對樹突細胞和T-細胞的影響

為證明施予本發明的菌株對改善樹突細胞刺激T細胞回應之能力及對適應性免疫影響的影響，確定成熟樹突細胞在混合淋巴細胞反應中誘導CD4+ T細胞的增殖性回應的能力。該實驗是藉由比較從肥胖症和對照組小鼠中提取的細胞的回應實施，該對照組小鼠施予或未施予如前述的本發明的目標菌株。

樹突細胞從小鼠脛骨和股骨的骨髓中產生。提取每個小鼠的脛骨和股骨，無菌條件下除去周圍組織。切割端部後，使用注射器和直徑0.45mm的針藉由PBS沖洗以提取骨髓。獲得的細胞經PBS洗滌一次，經RPMI稀釋成10⁶個細胞的等分試樣，RPMI補充添加有抗生素(100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素)，10%FBS及20ng/ml小鼠GM-CSF，將該等分試樣接種於100mm燒瓶中。第3天，加入10ml培養基，第7天更換新鮮培養基。第8天，藉由輕輕移液收集未附著的細胞。使用PBS洗滌細胞，再經不含小鼠GM-CSF的培養基重懸。

在實施混合淋巴細胞反應之前24小時內，加入LPS(100 ng/ml)活化樹突細胞(DC)。成熟的DC用於刺激CD4+ T細胞。CD4+ T細胞從7-8周齡的C57BL/6小鼠的脾臟中分離得到。摘除脾臟之後，懸浮於含有FBS的PBS中，並濾過尼龍膜，洗滌所獲得的細胞懸浮液一次，重懸於裂解緩衝液中5分鐘。用PBS洗滌兩次後，根據製造商的說明書，用L3T4-CD4+玻璃細珠(Miltenyi Biotec GmbH,Bergish Gladbach Germany)進行陽性選擇，免疫分離CD4+ T細胞(CT)。

為實施混合淋巴細胞反應，將DC等分試樣分佈於96孔槽中，經三重複進行刺激1 x 10⁵ CD4+ T細胞(L)，該T細胞的比例為(L/DC)1：1、1：2、1：4/100 μl培養基，在37℃和5%CO₂條件下培養72小時。使用或不使用作為促細胞分裂劑的ConA(5 μg/ml；Sigma)的DC和CD4+ T細 胞作為對照組。使用ELISA套組(BrdU-colorimetric assay；Roche,Diagnostic,Germany)測定淋巴細胞的擴增，並藉由測定440nm吸光度進行定量。

當對由飲食誘導的肥胖個體施予時，本發明的菌株改善先天性和適應性免疫系統細胞的功能，增加彼等回應感染原、抗原或過敏原的能力。特別地，對高脂肪飲食誘導的肥胖症動物模型施與本發明的菌株改善巨噬細胞之吞噬作用和細胞因子合成的功能(圖1和2)。該菌株的施予增加回應外來過敏原或刺激(酵母/病原體)的腹膜巨噬細胞的呼吸爆發，改善吞噬能力及免疫防禦(圖1)。相較於非肥胖症的對照組，肥胖症動物的該能力顯著降低(圖1)。早期的研究亦顯示，負責清除病原體的巨噬細胞的呼吸爆發在患有糖尿病的個體內亦發生改變(Marhoffer et al.,1992.Diabetes Care,15(2)：256-60)。此外，從肥胖症和對照組動物所提取的腹膜巨噬細胞的培養，及活體外使用病原體的脂多糖(LPS)進行的刺激顯示，施予本發明的目標菌株能改善負責阻止可能性感染的細胞因子(例如TNF-α)的合成(圖2)。當活體內施予時，本發明的目標菌株亦改善樹突細胞和T細胞的功能。將提取自施與過該菌株的小鼠體內的樹突細胞與T細胞一起以不同的比例進行培養孵育(1：1、1：2及1：4)，能提高彼等的增殖和啟動能力，而該等特徵在未施予該菌株的肥胖症動物中是降低的(圖3)。亦發現施用該菌株的肥胖症動物中提取的樹突細胞具有最佳的工作狀態，這是因為在活體外經LPS刺激後能誘導涉 及病原體應答回應的細胞因子(如TNF-α)的高分泌(圖4)。本發明的菌株的此等特性使得其很合適，因為在肥胖症和相關疾病(諸如糖尿病)中，樹突細胞和T細胞的功能發生改變。特別地，樹突細胞的功能性改變與重量增加相關，其係以呈遞抗原和刺激同種異體T細胞的能力下降為特徵(Macia et al.,2006.J Immunol.,177(9)：5997-6006；Verwaerde et al.,2006.Scand J Immunol.,64(5)：457-66))。天然T細胞對刺激源(有絲分裂原或抗原)的促發炎特徵增高，能導致與肥胖症相關的低級慢性發炎，相反地之前暴露於抗原的T細胞具有增殖缺陷，會優選分泌Th第2型細胞因子。所有皆解釋肥胖個體感染的高概率及回應接種和感染的記憶T細胞媒介的應答細胞調控回應的缺失(Karlsson et al.,2010.J Immunol.,184：3127-33)。在糖尿病中T細胞功能缺失，顯示對降低的回應刺激原的增殖能力及合成IL-2的能力(Chang and Shaio.1995.Diabetes Res Clin Pract.,28(2)：137-46)。

在活體內施與本發明的菌株調節細胞因子、趨化因子和脂肪因子的產生，而上述這些因子的合成在肥胖症和相關疾病的周圍血液中是改變的。肥胖症和對照組動物模型所誘導的改變包括促發炎細胞因子TNF-α濃度的降低。脂肪因子瘦素在肥胖症動物中被降低，在肥胖症中增高，並能導致發炎過程。然而，在對照組動物中，該菌株誘導瘦素合成，有助於消耗減少，增加能量消耗和脂質氧化，並預防過重和肥胖症。

3.5.評估大腦對發炎細胞因子濃度的影響

本發明的目標菌株亦能顯著地降低TNF-α在中樞神經系統中的合成，而TNF-α的合成在肥胖症中是上升的，能導致胰島素和瘦素抗性的發生，抑制食欲減退效果(饑餓感的降低)和調節體重與葡萄糖代謝的功能(De Souza et al.,2005.Endocrinology.,146：4192-9)。

3.6.評估對腸道微生物叢組成和發炎特徵的影響

CECT7765菌株修復腸道微生物叢的組成，修復與過重及/或肥胖症及發炎效應相關的變化，及修復與其他病理條件相關的改變，該改變不僅與過重及/或肥胖症有關。施予本發明的菌株增加乳桿菌和雙歧桿菌的數目，並至少降低半個對數單位的腸道內腸桿菌的數目。在微生物叢組成中，此等改變額外地降低促發炎特性並增強抗發炎特性。與未施予菌株的肥胖症動物相比較，施予該菌株的肥胖症動物的微生物叢都能誘導巨噬細胞和樹突細胞低濃度合成促發炎細胞因子(例如TNF-α)及高濃度合成抗發炎性細胞因子IL-10(實施例3，圖2和4)。腸道微生物叢的改變被認為是能導致增重、胰島素抗性、肥胖症及糖尿病的可能發炎刺激之一(Cani and Delzenne 2009.Curr Opin Pharmacol.,9(6)：737-43)，該等改變亦會引起其他類型的病理狀態。

實施例4. 施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株對肝臟和脂肪組織的影響

如實施例3的相同小鼠和相同實驗組，其中兩組施予本發明的目標菌株，隨後使用相同的方案。處理時間後，麻醉動物，頸椎脫臼法處死動物，提取脂肪組織(附睾)和肝組織樣品，經生理鹽水洗滌，經具有10%福馬林的緩衝液固定，包埋在石蠟中並切成經蘇木精-伊紅染色的4-5μm小段，脂肪變性(肝臟脂質的累積)的嚴重程度係藉由明視場光學顯微鏡(Olympus)分析每個固定片段的10個視場進行確定，根據下述等級進行：1級，無脂肪變性；2級，當肝細胞的脂肪占不到細胞的33%；3級，當肝細胞的脂肪占細胞的34-66%之間；4級，當肝細胞的脂肪占細胞的66%以上。脂肪細胞的體積係藉由使用NIS ElementsBR2.3軟體進行圖像分析確定，在每個實驗組和組織類型中評估至少100個細胞。

本發明之的目菌株降低附睾組織中脂肪細胞的體積，而在生命的特定時期(兒童期和青春期)，該細胞體積的增 大(肥大)有助於成人期發生過重和肥胖症，並與消耗和能量消耗的失衡有關(Macia et al.,2006.Genes Nutr.,1：189-212)。相反地，脂肪細胞體積的減小與胰島素抗性的降低和葡萄糖濃度的降低有關(Varady et al.,2009.Metabolism 58：1096-101)。特別地，在肥胖症動物模型體內施予本發明的目標菌株導致大小範圍在1,000至2000 μm²的小體積脂肪細胞的增加，而在未施予該菌株的肥胖症動物中，大小範圍在4000至6000 μm²的大體積脂肪細胞增加(圖5)。在非肥胖症動物中亦觀察到相似的結果。

脂肪細胞體積的增大亦與肝臟中增高的脂肪酸供應相關，增高的脂肪酸供應導致肝脂肪變性及其併發症，此菌株亦有助於預防或改善該改變。因此，例如假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株減少脂肪細胞的體積，即彼對在此類細胞的發生過程中治療這種能導致細胞肥大的改變是有用的，而細胞肥大將會維持很長時間，進而引起過重和肥胖症及其他未必與肥胖症相關的病症。

本發明的目標菌株減少與高脂肪飲食消耗、肥胖症和其他諸如非酒精性肝炎的不同病症相關的脂肪在肝臟中的累積(脂肪變性)(Musso et al.,2010.Hepatology 52：79-104)。特別地，對肥胖症動物模型施予本發明的菌株導致含有高脂肪累積的第4級肝細胞(佔據超過細胞的66%)的減少及含有相對含量脂肪的第3級肝細胞(佔據細胞的34-66%)的增加，然而在未施予該菌株的肥胖症動物中效果恰 好相反。在對照組動物中，施予該菌株係以減少第3級肝細胞為代價而增加第2級肝細胞(脂肪佔據不到肝細胞的33%)，但未施予該菌株的對照組動物的情況恰好相反(圖6)。

實施例5. 施與假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株對周圍血液中葡萄糖、胰島素、甘油三酯及膽固醇濃度的影響

如實施例3的相同小鼠和相同實驗組，其中兩組施予本發明的目標菌株，隨後使用相同的方案。處理時間後，麻醉動物，藉由頸椎脫臼法處死動物，提取周圍血液樣本，利用比色法(Química Clínica Applicada,SA,Amposta,Spain)確定葡萄糖、甘油三酯及膽固醇的濃度，利用ELISA方法(BD Bioscience,San Diego,CA,USA)確定胰島素濃度。此外，在處死動物前確定餐後血糖反應或葡萄糖耐受度。禁食一段時間之後，測量基準葡萄糖濃度，然後對每隻小鼠施予2g/千克體重劑量之葡萄糖，每15或30分鐘使用反應帶(Ascensia Esyfill,Bayer)和相應的血糖儀(Ascensia BRIO,Bayer)測量葡萄糖，檢測應當在30和550 mg/dl之間。

活體內施予本發明菌株，藉由降低肥胖症禁食動物的周圍血液中葡萄糖濃度以調節葡萄糖代謝，例如在肥胖症小鼠中檢測葡萄糖的高血清濃度492.7(SD 18.3)mg/dl，藉由施予本發明的菌株使之正常化，達到316.5(SD 20.5)mg/dl，與胰島素濃度減少成比例。此外，對肥胖症動物 施予本發明的目標菌株減少餐後葡萄糖最大值(411.7[SD 49.9]對352.0[25.8])並減少葡萄糖曲線下的面積(5.422對4.779cm²)。血漿葡萄糖濃度的增加及口服施予後持續的高濃度顯示胰島素合成或胰島素回應或其他原因的改變，且此可被本發明的目標菌株正向調節，降低胰島素抗性和糖尿病的發生風險，並改善治療。

活體內施予本發明的菌株能調節脂類代謝，特別是降低肥胖症動物周圍血液中甘油三酯和膽固醇的濃度；例如，在肥胖症小鼠中檢測高血清甘油三酯濃度196.0(SD 14.3)mg/dl，其經施予本發明的菌株後被顯著降低至147.5(SD 12.5)mg/dl；同樣地，肥胖症動物的高血清膽固醇濃度146.9(SD 12.7)mg/dl經施予本發明的菌株後被顯著降低至94.4(SD 5.7)mg/dl。

實施例6. 施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株對腸道內源自飲食的脂質吸收的影響

如實施例3的相同肥胖症模型和相同實驗組，其中兩組施予本發明的目標菌株，隨後使用相同的方案。處理時間後，麻醉動物，藉由頸椎脫臼法處死動物，分離腸道組織樣本，經生理鹽水洗滌，並固定於具有10%福馬林的緩衝液，包埋在石蠟中，並切成經蘇木精-伊紅染色的4-5μm切片。在明視場光學顯微鏡(Olympus)下對每個固定切片中10個視場範圍的每個腸上皮細胞中的乳糜微粒的數目進行計數，其係以乳糜微粒數目/腸上皮細胞表示。如圖7 所示，本發明的菌株降低乳糜微粒的數目，該乳糜微粒在腸上皮細胞中形成超過50%。此結果與實施例5者一致，顯示本發明的菌株降低血液甘油三酯濃度。

圖1顯示對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對涉及吞噬作用的巨噬細胞之呼吸爆發的影響。ND表示使用標準飲食的對照組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT7765。

圖2顯示相較於不同的刺激(脂多糖[LPS]和糞便)，對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對巨噬細胞之細胞因子(TNF-α)合成之功能的影響。ND表示使用標準飲食的對照組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT7765。黑色柱：對照組；淺灰色：LPS組；暗灰色：糞便組。

圖3顯示對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對樹突細胞與T細胞之間的相互作用及彼等之增殖能力的影響。

於施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周的不同實驗組中，肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)的成熟樹突細胞(DC)培養CD4+T細胞(L)。混合物中細胞比例(L/DC)係1：1、1：2及1：4。ND表示使用標準飲食的對照 組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT 7765。

圖4顯示相較於不同的刺激(LPS和糞便)，對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對樹突細胞之細胞因子之合成功能的影響。ND表示使用標準飲食的對照組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT7765。

圖5顯示對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對脂肪細胞發展的影響，其中脂肪細胞的發展係按大小範圍進行分類。ND表示使用標準飲食的對照組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT7765。

圖6顯示對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對脂肪變性發展的影響(肝臟的脂質累積)。

根據脂肪在細胞內累積程度之脂肪肝細胞的數目顯示肝組織的組織切片，其中肝組織係經蘇木精-伊紅染色。ND表示使用標準飲食的對照組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT 7765。

圖7顯示對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對組織切片中 腸上皮細胞內所形成之乳糜微粒數目的影響，其中該組織切片係經蘇木精-伊紅染色。ND表示使用標準飲食的對照組動物；HFD表示高脂肪飲食；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT7765。

圖8顯示對肥胖C57BL/6小鼠(n=6隻/組)和對照組小鼠施予假小鏈雙歧桿菌CECT7765菌株(10⁸cfu/天)達7周對周圍血液瘦素濃度之影響。瘦素(L)係以pg/ml表示；HFD表示使用高脂肪飲食的動物；HFD+P表示高脂肪飲食+假小鏈雙歧桿菌CECT7765；SD表示使用標準飲食的動物；SD+P表示使用標準飲食的動物+假小鏈雙歧桿菌CECT7765。

圖9顯示使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)鑑定本發明的菌株。

M1欄(column)顯示不同的Bx條帶，此等Bx條帶對應下述參考微生物之DNA片段：B1：青春雙歧桿菌LMG11037T；B2：角形雙歧桿菌LMG11039T；B3：長形雙歧桿菌嬰兒亞種CECT4551T；B4：假小鏈雙歧桿菌CECT5776；B5：動物雙歧桿菌乳酸亞種DSM10140T。

M2欄中，B6係兩歧雙歧桿菌LMG11041T；B7係長形雙歧桿菌長形亞種LMG11043T；B8係鏈雙歧桿菌LMG11043T；B9係齒雙歧桿菌CECT687；B10係動物雙歧桿菌動物亞種LMG10508T。

欄I1顯示本發明的CECT7765菌株的條帶。

<110> 高等科學研究委員會

<120> 雙岐桿菌CECT7765及彼於預防及/或治療過重、肥胖症及相關 病症之用途

<140> TW 101108321

<141> 2012-03-12

<160> 7

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1280

<212> DNA

<213> 雙岐桿菌CECT 7765

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子27f

<400> 2

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子1401r

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子530f

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子U-968f

<400> 5

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子M13

<400> 6

<210> 7

<211> 10

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 引子Del

<400> 7

Claims (36)

1. 一種寄存編號為CECT7765之假小鏈雙歧桿菌菌株。
2. 一種由如申請專利範圍第1項之菌株所衍生之菌株。
3. 如申請專利範圍第2項之菌株，其中該菌株係經基因修飾之突變株。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之菌株，其中該菌株係呈活細胞之形式。
5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之菌株，其中該菌株係呈非活細胞之形式。
6. 一種微生物組合，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之菌株。
7. 如申請專利範圍第6項之微生物組合，其另包含至少另一微生物。
8. 如申請專利範圍第7項之微生物組合，其中該另一微生物係腸細菌或乳酸菌。
9. 一種細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合，其係得自於如申請專利範圍第1至5項中任一項之菌株或如申請專利範圍第6至8項中任一項之微生物組合。
10. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之菌株.如申請專利範圍第6至8項中任一項之微生物組合、或如申請專利範圍第9項之細胞組分、代謝 物、分泌分子或彼等之任何組合。
11. 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該組成物係醫藥組成物。
12. 如申請專利範圍第11項之組成物，其中該組成物進一步包含至少一種藥學上可接受之載體及/或賦形劑。
13. 如申請專利範圍第11或12項之組成物，其中該組成物進一步包含另一活性物質。
14. 如申請專利範圍第11至13項中任一項之組成物，其中該組成物係呈適於口服、舌下、鼻腔、鞘內、支氣管、淋巴、直腸、透皮、吸入或非經腸施予之形式。
15. 如申請專利範圍第14項之組成物，其中該組成物係呈適於口服施予之形式。
16. 如申請專利範圍第10項之組成物，其中該組成物係營養組成物。
17. 如申請專利範圍第16項之組成物，其中該組成物係食品、營養品、補充物、益生菌或共生菌。
18. 如申請專利範圍第16或17項之組成物，其中該食品選自乳製品、植物製品、肉製品、點心、巧克力、飲料或嬰兒食品。
19. 如申請專利範圍第10至18項中任一項之組成物，其中該組成物含有介於10³至10¹⁴菌落形成單位(cfu)/克或毫升之最終組成物的菌株濃度。
20. 一種假小鏈雙歧桿菌種之菌株於製備醫藥組成物 、藥物製劑或營養組成物之用途。
21. 一種如申請專利範圍第1至5項中任一項之菌株.如申請專利範圍第6至8項中任一項之微生物組合.如申請專利範圍第9項之細胞組分、代謝物、分泌分子或彼等之任何組合或如申請專利範圍第10項之組成物於製備醫藥組成物、藥物製劑或營養組成物之用途。
22. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於預防及/或治療過重及/或肥胖症。
23. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於預防及/或治療高血糖症及/或糖尿病。
24. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於預防及/或治療第2型糖尿病。
25. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於治療及/或預防肝脂肪變性或脂肪肝。
26. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於治療及/或預防血脂異常。
27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該血脂異常係高甘油三酯血症。
28. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該血脂異常係高膽固醇血症。
29. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥 物製劑或該醫藥組成物係用於治療及/或預防代謝徵候群。
30. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於改善過重個體或肥胖個體相較於未經處理的個體之免疫系統的功能。
31. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於預防及/或治療肥胖個體或過重個體之感染。
32. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於預防及/或治療脂肪細胞肥大。
33. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於減少非肥胖個體相較於未經處理的對照個體之攝食及增加彼等之能量消耗。
34. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於減少與過重、肥胖症及相關病症之發展有關的周圍和中樞濃度之促發炎蛋白的合成。
35. 如申請專利範圍第20或21項之用途，其中該藥物製劑或該營養組成物係用於減少相較於未經處理的對照組腸內腸細菌之濃度。
36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中減少該腸內腸細菌之濃度係於過重或肥胖個體實施。