KR20210005717A - 프로바이오틱 비피도박테리움 브레베 균주 및 상기 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents
프로바이오틱 비피도박테리움 브레베 균주 및 상기 균주를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 및 상기 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 하나 이상의 다른 박테리아 균주 및/또는 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAID일 수 있는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함한다.
현재 바람직한 구체예에서, 본 발명은 예컨대 아세틸살리실산 (아스피린)투여와 관련한 것과 같은 NSAID 투여와 관련한 장 점막 결손 또는 병변과 같은 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베에 관한 것이다.
본 발명은 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하는 방법으로서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 필요로 하는 대상체, 예컨대 NSAID 치료를 필요로 하는 대상체에 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 투여하는 것을 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
현재 바람직한 구체예에서, 본 발명은 예컨대 아세틸살리실산 (아스피린)투여와 관련한 것과 같은 NSAID 투여와 관련한 장 점막 결손 또는 병변과 같은 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베에 관한 것이다.
본 발명은 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하는 방법으로서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 필요로 하는 대상체, 예컨대 NSAID 치료를 필요로 하는 대상체에 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 투여하는 것을 포함하는 방법을 추가로 제공한다.
Description
본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 균주 및 상기 균주를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 현재 바람직한 구체예에서 본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 필요로 하는 대상체에서, 예컨대 NSAID 투여 중, 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주에 관한 것이다.
비스테로이드성 항염증제 (Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs)는 전세계적으로 처방 약품으로서 및 "일반의약품(over-the-counter)" 제제로서 흔히 사용된다. 이들은 두통 및 생리통을 포함하는 많은 일반적인 통증 관련 상태의 단기 치료 및 골관절염, 류마티스관절염, 강직성 척추염, 및 통풍과 같은 만성 염증성 질환의 장기간 치료에 자주 사용된다.
일일 75-325 mg로서 정의되는 저용량 NSAIDS의 만성 사용은 또한 권장되며, 심혈관-보호 특성으로 처방된다. 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAIDs는 심혈관 질환이 있거나 이미 심장마비 또는 뇌졸중을 앓았던 환자에서 심장마비, 혈전 관련 뇌졸중 및 기타 혈류 문제의 위험을 낮추기 위해 매일 사용된 경우 도움이 되는 것으로 나타났다.
또한, 증가하는 증거들은 NSAIDs가 암 및 신경퇴행성 질환의 예방 및 기타 염증성 상태의 치료에 유용할 수 있음을 시사한다.
NSAIDs의 넓은 범위의 적응증 및 치료적 특성으로 인해, 세계에서 가장 많이 사용되는 약 중 일부이다. 2010년에 NSAIDs는 미국 성인의 약 3천만명에 의해 정기적으로 사용되었다. 미국 성인 인구의 1/3 이상 (심혈관 질환으로 알려진 사람의 80%를 포함)이 정기적으로 저용량 NSAIDs를 사용하는 것으로 추정된다.
그러나, 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAIDs의 저용량 사용은 위장 (GI) 상해와 관련되며, 손상의 정도는 용량, 치료 기간, 수반되는 약물 및 환자 위험 프로파일에 따라 좌우된다. 따라서, 아세틸살리실산 (아스피린)은 선진국에서 소화성 궤양 출혈의 가장 두드러진 원인 중 하나로 부상했으며, 2 내지 4배 증가된 상부 GI 출혈의 위험과 관련되고, 수반되는 약물 사용과 함께 증가한다. 일반적으로, NSAIDs를 복용하는 환자는 비사용자에 비해 상부 GI 출혈의 상대적인 위험 및 최대 4.7의 천공을 경험한다. NSAID 사용과 관련된 상부 GI 합병증을 예방하기 위한 전략은 그중에서도 양성자 펌프 억제제(proton-pump inhibitors, PPIs) 및 합성 프로스타글란딘을 포함한다.
도 1은 위장관, 즉, 위, 십이지장, 공장 및 회장으로 구성된 소장 및 대장 (결장)의 개요를 보여준다.
프로바이오틱스로서 제조된 살아있는 박테리아는 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAIDS의 부정적인 부작용을 예방하거나 적어도 감소시키는 대안을 제공할 수 있다. 문헌[Gotteland et al., 2001 (Gotteland M, Cruchet S, Verbeke S. Effect of Lactobacillus ingestion on the gastrointestinal mucosal barrier alterations induced by indomethacin in humans. Aliment Pharmacol Ther. 2001; 15: 11-7)]은 살아있는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG (LGG)의 정기적 섭취가 인도메타신 유도 상해에 대한 위 점막 벽의 완전성(integrity)에 보호 효과가 있을 수 있지만, 장 수준에서는 효과가 없었다는 것을 결론내렸다.
문헌[Wallace, 2013 (Wallace, JL, Mechanisms, prevention and clinical implications of nonsteroidal anti-inflammatory drug-enteropathy, World J Gastroenterol. 2013, March 28; 19(12):1861-1876)]에 따르면, NSAID 장질환의 유병률 및 임상적 의의는 계속해서 대단히 과소 인식되고 있다. NSAID 유도 장질환 및 출혈은 NSAID 유도 위질환에 비해 더 자주 발생한다. 현저한 소장 손상 및 출혈은 약 70%의 만성 NSAID 사용자에서 관찰될 수 있으며, 대부분의 환자에서 상해는 무증상적이다.
NSAID 위질환의 경우와 달리, NSAID 유도 장질환을 위해 입증된 효과적인 예방적 치료가 없고 병인에 대한 이해가 부족하다. 이는 상부 위장관에서 이러한 약으로 인해 유발된 손상보다 더 자주 발생하지만, 진단 및 치료하기가 훨씬 더 어렵다.
NSAID 장질환의 병인은 불완전하게 이해되고 있지만, 박테리아, 담즙, 및 NSAIDs의 장간순환이 모두 중요한 요인이라는 것은 분명하다. 위산 분비의 억제제는 NSAID 장질환을 현저하게 악화시키며, 이러한 효과는 장 마이크로바이옴(microbiome)의 현저한 변화 때문이다 (문헌[Syer, S.D., Blackler, R. W., Martin, R., de Palma, G., Rossi, L., Verdu, E., Bercik, P., Surette M. G., Aucouturier, A., Langella P., Wallace, J.L., NSAID enteropathy and bacteria: a complicated relationship, J Gastroenterol (2015), 50:387-393. doi 10.1007s00535-014-1032-1]).
비디오 캡슐 내시경과 같은 개선된 검출 수단으로, 의사들은 NSAIDs로 인한 소장 손상이 이전에 인식된 것보다 훨씬 더 일반적이고 훨씬 더 심각하다는 것을 더 인식하게 된다.
몇몇의 연구는 NSAID 장질환의 실험 모델에서 프로바이오틱스의 유익한 효과를 입증하였다. 또한, NSAID 유도 소장 상해에 대한 단일 프로바이오틱 (락토바실러스 카제이(L. casei))의 (문헌[Endo H, Higurashi T, Hosono K, et al. Efficacy of Lactobacillus casei treatment on small bowel injury in chronic low-dose aspirin users: A pilot randomized controlled study. J Gastroenterol. 2011;46(7):894-905. doi:10.1007/s00535-011-0410-1]) 또는 프로바이오틱스 칵테일의 (문헌[Montalto M., Gallo A, Curigliano V, D'Onofrio F, Santoro L. Covino M., Dalvai S, Gasbarini A. and Gasbarrini G. Clinical trial: the effects of a probiotic mixture on non-steroidal anti-inflammatory drug enteropathy - a randomized, double-blind, cross-over, placebo-controlled study. Aliment Phamacol Ther 2010; 32: 209-214]) 예방적 효과를 입증한 인간 연구도 있다.
Montalto et al., 2010은 4가지 균주의 락토바실리 (락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus)), 3가지 균주의 비피도박테리아 (비피도박테리움 론굼(B. longum), 비피도박테리움 브레베(B. breve) 및 비피도박테리움 인판티스(B. infantis)) 및 하나의 균주의 스트렙토코커스 살리바리스(Streptococcus salivaris) 아종 써모필러스(thermophilus)로 구성된 칵테일 VSL#3를 시험하였다. 인도메타신 치료 전과 치료 중 VSL#3를 이용한 치료는 NSAID 유도 소장 상해에 대해 위약과 관련하여 건강한 대상체에서 분변 칼프로텍틴(faecal calprotectin, FCC)을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 연구에서는 캡슐 내시경을 수행하지 않았다.
Endo et al., 2011은 락토바실러스 카제이 군 13명 및 대조군 12명을 포함하는 25명의 환자가 무선 캡슐 내시경을 사용하여 소장의 전체 분석 (CE 점수)을 받은 임상 시험이 수행되었다. 대조군의 결과와 비교하여 락토바실러스 카제이 군의 3개월 평가에서 점막 결손(breaks) 수 및 CE 점수의 현저한 감소가 관찰되었다.
["Composition comprising probiotic bacteria capable of restoring the barrier effect of the stomach which is lost during pharmacological treatment of gastric hyperacidity"]라는 제목의 미국특허출원 제2014/072543호 (Mogna Giovanni)는 종: 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 델브루키이(L. delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 브레비스(L. reuteri), 락토바실러스 부치네리(L. buchneri), 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum), 락토바실러스 락티스(L. lactis), 락토바실러스 펜토서스(L. pentosus), 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 안굴라툼(B. angulatum), 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum), 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼(B. catenulatum), 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 비피도박테리움 론굼, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(B. pseudocatenulatum) 및 스트렙토코커스 써모필러스에 속하는, 4.5 내지 5에 포함되는 pH 값에서 위를 콜로니화(colonizing)할 수 있으며, 박테리오신 및/또는 대사산물 및/또는 과산화수소를 생성할 수 있는, 하나 이상의 박테리아 균주를 포함한 약 또는 식품 조성물 또는 보충제로서, 대상체의 위에 하나 이상의 박테리아 균주를 투여하기에 적합한 형태인 약 또는 식품 조성물 또는 보충제를 청구한다.
상기 출원에서 실험 데이터는 제공되지 않았다.
["Composition comprising N-acetylcysteine and/or microencapsulated gastroprotected lysozyme in association with probiotic bacteria capable of restoring the stomach's own barrier effect which is lost during the pharmaceutical treatment of gastric hyperacidity"]라는 제목의 국제공개공보 WO2013/034974 (Mogna et al.)는 N-아세틸시스테인 및/또는 리소자임과 함께 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루키이, 락토바실러스 델브루(L. delbr.) 아종 델브루키이, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부치네리, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 펜토서스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안쿨라툼, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 론굼, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 및 스트렙토코커스 써모필러스 군을 포함하거나 또는 대안으로 이들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 종에 속하는 하나 이상의 박테리아 균주로서, 4.0 내지 5.5에 포함되는 pH 값에서 위를 콜로니화시킬 수 있으며, 박테리오신 및/또는 대사산물 및/또는 과산화수소수(oxygenated water)를 생성할 수 있는 균주를 포함하거나 또는 대안으로 이루어진, 위 과산증을 감소 또는 치료하기 위해 약을 복용하는 대상체의 치료에 사용하기 위한 약 또는 식이 조성물 또는 보충제 또는 의료기기를 청구한다.
이러한 출원은 총 40명의 개체를 포함한 파일럿 연구 결과가 포함된다. 이러한 연구 기초하여, 출원은 유효량의 N-아세틸시스테인을 또한 포함하여, 락토바실러스 람노서스 LR06, 락토바실러스 펜토서스 LPS01, 락토바실러스 플란타룸 LP01, 및 락토바실러스 델브루키이 LDD01의 특정 균주와 연관 투여가 특히 위 수준에서 해로운 박테리아에 대한 보호 벽을 회복시킬 수 있다고 결론내렸다. 더 최근 문헌[Suzuki et al., 2017, (Suzuki T, Masui A, Nakamura J, et al. Yogurt containing Lactobacillus gasseri Mitigates Aspirin-Induced Small Bowel Injuries: A Prospective, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. Digestion. 2017;95(1):49-54. doi:10.1159/000452361)]은 1개월 이상 아세틸살리실산 (아스피린)을 받은 64명의 아세틸살리실산 (아스피린) 사용자가 등록된 시험을 보고하였다. 환자는 6주 동안 락토바실러스 가세리 또는 위약을 포함한 요거트를 1일 2회 받았다. 소장 상해는 요거트 섭취 전후에 캡슐 내시경으로 평가되었다. 환자 증상에 대한 락토바실러스 가세리의 효과는 또한 치료 6주 전후에 위식도 역류 질환 증상에 대한 빈도 척도(FSSG) 및 위장 증상 평가 척도 (GSRS) 설문지를 사용하여 평가되었다. 위약군과 달리, 락토바실러스 가세리 군은 6주 후 소장 점막 결손 및 붉어지는 병변이 현저하게 적었다. FSSG 및 GSRS 점수는 또한 락토바실러스 가세리 군에서 현저하게 개선되었지만, 위약군에서는 그렇지 않았다.
Syer et al., 2015는 동물 모델에서 1일 2회 나프록센 투여의 개시 전 5일 동안 비피도박테리움 아돌레센티스의 1일 1회 투여가 장 궤양화의 상당한 감소를 야기한다는 것을 입증하였다. 그러나, 이러한 출원의 경우 모든 비피도박테리움 종이 효과적인 것은 아니라고 밝혀졌다. 예를 들면, 비피도박테리움 론굼 아종 론굼 JCM 1217은 동일한 모델에서 효과적이지 않았다.
따라서, 예컨대 NSAID 투여 중, 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 있어서 유용할 수 있는 프로바이오틱 박테리아를 확인할 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주에 관한 것이다. 이러한 균주는 MIC 시험에서 모든 관련 항생제에 민감한 것으로 밝혀졌다. 이와 일관되게, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 분석하였을 때 항생제 내성 유전자가 확인되지 않았다. 또한, 균주는 베로(Vero) 세포 분석으로 세포 독성에 대해 시험되었고, 세포 독성이 없는 것으로 밝혀졌다.
실시예 1에 제공된 시험관 내(in vitro) 결과에 기초하여 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주는 안전한 것으로 간주된다.
실시예 2는 경상피 전기 저항 (TEER) 분석 결과를 제공한다. 결과는 균주가 벽 완정성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
아스피린은 위 및 소장의 미란, 궤양 및 출혈과 같은 임상적으로 심각한 관련 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 점막 프로스타글란딘 수준을 감소시키는 사이클로옥시게나제 효소를 억제하는 것 이외에도, 아스피린의 투여는 또한 점액 및 상피 세포 표면 이중층 둘 모두에 존재하는 인지질 층을 파괴하며, 산화적 인산화를 탈공역시킨다. 이러한 과정의 조합은 장 투과성을 감소시키고, 염증성 경로를 유발하여 궁극적으로 세포사멸, 점막 미란 및 궤양을 초래한다 (문헌[Bjarnasson et al. (2018) Gastroenterology, 154, 500-514]).
건강한 대상체에서 아스피린의 급성 투여는 위십이지장 및 소장 둘 모두의 현저히 증가된 투과성을 유도한다. 이 배후의 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았지만, 실험 시험관 내 연구는 아스피린은 세포간 접촉 및 벽 완전성의 핵심 마커 중 하나로 간주되는 밀착연접 단백질 Zonula Occludens-1 (ZO-1)의 발현을 감소시킨다고 시사한다 (문헌[Montalto, M., Maggiano, N., Ricci, R., Curigliano, V., Santoro, L., Di Nicuolo, F., Vecchio, F. M., Gasbarrine, A., Gasbarrini, G. (2004) Digestion, 69(4), 225-228]). 이는 아스피린이 감소된 경상피 전기 저항 (TEER)을 유도하는 방법뿐만 아니라, Caco-2 세포 층을 가로지르는 플루오레세인 아이소티오시아네이트 접합 덱스트란의 플럭스 증가를 유도하는 방법을 보여주는 최근 데이터에 의해 뒷받침되며, 증가된 투과성을 강력하게 시사한다. 또한, 저자들은 ZO-1 단백질에서 활성산소종 (ROS) 형성 및 산화적 스트레스 유도 변형의 증가에 더하여 ZO-1 발현이 감소되는 것을 발견하였다 (문헌[Fukui, A., Naito, Y., Handa, O., Kugai, M., Tsuji, T., Yoriki, H., Qin, Y., Adachi, S., Higashimura, Y., Mizushima, K., Kamada, K., Katada, K., Uchiyama, K., Ishikawa, T., Takagi, T., Yagi, N., Kokura, S. & Yoshikawa, T. (2012) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 303, G927-G936]).
Caco-2 세포 단일층은 장 투과성 모델로서 흔히 사용되는, 인간 결장 선암으로부터 유래된, 잘 확립된 세포주를 나타낸다.
DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주가 경상피 전기 저항 (TEER)에 의해 측정된 Caco-2 세포 단일층을 가로지르는 전기 저항을 증가시킨다는 것이 입증된 실시예 2에 제공되는 시험관 내 결과에 기초하여, 균주는 아세틸살리실산 (아스피린)과 같이 NSAID 치료를 필요로 하는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 잠재적으로 유용한 것으로 간주된다.
아세틸살리실산 (아스피린) 투여는, 심지어 저용량에서도, 점막 염증 및 소장의 상해를 유발하는 것으로 나타났다 (문헌[Endo, H., Sakai, E., Kato, T., Umezawa, S., Higurashi, T., Ohkubo, H. & Nakajima (2015) J Gastroenterol, 50, 378-386]).
위장관의 염증성 상태의 조절은 시토카인을 분비하는 박테리아를 투여함으로써 그에 따라 면역 세포를 활성화시켜 가능하다. 예를 들면, Foligne 및 동료들은 (문헌[Foligne, B., Nutten, S., Grangette, C., Dennin, V., Goudercourt, D., Poirot, S., Dewulf, J., Brassart, D., Mercenier, A. & Pot, B. (2007) World J Gastroenterol, 13(2), 236-243]) 실험 대장염에 대한 박테리아 매개의 생체 내(in vivo) 보호와 시험관 내(in vitro) 박테리아에 의해 유도된 시토카인 프로파일 간의, 특히 IL-10 및 인터류킨 12 (IL-10/IL-12) 비율의 현저한 연관성을 발견하였다. 저자들은 마우스에서 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 유도 대장염에 대한 생체 내 보호가 시험관 내 높은 수준의 "항(anti)"염증성 시토카인 IL-10 및 낮은 수준의 "전(pro)"염증성 시토카인 IL-12을 유도할 수 있는 능력을 가진 박테리아 균주에 의해 매개되는 방법을 보여주었다. 대조적으로, 낮은 IL-10/IL-12 비율을 유도하는 균주는 염증성 대장염을 약화시킬 수 없었다.
따라서, 인간 염증성 세포의 시험관 내 조절은 박테리아에 의해 유도된 전염증성 또는 항염증성 장 환경의 유도를 예측하는 데 유용한 도구이다.
실시예 3은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주가 항염증성 특성을 나타내는 IL-10/IL-12 비율을 증가시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 균주는 아스피린 유도 소장 염증에 대해 유용할 수 있다.
실시예 4는 캡슐 내시경 방법에 의해 포획되고 정량화된 장 손상을 유발하기 위해 건강한 지원자들이 6주 동안 매일 300mg 아세틸살리실산 (아스피린)의 섭취하도록 요구된 대규모 임상 시험의 결과를 제공한다. 대상체는 또한 아세틸살리실산 (아스피린) 섭취 외에 프로바이오틱 또는 위약 치료에 무작위화되었다. 이러한 시험의 주된 평가 변수(endpoint)는 루이스 점수로 측정된 바와 같이, 위약 아암(arm)과 비교하여 활성 프로바이오틱 아암(arm)에서 아세틸살리실산 유도 장 손상에 대한 현저한 보호 효과를 분명히 보여주었다 (문헌[Gralnek IM, Defranchis R, Seidman E, Leighton JA, Legnani P, Lewis BS. Development of a capsule endoscopy scoring index for small bowel mucosal inflammatory change. Aliment Pharmacol Ther. 2008;27(2):146-154. doi:10.1111/j.1365-2036.2007.03556.x]).
실시예 5는 위약군 대 DSM 32356을 투여받은 대상체에서 연구 대상체로부터의 PGE2 및 TXB2의 혈청 농도 결과를 제공하며, 균주가 아스피린에 의해 유도된 COX 억제에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이는 DSM 32356의 보호 작용이 아세틸살리실산 (아스피린)의 특정 심혈관 특성을 방해하지 않음을 시사한다.
실시예 6은 마지막 투여 후 1일에 채취된 혈액 샘플로부터의 전신 시토카인 프로파일링을 제공한다. DSM 32356의 전신 효과가 없음을 나타내면서 위약군 및 활성군 간의 현저한 차이가 없다는 것이 밝혀졌다.
실시예 7은 연구 제품 순응도(compliance)를 입증하는, DSM 32356으로 개입 중 비피도박테리움 브레베의 상대적 풍부도가 증가한 것을 보여준다. 추가로, 분변 생물군(biota) 조성물을 조사하고, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356을 이용한 개입은 분변 미생물총(microbiota) 다양성을 현저하게 변화시키지 않는 것으로 나타났다.
실시예 8은 DSM 32356과 아세틸살리실산의 공동 배양 실험 결과를 보여주며, DSM 32356이 아세틸살리실산 (아스피린)을 성능 저하시키는 것으로 보이지 않는다는 것을 보여준다.
이에 따라, 본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베를 필요로 하는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베에 관한 것이다.
도 1
도 1은 위장관, 즉 위, 십이지장, 공장 및 회장을 포함하는 소장, 및 대장 (결장)의 개요를 보여준다.
도 2
도 2는 시간 경과에 따른 기준선의 백분율로서의 경상피 전기 저항 (TEER)을 설명하며, 점은 평균이고, 오차 막대는 SDs이며 (A), 0-15 시간의 TEER 곡선 아래 영역 (AUC), 막대는 평균이고, 오차 막대는 SDs이다 (B). **** p<0.0001.
도 3
4명의 기증자로부터의 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 자극 수지상 세포의 시험관 내 시토카인 발현. 데이터는 평균 ± SEM (pg/ml)로서 표시된다. A. IL-10의 분비, B. IL-12p70의 분비, C. IL-10:IL-12p70 비율. **** p<0.0001.
도 4
도 4는 임상 시험 설계 및 방문 개요를 보여준다. 방문 1은 스크리닝 방문이었다. 그 다음 방문 2에서 기준선 측정이 측정되기 전, 대상체는 활성 DSM 32356 또는 위약 치료로 무작위화되는 2주 준비 기간(run-in period)으로 들어갔다. 시험 제품의 섭취는 방문 2 이후의 아침에 시작되었다. 대상체는 또한 DSM 32356/위약 개입의 첫 6주 동안 동일한 아침에 매일 300 mg의 아세틸살리실산 (아스피린)을 복용하도록 지시받았다. 방문 2 - 7에서 Pillcam 캡슐 내시경을 수행하였다.
도 5
도 5는 1차 평가 변수의 평가, 캡슐 내시경 루이스 점수에 대한 곡선 아래 영역을 보여준다. 도 5a는 2개의 아암에 대한 곡선 역학을 보여주고, 도 5b는 p 값이 <0.05(*)인 평균 막대 차트로서 표시된 곡선 아래 영역을 설명한다 (오차 막대가 ± SEM임).
도 6
도 6은 첫 번째의 2차 평가 변수의 평가, 캡슐 내시경으로 평가된 바와 같은 총 궤양 수에 곡선 아래 영역을 보여준다. 도 6a는 2개의 아암에 대한 곡선 역학을 보여주고, 도 6b는 p 값이 <0.05인 평균 막대 차트로서 표시된 곡선 아래 영역을 설명한다 (오차 막대가 ± SEM임).
도 7
도 7은 방문 당 트롬복산 B2 (TXB2)의 평균 혈청 농도 (A), AUC ± SEM (B), 방문 당 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 평균 혈청 농도 (C) 및 AUC ± SEM (D)를 보여준다.
도 8
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IFN-γ 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 9
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IL-10 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 10
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IL-6 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 11
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IL-8 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 12
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 TNF-α 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 13
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 C-반응성 단백질 (CRP) 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 14
도 14는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356으로 처리된 군 및 위약군의 대변에서 비피도박테리움 브레베의 상대적 풍부도 (%)를 나타내는 박스 플롯을 보여준다. 박스형은 제1 사분위수 (Q1)에서 사분위수 (Q3)까지 확장되고, 박스 내의 선은 중앙값을 나타낸다. 하단 휘스커는 Q1 - 1.5 x 상호(inter)-사분위수 범위 (IQR) 내에서 가장 작은 값으로 확장되며, 상단 휘스커는 Q3 + 1.5 x IQR 내에서 가장 큰 값으로 확장된다. 휘스커 밖의 값은 원으로 표시된다.
도 15
도 15는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 및 위약군에 대한 대변 미생물 조성물의 브레이-커티스 비유사성이 있는 박스 플롯을 보여주며, 방문 2를 이후의 방문 (V3-V7)과 비교한다. 박스형은 제1 사분위수 (Q1)에서 사분위수 (Q3)까지 확장되고, 박스 내의 선은 중앙값을 나타낸다. 하단 휘스커는 Q1 - 1.5 x 상호-사분위수 범위 (IQR) 내에서 가장 작은 값으로 확장되며, 상단 휘스커는 Q3 + 1.5 x IQR 내에서 가장 큰 값으로 확장된다. 휘스커 밖의 값은 원으로 표시된다.
도 16
2개의 상이한 희석 열(dilution row)에 대한 아스피린 및 살리실산 농도, A) 비피도박테리움 브레베 DSM 32356으로 접종된 희석 열 A 및 B) 최종 pH 4.5로 조정된 pH에서의 희석 열 B.
도 1은 위장관, 즉 위, 십이지장, 공장 및 회장을 포함하는 소장, 및 대장 (결장)의 개요를 보여준다.
도 2
도 2는 시간 경과에 따른 기준선의 백분율로서의 경상피 전기 저항 (TEER)을 설명하며, 점은 평균이고, 오차 막대는 SDs이며 (A), 0-15 시간의 TEER 곡선 아래 영역 (AUC), 막대는 평균이고, 오차 막대는 SDs이다 (B). **** p<0.0001.
도 3
4명의 기증자로부터의 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 자극 수지상 세포의 시험관 내 시토카인 발현. 데이터는 평균 ± SEM (pg/ml)로서 표시된다. A. IL-10의 분비, B. IL-12p70의 분비, C. IL-10:IL-12p70 비율. **** p<0.0001.
도 4
도 4는 임상 시험 설계 및 방문 개요를 보여준다. 방문 1은 스크리닝 방문이었다. 그 다음 방문 2에서 기준선 측정이 측정되기 전, 대상체는 활성 DSM 32356 또는 위약 치료로 무작위화되는 2주 준비 기간(run-in period)으로 들어갔다. 시험 제품의 섭취는 방문 2 이후의 아침에 시작되었다. 대상체는 또한 DSM 32356/위약 개입의 첫 6주 동안 동일한 아침에 매일 300 mg의 아세틸살리실산 (아스피린)을 복용하도록 지시받았다. 방문 2 - 7에서 Pillcam 캡슐 내시경을 수행하였다.
도 5
도 5는 1차 평가 변수의 평가, 캡슐 내시경 루이스 점수에 대한 곡선 아래 영역을 보여준다. 도 5a는 2개의 아암에 대한 곡선 역학을 보여주고, 도 5b는 p 값이 <0.05(*)인 평균 막대 차트로서 표시된 곡선 아래 영역을 설명한다 (오차 막대가 ± SEM임).
도 6
도 6은 첫 번째의 2차 평가 변수의 평가, 캡슐 내시경으로 평가된 바와 같은 총 궤양 수에 곡선 아래 영역을 보여준다. 도 6a는 2개의 아암에 대한 곡선 역학을 보여주고, 도 6b는 p 값이 <0.05인 평균 막대 차트로서 표시된 곡선 아래 영역을 설명한다 (오차 막대가 ± SEM임).
도 7
도 7은 방문 당 트롬복산 B2 (TXB2)의 평균 혈청 농도 (A), AUC ± SEM (B), 방문 당 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 평균 혈청 농도 (C) 및 AUC ± SEM (D)를 보여준다.
도 8
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IFN-γ 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 9
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IL-10 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 10
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IL-6 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 11
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 IL-8 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 12
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 TNF-α 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 13
위약군 또는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 군이 속하는 대상체의 혈장 내 C-반응성 단백질 (CRP) 수준. 데이터는 중앙값 +95% CI (mg/L)으로 표시된다.
도 14
도 14는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356으로 처리된 군 및 위약군의 대변에서 비피도박테리움 브레베의 상대적 풍부도 (%)를 나타내는 박스 플롯을 보여준다. 박스형은 제1 사분위수 (Q1)에서 사분위수 (Q3)까지 확장되고, 박스 내의 선은 중앙값을 나타낸다. 하단 휘스커는 Q1 - 1.5 x 상호(inter)-사분위수 범위 (IQR) 내에서 가장 작은 값으로 확장되며, 상단 휘스커는 Q3 + 1.5 x IQR 내에서 가장 큰 값으로 확장된다. 휘스커 밖의 값은 원으로 표시된다.
도 15
도 15는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 및 위약군에 대한 대변 미생물 조성물의 브레이-커티스 비유사성이 있는 박스 플롯을 보여주며, 방문 2를 이후의 방문 (V3-V7)과 비교한다. 박스형은 제1 사분위수 (Q1)에서 사분위수 (Q3)까지 확장되고, 박스 내의 선은 중앙값을 나타낸다. 하단 휘스커는 Q1 - 1.5 x 상호-사분위수 범위 (IQR) 내에서 가장 작은 값으로 확장되며, 상단 휘스커는 Q3 + 1.5 x IQR 내에서 가장 큰 값으로 확장된다. 휘스커 밖의 값은 원으로 표시된다.
도 16
2개의 상이한 희석 열(dilution row)에 대한 아스피린 및 살리실산 농도, A) 비피도박테리움 브레베 DSM 32356으로 접종된 희석 열 A 및 B) 최종 pH 4.5로 조정된 pH에서의 희석 열 B.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 것과 동등하거나 유사한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있지만, 전형적인 방법 및 물질이 기술된다. 본원에서 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 맥락상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본 발명을 설명하는 맥락에서 (특히 다음 청구 범위의 맥락에서) 용어 "하나(a)" 및 "한(a)" 및 "그(the)" 및 유사한 지시어의 사용은 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 맥락상 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "포함하는(containing)"은 달리 명시되지 않는 한, 개방형 용어 (즉, "포함하나, 이에 제한되지 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 인용한 것은 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 손쉬운 방법으로서 제공하기 위한 것으로 단지 의도되며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 통합된다. 본원에서 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 맥락상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 예시 또는 예시적인 언어 (예컨대, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 주장되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 단리된, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 제공하는데, 이는 실시예 1에 기술된 바와 같이 시험하였을 때, MIC 시험에서 젠타마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 클로람페니콜, 암피실린, 및 반코마이신에 민감하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 분석하였을 때, 항생제 내성 유전자가 없으며, 실시예 1에 기술된 바와 같이 베로 세포 분석에 의해 세포 독성을 시험하였을 때, 비세포 독성(non-cytotoxic)인 것으로 밝혀졌다.
DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주는 추가로 (i) DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주가 DSM 20213으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주와 비교되는, 실시예 2에서 약술된 바와 같이 시험하였을 때, 처리 10시간 후 경상피 전기 저항 (TEER)에 의해 측정된, Caco-2 세포 단일층을 가로지르는 전기 저항을 20% 이상 증가시킬 수 있고; (ii) 인간 단핵구 유래 수지상 세포와 함께 공동 배양됐을 때, 200 pg/ml 이상의 IL-10 분비를 유도할 수 있으며, (iii) 실시예 3에서 약술된 바와 같이 시험하였을 때, 자극되지 않은 단핵구 유래 수지상 세포와 비교하여, DSM 32356 자극된 단핵구 유래 수지상 세포에서IL-10/IL-12 비율의 증가를 유도할 수 있다.
마지막으로, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주는 아세틸살리실산과 같은 NSAID를 복용하는 건강한 성인을 대상으로 하는 임상 연구에서 점막 결손 또는 병변과 같은 손상에 대해 장 조직을 보호하는 것으로 밝혀졌다. 실시예 4에 제공된 결과는 매일 5 1010 콜로니 형성 단위 (colony forming units, CFU)의 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베의 섭취가 아세틸살리실산과 같은 NSAID를 매일 복용하는 건강한 성인에서 궤양 위험을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
이러한 발명의 맥락에서, 용어 "프로바이오틱 성분"은 살아있거나 동결 건조된 미생물, 죽은 미생물, 미생물의 단편 및 인간 또는 동물에 적용됐을 때 숙주에게 유익하게 영향을 미치는 미생물의 추출물 또는 상층액의 배양물을 지칭한다 (문헌[FAO/WHO (2001) Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria]).
본 발명은 특허 절차의 목적으로 미생물 기탁의 국제 승인의 부다페스트 조약에 따라 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), 인호펜슈트라세 7베, 데-38124 브라운쉬바이크(Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig)에서의 수탁 번호 DSM 32356으로 2016년 8월 9일에 기탁된 비피도박테리움 브레베를 제공한다.
본 발명은 프로바이오틱으로서 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 상기 균주를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본원에서 사용된 박테리아의 "균주"는 성장하거나 증식될 때 유전적으로 변하지 않은 상태로 남아있는 박테리아를 지칭한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 필요로 하는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 제공한다.
본 맥락에서, 용어 "장 조직 손상"은 하나 이상의 붉은 반점, 미란, 병변 또는 점막 결손 또는 협착 또는 괴사와 같은 더 심각한 손상으로 진행될 수 있는 융모 부종이 있는 영역을 포함한다.
본 맥락에서 용어 "점막 결손 또는 병변"은 본 시험에서 사용된 궤양의 정의이므로, 용어 "궤양"과 동의어로 사용된다.
본 발명의 현재 바람직한 구체예는 아세틸살리실산 (아스피린)의 투여 중과 같은 NSAID 투여 중에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베에 관한 것이다. 분명히, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베는 또한 NSAID 투여 후에 장 조직 손상의 회복 또는 역전에도 사용될 수 있다.
따라서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베는 두통 및 생리통을 포함하는 통증 관련 상태와 관련하여 NSAID 투여 중 및 투여 후에 유용할 수 있고, 특히 골관절염, 류마티스관절염, 강직성 척추염, 및 통풍과 같은 만성 염증성 질환의 장기간 치료 중에 유용할 수 있다.
본 발명의 현재 바람직한 추가적인 구체예는 장 점막 결손 또는 병변의 감소에 사용하기 위한 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베에 관한 것이다.
추가적으로 본 발명은 NSAID 치료를 필요로 하는 대상체와 같은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 필요로 하는 대상체에 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 투여하는 것을 포함하는, 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 예컨대 아세틸살리실산 (아스피린)의 저용량 투여와 같은 계획되거나 지속적인 NSAID 투여의 결과와 같이, 장 조직 손상이 발생할 위험이 있는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하기 위해 사용될 수 있다.
현재 바람직한 구체예에서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베는 PPIs/기타 제산제 약으로 치료받지 않은 대상체에서, 예컨대 저용량 아세틸살리실산 (아스피린)을 유일한 약제로 복용하는 대상체에서 사용된다.
DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베는 심혈관 질환이 있거나 이미 심장마비 또는 뇌졸중을 앓았던 환자에서 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAID 투여 중 및 투여 후에 심장마비, 혈전 관련 뇌졸중 및 기타 혈류 문제의 위험을 낮추는 심혈관-보호 특성에 유용할 수 있다.
DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베는 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAID 투여 중 및 투여 후에 암과 신경퇴행성 질환의 예방 및 기타 염증성 상태의 치료에 유용할 수 있다.
조성물은 또한 커피 섭취, 스트레스, 방사선치료, 또는 약물 효과 예컨대 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 항응고제, 알렌드론산, 스테로이드 및 면역계 억제제 예컨대 화학치료와 같은 기타 이유로 장 조직 손상의 증가된 위험을 갖는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하기 위해 사용될 수 있다. 분명히, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베는 또한 이러한 노출 후 장 조직 손상의 회복 또는 역전을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 현재 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장 조직 손상의 감소, 즉 장 점막 결손 또는 병변의 예방, 감소 또는 치료에 사용된다.
DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베가 또한 유아에게 투여하는 데에도 유용할 수 있다는 것이 고려된다.
일 구체예에서, 본원에서 기술된 바와 같이 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베를 포함하는 조성물은 하나 이상의 다른 박테리아 균주 및/또는 비타민, 프리바이오틱, 섬유질과 같은 하나 이상의 화합물 또는 프락토올리고당 (FOS), 갈락토올리고당 (GOS)이나 모유 올리고당과 같은 유익한 건강 효과를 가질 수 있는 다른 화합물을 포함할 수 있다.
현재 바람직한 구체예에서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베를 포함하는 조성물은 리소자임 또는 N-아세틸시스테인 (NAC)을 포함하지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주 및 하나 이상의 다른 박테리아 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아 및 하나 이상의 다른 박테리아 균주의 박테리아를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 다른 박테리아 균주는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 아종 락티스 생물변이형 디아세틸락티스(lactis biovar. diacetylactis), 락토코쿠스 락티스 아종 크레모리스(cremoris), 락토코쿠스 락티스 아종 락티스, 락토바실러스 속(genus)에 속하는 임의의 균주를 포함하나 이에 제한되지 않는 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 카제이 아종 카제이, 락토바실러스 델브루키이 아종 불가리쿠스, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 살리바리우스, 비피도박테리움 속에 속하는 임의의 균주를 포함하나 이에 제한되지 않는 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라툼, 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) 아종 락티스, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 덴티움, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 론굼, 비피도박테리움 매그넘(Bifidobacterium magnum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼으로 이루어진 군으로부터, 또는 아커만시아(Akkermansia), 아네로스티페스(Anaerostipes), 부티리치코쿠스(Butyricicoccus), 크리스텐시넬라(Christensenella), 클로스트리디아(Clostridia), 코프로코쿠스(Coprococcus), 도레아(Dorea), 유박테리움(Eubacterium), 페칼리박테리움(Faecalibacterium) 또는 로세부리아(Roseburia)의 속으로부터 또는 코리오박테리아시에(Coriobacteriaceae)과(family)로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서 조성물은 락토바실러스 플란타룸을 포함하지 않는다.
따라서, 조성물은 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스, DSM 13241로 기탁된 락토바실러스 아시도필루스, ATCC 53103으로 기탁된 락토바실러스 람노서스, ATCC 55826으로 기탁된 락토바실러스 람노서스, ATCC 55845로 기탁된 락토바실러스 루테리, ATCC 55544로 기탁된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이, LMG-17806으로 기탁된 락토바실러스 파라카제이, DSM 15957로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스, NM02/31074로 기탁된 락토바실러스 퍼멘툼, CCTCC M204012로 기탁된 락토바실러스 파라카제이 아종 파라카제이를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 균주를 추가로 포함할 수 있다.
현재 바람직한 구체예에서, 단지 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 균주가 본 발명에 따른 조성물에 존재한다.
이러한 구체예의 일 양태에서, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 예컨대 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 및 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주의 박테리아, 예컨대 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주의 박테리아를 포함한다. 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 이들 2개 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
이러한 구체예의 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 예컨대 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 및 락토바실러스 람노서스 균주의 박테리아, 예컨대 ATCC 53103으로 기탁된 락토바실러스 람노서스 균주의 박테리아를 포함한다. 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 이들 2개 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
이러한 구체예의 추가적인 양태에서, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 예컨대 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주의 박테리아, 예컨대 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주의 박테리아 및 락토바실러스 람노서스 균주의 박테리아, 예컨대 ATCC 53103으로 기탁된 락토바실러스 람노서스 균주의 박테리아를 포함한다. 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 이들 3개 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
이러한 구체예의 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 예컨대 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 비피도박테리움 인판티스 균주의 박테리아, 및 비피도박테리움 론굼 균주의 박테리아를 포함한다. 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 이들 3개 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
이러한 구체예의 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 비피도박테리움 인판티스 균주의 박테리아, 비피도박테리움 론굼 균주의 박테리아, 및 비피도박테리움 비피둠 균주의 박테리아를 포함한다. 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 이들 4개 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
이러한 구체예의 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아, 비피도박테리움 인판티스 균주의 박테리아, 비피도박테리움 론굼 균주의 박테리아, 비피도박테리움 비피둠 균주의 박테리아, 및 비피도박테리움 카테눌라툼 균주의 박테리아를 포함한다. 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 이들 5개 균주의 박테리아를 포함할 수 있다.
이러한 양태의 일 구체예에서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아가 조성물에서 유일한 프로바이오틱 성분이다.
본 발명의 조성물은 대상체에게 투여하기 적합한 임의의 형태로 박테리아를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동결 건조(freeze-drying), 분무 건조 또는 동결 건조(lyophilization)에 의해 수득될 수 있는 건조된 형태의 박테리아를 포함할 수 있다.
박테리아가 동결 건조된 경우, 높은 생존력을 얻기 위해 동결 건조되기 전에 일반적으로 동결보호제와 함께 혼합된다. 용어 "동결보호제"는 동결 및/또는 건조 동안 생존을 개선할 수 있고 박테리아의 저장 안정성을 개선할 수 있는 물질을 지칭하기 위해 본원 발명의 맥락에서 사용된다. 본원에서 사용된 동결보호제는 바람직하게는 당류 또는 이노시톨과 같은 당 알코올을 포함한다.
당류는 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류, 또는 2개 이상 당류의 혼합물일 수 있다. 유용한 단당류는 글루코스 (덱스트로스라고도 알려짐), 프럭토스, 리보스 및 갈락토스를 포함하고, 유용한 이당류는 그중에서도 수크로스, 트레할로스, 말토스 및 락토스를 포함한다. 조성물은 하나 이상의 단당류 또는 이당류, 예컨대 1, 2, 또는 3개 또는 그 이상의 상이한 당류를 포함할 수 있다.
예를 들어, 동결보호제는 수크로스와 같은 이당류 및 말토덱스트린과 같은 다당류의 혼합물을 포함할 수 있다.
동결보호제는 펩티드, 단백질, 단백질 가수분해물 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 펩티드 및 단백질의 예시는 카세인, 완두, 유청, 알부민, 글루탐산 또는 젤라틴, 및 임의의 이들의 단리물 또는 가수분해물이다. 기타 첨가제, 예를 들면, 항산화제, 예컨대 아스코르빈산 나트륨, 구연산 나트륨, 구연산삼나트륨 이수화물 및 시스테인 염산염도 또한 존재할 수 있다. 탈지분유 및 효모 추출물도 또한 성분이 될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동결되거나 동결 건조된 형태의 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아 및 동결보호제를 포함한다. 동결보호제는 당류를 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 특히 바람직한 양태에서, 동결보호제는 수크로스와 같은 이당류 및 말토덱스트린과 같은 다당류의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 NSAID와 같은 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주와 결합될 수 있는 NSAIDs의 예시로는 다음의 NSAIDs: 아세틸살리실산 (아스피린), 이부프로펜, 케토프로펜, 나프록센 나트륨, 디클로페낙 칼륨, 디클로페낙 나트륨, 에토돌락, 플루르비프로펜, 인도메타신, 케토롤락, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 술린닥, 셀레콕시브, 메페남산, 및 에토리콕시브 중 하나 이상일 수 있다. 조성물은 박테리아 균주 또는 균주 및 화합물, 예컨대 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 NSAID의 조합 또는 개별 조성물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구로 투여되는 것이 바람직하다. 따라서 조성물은 전형적으로 경구 투여에 적합한 형태이다. 조성물은 고체 또는 액체 조성물일 수 있다. 조성물은 단위 용량 형태일 수 있다. 예를 들면, 조성물은 캡슐, 파스틸레(pastille), 알약, 정제, 소프트 젤, 샤쉐(sachet), 스틱, 스틱 분말일 수 있거나, 오일 방울, 에멀젼 또는 페이스트와 같은 더 일반적인 조성물일 수 있거나, 또는 살아있는 유기체를 위해 효과적인 담체가 될 수 있는, 당업자에 의해 결정된 임의의 기타 적합한 담체에 있을 수 있다.
조성물은, 예컨대 조성물의 장기간 안정성 및 저장을 개선하기 위해 적합한 중합체 매트릭스를 사용하여 캡슐화될 수 있다. 당업자는 임의의 적합한 캡슐화 물질 또는 매트릭스 및 당업자에게 알려진 캡슐화 방법과 기술이 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
조성물은 식이 보충제 또는 약학적 조성물에 포함될 수 있거나 사료 제품 또는 식품, 예컨대 요거트와 같은 발효유 제품 또는 유아 조제분유의 일부일 수 있다.
추가적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단위 용량 형태 또는 상기 기술되거나 식이 보충제 또는 사료 또는 식품, 예컨대 요거트와 같은 발효유 제품 또는 유아 조제분유의 일부로서 더 일반적인 조성물에 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장 조직 손상의 증가된 위험을 갖는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하기 위한 예방적 치료로서 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장 조직 손상을 갖는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어를 지원하기 위한 치료로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는" 및 "치료"는 질환 또는 장애의 중증도 감소를 포함하여, 질환 또는 장애의 진행이나 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 완화, 치료, 또는 그렇지 않으면 저해, 지연, 치유 또는 역전시키는 모든 적용을 지칭한다. 따라서, 치료는 반드시 질환 또는 장애로부터 완전히 회복될 때까지 대상체가 치료받는 것을 의미하는 것은 아니다. 유사하게, 용어 "예방적", "예방하는", "예방" 등은 질환 또는 장애의 확립으로 이어질 수 있는 대상체에서 장 조직 손상을 예방하는 임의의 모든 적용을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"는 가축 또는 기타 농장 동물 (예컨대 소, 염소, 양, 말, 돼지 및 닭), 퍼포먼스 동물 (예컨대 경주마), 애완 동물 (예컨대 고양이 및 개), 실험실 시험 동물 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 포유류를 지칭한다. 전형적으로, 대상체는 인간이다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 비피도박테리움 브레베는 1 x 106 CFU/일 이상의 양으로 투여될 수 있다. 바람직한 양은 1 x 106 CFU/일 이상, 1 x 107 CFU/일 이상, 1 x 108 CFU/일 이상, 1 x 109 CFU/일 이상, 1 x 1010 CFU/일 이상, 1 x 1011 CFU/일 이상, 1 x 1012 CFU/일 이상이다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 비피도박테리움 브레베 및 하나 이상의 다른 균주는, 적용 가능한 경우, 1 x 106 CFU/일 이상의 양으로 투여될 수 있다. 바람직한 양은 1 x 106 CFU/일 이상, 1 x 107 CFU/일 이상, 1 x 108 CFU/일 이상, 1 x 109 CFU/일 이상, 1 x 1010 CFU/일 이상, 1 x 1011 CFU/일 이상, 1 x 1012 CFU/일 이상이다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 죽거나, 동결되거나 또는 동결 건조된 형태의 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 포함하며, 조성물은 1 x 108 CFU/일 내지 1 x 1011 CFU/일의 양으로 투여된다.
현재 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유일한 프로바이오틱 제품으로서 죽거나, 동결되거나 또는 동결 건조된 형태의 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 포함하며, 조성물은 1 x 108 CFU/일 내지 1 x 1011 CFU/일의 양으로 투여된다.
당업자는 본원에서 개시된 조성물의 투여가 상황 및 대상체의 상태에 따라 요구되는 투여 수준 및 투여 요법으로 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 적합한 용량 요법은 본원의 교시에 기초하여 결정될 수 있다. 용량 요법은 대상체의 장 조직 손상에 대한 최적의 지원을 제공하도록 조정될 수 있다. 당업자는 비피도박테리움 브레베 균주 투여의 정확한 양 및 속도가 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이 요건과 같은 많은 요인에 따라 좌우된다는 것을 인식할 것이다. 본원에서의 교시에 기초하여, 당업자는 일상적인 시험 및 실험에 의해 사례별로 적합한 용량 요법을 결정할 수 있다.
본 발명의 예시적인 구체예에서, 본 발명의 조성물은 1일 이상 동안 매일 투여될 수 있다. 대안으로, 조성물은 1일, 2일, 4일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 이상 동안 매일 1회 이상 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 죽거나, 동결되거나 또는 동결 건조된 형태의 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 포함하는 본 발명의 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 2주 이상 동안 1 x 108 CFU/일 내지 1 x 1011 CFU/일의 용량으로 투여된다.
개별 구체예에서, 본 발명은 죽거나, 동결되거나 또는 동결 건조된 형태의 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 포함하는 본 발명의 조성물을 제공하며, 여기서 8주 이상 동안 1 x 108 CFU/일 내지 1 x 1011 CFU/일의 양으로 경구 투여된다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 비피도박테리움 브레베 박테리아 및 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 필요로 하는 대상체에 공동 투여하기 위해 본원에서 기술된 바와 같은 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 포함하는 조합 치료를 제공한다. 조성물은 박테리아 균주 또는 균주 및 NSAID와 같은 화합물의 조합 또는 개별 조성물로서 제형화될 수 있다.
개별 구체예에서, 비피도박테리움 브레베 균주는 사료 또는 유아 조제분유, 건강 식품, 식품 첨가제, 식이 보충제와 같은 식품, 분말, 정제와 같은 고체 형태이거나 액체 형태로 있는 약 또는 일반의약품 제형에 혼입된다.
바람직한 구체예에서, 비피도박테리움 브레베의 균주는 106 CFU/g 이상의 농도로 존재한다. 구체적으로, 농도는 1 x 106 CFU/g 이상, 1 x 107 CFU/g 이상, 1 x 108 CFU/g 이상, 1 x 109 CFU/g 이상, 1 x 1010 CFU/g 이상, 1 x 1011 CFU/g 이상 또는 1 x 1012 CFU/g 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 비피도박테리움 브레베의 균주 및 하나 이상의 다른 균주는 106 CFU/g 이상의 농도로 존재한다. 구체적으로, 농도는 1 x 106 CFU/g 이상, 1 x 107 CFU/g 이상, 1 x 108 CFU/g 이상, 1 x 109 CFU/g 이상, 1 x 1010 CFU/g 이상, 1 x 1011 CFU/g 이상 또는 1 x 1012 CFU/g 이상일 수 있다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 수탁 번호 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 생산하는 단계 및 이를 106 CFU/g 이상의 농도에서 식품, 식이 보충제 또는 약학적 조성물로 혼입하는 단계를 포함하는, 사료 또는 식품, 식이 보충제 또는 약학적 조성물을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
기탁 및 전문가 솔루션
출원인은 후술되는 바와 같이 본원을 위해 기탁된 미생물의 샘플을 특허가 허여되는 날까지 전문가에게만 제공하도록 요청한다.
비피도박테리움 브레베는 데에스엠제트-도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 인호펜슈트라세 7베, 데-38124 브라운쉬바이크(Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig)에서의 수탁 번호 DSM 32356으로 2016년 8월 9일에 기탁되었다.
실시예
실시예 1
항생제 감수성 및 세포 독성 활성 분석
ISO 10932 | IDF 223 국제 표준에 따른 많은 항생제의 최소 저해 농도(minimum inhibitory concentrations, MICs)를 측정하여 DSM 32356의 항생제 감수성을 결정하였다.
수행된 실험은 VetMIC Lact-1 및 Lact-2 패널 (National Veterinary Institute of Sweden, Uppsala, Sweden) 및 0.05% 시스테인 염산염 (CyHCl) (Merck 102839, Germany)이 있는 10% MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) 브로스 (BD Difco 288110, UK)로 보충된 LSM 배지 (이소-센시테스트(ISO-sensitest) 배지 (Oxoid))에 48시간 동안 37℃ 혐기성 조건하에 3회의 생물학적 반복실험으로의 성장을 이용한 브로스(broth) 미량희석법이다. 실험된 항생제의 범위는 비피도박테리움 군에 대한 문헌[European Food Safety Authority (EFSA) "Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms" (EFSA Journal 2018,16:5206)]을 준수한다.
DSM 32356은 EFSA 지침에 따라 비피도박테리움 군과 관련된 모든 항생제 (젠타마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 에리트로마이신, 클린다마이신, 클로람페니콜, 암피실린, 및 반코마이신)에 민감하고, MIC 값이 EFSA 2018 컷오프 값 미만인 것으로 밝혀졌다.
2,200개 이상의 내성 유전자를 포함하는 선별된 데이터베이스 ResFinder에 대해 스크리닝하여 항생제 내성 유전자에 대해 DSM 32356의 유전체를 분석하였다 (문헌[Zankari, E., Hasman, H., Cosentino, S., Vestergaard, M., Rasmussen, S., Lund, O., et al. (2012) Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J. Antimicrob. Chemother. 67: 2640-2644]). 2019년 2월 8일 CLC Main Workbench 버전으로 데이터베이스를 다운로드하고 수입하였다. megaBLAST 설정 (예상 역치 10, 워드 크기 28)을 사용하여 ResFinder 데이터베이스에 대한 내성 유전자에 대해 유전체를 스크리닝하였다. 시험된 모든 항생제에 DSM 32356이 표현형적으로 민감하다는 것과 일치하여, DSM 32356의 유전체에 항생제 내성 유전자가 확인되지 않았다.
EFSA 지침 ["Guidance on the assessment of the toxigenic potential of Bacillus species used in animal nutrition" (EFSA Journal 2014, 12:3665)]에 기초한 베로 세포 분석 방법을 사용하여 세포 독성 활성에 대해 DSM 32356을 시험하였다. 37℃ 혐기성 조건하에 0.05% 시스테인 염산염 (CyHCl) (Merck 102839, Germany)이 있는 MRS 브로스 (BD Difco 288110, UK)에서 DSM 32356이 성장하였다. 원심분리에 의해 24시간 및 48시간 후 배양물 상층액을 단리하고, 덴마크 호르솔름 Bioneer A/S에서 베로 세포 분석을 사용하여 세포 독성에 대해 분석하였다. DSM 32356은 비세포 독성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
경상피 전기 저항 (TEER)으로 측정된, Caco-2 세포 단일층을 가로지르는 전기 저항을 증가시키는 박테리아의 능력에 의해 시험관 내에서 측정된 장 벽 개선
Caco-2 세포 배양
5% CO2, 37℃에서, 20% 열 불활성화된 소 태아 혈청 (Gibco 10500), 1 X MEM 비필수 아미노산 (Biowest X0557-100) 및 1 X Pen-Strep-Amp B (Biological Industries 03-033-1B)으로 보충된 MEM (Gibco 11095)에서 인간 장 상피 Caco-2 세포주 (DSMZ ACC 169, Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)를 배양하였다. 7-30개의 Caco-2 세포 계대를 사용하였다. 세포가 약 50% 밀집되었을 때, 배지를 제거하고, 헹크스 평형 염 용액 (HBSS, 1x, Gibco 14175)에서 세포를 2번 세척하였다. 2 mL의 트립신 (TrypLE Trypsin, Gibco 12604)을 첨가하여 세포를 트립신화하고, 37℃의 CO2 인큐베이터에 4분 동안 두었다. 트립신화된 세포에 약 10 mL의 배지를 첨가하며, 계수하고, 보충된 MEM에서 100.000 세포/mL의 농도를 준비하였다. 트렌스웰의 Clear, Polyester Membranes (12 웰, 0.4 μM, Costar, Cat. No. 3460)의 기저측 구획에 1.5 mL의 보충된 MEM을 첨가한 후, 이의 각 정점 구획에 접종하기 위해 부피 500 μL의 세포 현탄액을 사용하였다. 주 2회 배지를 교체하면서 인서트(inserts) 상에서 21일 동안 세포를 배양하였다. 22일 후 트렌스웰을 CellZscope (NanoAnalytics, Germany)로 옮겼다. 기저측 및 정점 구획에 각각 1.65 mL 및 0.76 mL의 무항생제 (Abx)를 첨가한 무항생제 (Abx) 배지로 배지를 변경하였다. 37℃의 CO2 인큐베이터 (5%)에 CellZscope를 밤새 두었고, 자동화된 데이터 수집을 사용하여 매시간마다 TEER을 측정하였다. 실험 시작 전, TEER의 이러한 밤샘 측정은 각 웰에서 기준선 TEER을 결정하고 안정적인 전기 저항의 품질 제어를 할 수 있도록 하였다.
비피도박테리움 브레베의 제조
Caco-2 세포와 공동 배양하기 2일 전에 0.05% 시스테인 염산염 (CyHCl) (Merck 102839, Germany)이 있는 Man Rogosa Sharp (MRS) 브로스 (BD Difco 288110, UK)에서 혐기성으로 밤새 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 및 비피도박테리움 브레베 DSM 20213을 배양하였다. 공동 배양 전날에 성장된 배양물을 0.05% CyHCl이 있는 MRS (0.05% CyHCl이 있는 10 mL MRS의 100 μL 박테리아 용액)에 재접종하였다. 혼합 접종된 배양물 1 mL를 0.05% CyHCl이 있는 10 mL MRS로 옮겨 희석 열(dilution row)을 생성하였다. 이를 5번 반복하였다. 37℃에서 혐기성으로 밤새 비피도박테리아를 배양하였다. 공동 배양일에 OD600nm를 측정하여 박테리아의 성장을 평가하고 후반 지수기/ 초반 정지기를 나타내는 배양물을 선택하였다. 박테리아 펠릿을 수집하기 위하여, 각 균주에 대해 후반 지수기/ 초반 정지기를 나타내는 2개의 바이알을 모으고, 3500 x g에서 10분 동안 원심분리를 하였다. 상층액을 버리고, 37℃의 따뜻한 20 mL의 HBSS를 첨가하며, 박테리아를 세척하고 3500 x g에서 10분 동안 회전시켜 가라앉혔다. 이러한 세척 절차를 1회 반복한 후, 20 mL의 예열된 무Abx 배지를 사용하여 세 번째 세척 단계가 뒤따른다. 3500 x g 에서 10분 동안 회전시켜 박테리아의 세포를 수확하고 상층액을 버렸다. 5 mL의 예열된 무Abx 배지에서 박테리아의 세포를 재현탁하고, OD600nm를 3.8로 조정하였다.
비피도박테리움 브레베로 Caco-2 세포 자극
비피도박테리아로 Caco-2 세포를 자극하기 위하여, CellZscope 측정을 일시 중지하고, CO2 인큐베이터로부터 CellZscope를 제거하며, 각 트랜스웰로부터 100 μL의 정점 배지를 제거하였다. 100 μL의 박테리아 용액 (0.5의 최종 OD600nm) 또는 배지 대조군 (MEM)을 관련 웰에 (각각 삼중으로) 첨가하였다. CellZscope를 CO2 인큐베이터로 다시 옮기고 TEER 측정을 재개하고 밤새 계속되었다. 자극 직전에 기록된 최신 값 (기준선 측정, 100%로 설정)에 비례하여 박테리아의 자극 동안 TEER의 변화를 계산하였다. 각 웰에 대해 곡선 아래 영역을 계산하였고, Tukey의 다중 비교 시험을 포함한 일원분산분석으로 상이한 박테리아의 자극을 비교하였다.
결과
다음의 균주: 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 및 비피도박테리움 브레베 DSM 20213에 대해 Caco-2 단일층에서 TEER을 증가시키는 능력을 시험하였고, 배지 대조군과 비교하였다 (도 2). Caco-2 상피 세포의 양극화된 단일층에서 비피도박테리움 브레베 DSM 32356이 TEER을 향상시키는 것으로 시험관 내(in vitro) 밝혀졌다. 평균 27을 갖는 대조군 (배지만)에 비해, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356은 TEER 곡선 아래 영역 (AUC)을 평균 380으로 현저하게 증가시켜, 1311% 증가한 평균 TEER AUC를 보여준다. 또한, 비피도박테리움 브레베 DSM 20213은 평균 TEER AUC를 증가시켰지만, 단지 평균값 228으로 증가하였다. 비피도박테리움 브레베 DSM 32356을 비피도박테리움 브레베 DSM 20213과 비교할 경우, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356은 평균 TEER 값이 현저하게 더 높았다 (44% 더 높음).
실시예 3
IL-10/IL-12 비율 측정
비피도박테리움 브레베의 제조
비피도박테리움 브레베 DSM 32356을 접종하고, 0.05% 시스테인 염산염 (CyHCl) (Merck 102839, Germany)이 있는 37℃, pH 6.5의 MRS (de Man, Rogosa and Sharpe broth, Difco, 288110, UK)에서 AnaeroGen 패드 (Thermo Scientific AN0025A, UK)를 사용하여 혐기성으로 밤새 배양하였다. 배양물로부터 10배 희석 시리즈를 밤새 제조하였고, 37℃에서 혐기성으로 밤새 배양하였다. 600 nm에서 광학 밀도 (OD600)의 측정을 기반으로 정지된 성장기 배양물을 선택하였다. 박테리아의 배양물을 6000g에서 2분 동안 원심분리하고, 헹크스 평형 염 용액 (HBSS, Gibco 14175)에서 2번 세척하고, OD 0,05의 무항생제 세포 배양물 배지 (RPMI 1640, Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel + 10% 글리세롤)에서 재현탁하였다.
단핵구 유래 수지상 세포 (DC) 생성
4명의 건강한 기증자의 버피 코트로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 수득하였다. 간단히 말해서, Ficoll-Paque PLUS TM (GE Healthcare, Freiburg, Germany)을 사용한 원심분리로 밀도 구배 세포 분리를 수행하였다. CD14 마이크로비드 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로 분류한 자성 활성화된 세포를 사용하여 CD14에 대한 양성 선별에 의해 단핵구를 단리하고, 37℃, 5% CO2에서의 완전 수지상 세포 (DC) 배지 (10mM HEPES (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany), 50 μM2-ME (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany), 2mM L-글루타민 (Life Technologies Ltd, Paisley, UK), 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청 (Invitrogen, Paisley, UK), 100 U/mL 페니실린 (Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel), 및 30 ng/mL 인간 재조합 IL-4와 20 ng/mL 인간 재조합 GM-CSF (둘 모두 Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)를 포함하는 100 μg/mL 스트렙토마이신 (Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel)으로 보충된 RPMI 1640)에서 2 x 106 세포/mL의 밀도로 배양하였다. 전체 용량의 IL-4 및 GM-CSF를 포함하는 신선한 완전 DC 배지를 배양 3일 후 첨가하였다. 6일에, 표면 마커 발현 분석 (CD11c>90% 발현; CD1a>75% 발현)에 의해 미숙 DCs로의 분화를 확인하였다.
DC 자극
항생제를 포함하지 않은 신선한 완전 DC 배지에서 미숙 DCs를 재현탁하고, 1 × 105 세포/웰로 96웰 플레이트에 접종하고, 자극 전 1시간 이상 동안 37℃, 5% CO2에서 순응되도록 하였다. 37℃, 5% CO2에서의 총 OD=0,01 또는 DC 배지 (자극되지 않은 대조군)에서 20μL의 비피도박테리움 브레베 (DSM 32356) 박테리아의 배양물로 20시간 동안 DC를 자극하였다. 자극 후, 시토카인 정량화를 위해 0.2 μm Acro- Prep Advance 96웰 필터 플레이트 (Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA)를 통해 DC 상층액을 멸균 여과하였다.
DCS로부터 시토카인 정량화
제조자의 지침에 따라 전기화학발광 분석 (유-플렉스(U-plex) 패널, Meso Scale Discovery, MSD, Rockville, Maryland, USA)을 사용하여 IL-10 및 IL-12p70의 분비된 수준을 정량화하였다. IL-10 및 IL-12p70에 대한 최소 검출 한계의 평균은 각각 0,04015 pg/ml 및 0,214 pg/ml이었다.
통계적 분석
GraphPad Prism 7 소프트웨어 (GraphPad Software, La Jolla, USA)로 통계적 분석을 수행하였다. Mann-Whitney 검정을 사용하여 시토카인 평균값을 비교하였다. 평균 ± SEM (pg/ml), 또는 IL-12p70:IL-10 비율로서 데이터를 표시하였다. 값이 검출 한계 미만의 검출이거나 피팅(fitting) 곡선 미만인 경우, 검출 한계의 절반으로 대체하였다.
결과
비피도박테리움 브레베 DSM 32356으로 20시간 자극 후, 단핵구 유래 수지상 세포의 상층액을 수집하고, 이의 시토카인 프로파일을 조사하였다.
비피도박테리움 브레베 DSM 32356은 9.19 pg/ml의 평균값 (도 3B)의 T 세포 자극 시토카인 IL-12p70의 분비 및 313,9 pg/ml (도 3A)의 평균값의 항염증성 IL-10를 통해 DCs에서 유래된 인간 단핵구로부터 면역 반응을 활성화시키는 것으로 나타났다. 자극되지 않은 DCs로부터 IL-10의 분비는 0,17 pg/ml의 평균값을 보이며, IL-12p70은 검출 한계를 벗어났다.
자극되지 않은 수지상 세포의 IL-10:IL-12p70 비율은 0,8:1인 반면, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 자극 수지상 세포에서는 166:1로 증가하였다 (도 3C).
실시예 4
소장 점막의 아세틸살리실산 유도 손상에 대한 비피도박테리움 브레베 DSM 32356의 보호의 생체 내 연구
본 실시예는 NSAID 유도 소장 손상 효과를 약화시키거나 및/또는 역전시키는 DSM 32356의 능력을 입증한다. 보다 구체적으로, 본 시험은 건강한 지원자들에서 캡슐 내시경으로 평가된 바와 같이, 저용량, 장기간의 아세틸살리실산 (아스피린) 유도 소장 점막의 악화를 약화시키거나 및/또는 역전시키는 DSM 32356의 능력을 입증하였다.
시험은 건강한, 성인 지원자들에서 단일 사이트, 무작위화, 이중 맹검법의, 위약 대조, 2개의 아암, 병렬 군 시험이었다. 시험은 매일 300mg의 아세틸살리실산 (아스피린)의 섭취를 공동 투여할 때 프로바이오틱 균주 DSM 32356 또는 위약의 일일 섭취 효과를 조사하였다.
시험은 2주 기간의 준비 기간(run-in period)에 이어서 DSM 32356/위약 및 아세틸살리실산 (아스피린)을 공동 투여하는 6주의 개입 기간을 포함하였다. 6주 후에, 장기간 아세틸살리실산 (아스피린) 사용 후의 장 치유에 대한 DSM 32356의 잠재적인 효과를 조사하기 위하여 DSM 32356/위약을 추가로 2주 동안 투여하였다.
대상체는 준비기를 포함하여 총 10주 기간 동안 시험에 참여하였다. 스크리닝 방문 이외에도, 시험은 8주 개입 기간 동안 6번의 방문으로 이루어졌다.
서면 동의를 얻은 후, 대상체는 시험 참가 자격을 평가하기 위해 스크리닝 절차를 완료하고, 가능한 시험 전 프로바이오틱스 및/또는 약물의 사용을 세척하기 위해 2주 기간의 준비 기간을 완료하였다. 방문 2에서 기준선 평가를 한 후, 대상체는 매일 300mg 아세틸살리실산 (아스피린)의 섭취를 시작하였고, 또한 활성 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 또는 위약 제품을 1:1의 비율로 8주간 매일 섭취하도록 무작위화되었다.
30명의 대상체가 각 아암에서 시험을 완료하는 것을 목표로 하고, 대상체의 중도 탈락률을 가정하여, 총 75명의 대상체를 무작위화하였다. 시험은 유효 효능 데이터 (ITT 모집단)로 시험을 완료한 총 66명의 대상체를 가졌다. 표 1은 대상체 배치를 설명하고, 표 2는 활성 및 위약 아암의 기준선 특성을 설명하고 비교한다.
| N | |
| 스크리닝된 대상체: | 109 |
| 준비기에 포함된 대상체 | 75 |
| 무작위화된 대상체 | 75 |
| 시험 제품을 섭취한 대상체 | 75 |
| 치료 의도 모집단에 포함된 대상체 | 66 |
| ITT 모집단 | P값 | ||
| DSM 32356 | 위약 | ||
| 수 (n) | 35 | 31 | |
| 연령 (년) | 30.5 ± 6.8 | 31.2 ± 6.4 | 0.6675 |
| 성별 (남자/여자) | 16/19 | 14/17 | 0.9641 |
| 인종 (커케이시안이 아닌 인종) | 2 | 0 | 0.4012 |
| 신장 (cm) | 172.2 ± 12.1 | 173.4 ± 10.2 | 0.6662 |
| 무게 (kg) | 73.5 ± 12.5 | 72.0 ± 11.4 | 0.6137 |
| BMI | 24.6 ± 2.1 | 23.8 ± 2.2 | 0.1235 |
| 혈압, 수축기 (mm hg) | 124.1 ± 7.8 | 121.6 ± 10.2 | 0.2756 |
| 혈압, 이완기 (mm hg) | 78.7 ± 6.9 | 77.1 ± 7.6 | 0.3801 |
| 알콜 섭취 (주 당 “드링크”) | 5.1 ± 3.2 | 5.5 ± 3.7 | 0.6919 |
| 아스피린의 책임성(accountability)(100% = 대상체가 복용했어야하는 제품) | 98.7 ± 2.4 | 99.1 ± 1.9 | |
| 시험 제품의 책임성(accountability)(100% = 대상체가 복용했어야하는 제품) | 98.6 ± 2.4 | 99.0 ± 1.9 | |
포함 기준은 다음과 같다:
서면 동의서
건강하고 임의의 위장 불편함/통증 증상 없음
연령 ≥ 18 - ≤ 40세의 남녀
주로 앉아서 지내는 생활 방식 (지구력 스포츠 내에서 매주 2시간 미만의 훈련 부하)
시험 참여 전반에 걸쳐 위장 기능을 변경하는 것으로 알려진 임의의 다른 프로바이오틱 제품 및/또는 약물을 기꺼이 자제하기
제외된 기준은 다음과 같다:
조사자에 의해 판단된 바와 같이, GI 기능에 영향을 미칠 수 있는 복부 수술 (충수 절제술 및 담낭 절제술 제외)
소화성 궤양 질환 병력
알려진 임의의 출혈 장애
아스피린에 대한 알레르기
H. pylori 질환의 병력
휴식 이완기 혈압 ≥ 90 mmHg
휴식 수축기 혈압 ≥ 140 mmHg
정신 질환의 현재 진단
지난 2개월 동안 항생제, 스테로이드 (피임제 제외) 또는 항균 약물의 전신
BMI > 27
지난 2개월 동안 비스테로이드성 항염증제 (아스피린, 이부프로펜, 디클로페낙, 나프록센, 셀레콕시브, 메페남산, 에토리콕시브, 인도메타신)의 매일 사용 또는 스크리닝 전 마지막 2주 동안 부수적으로 사용
스크리닝 전 마지막 2주 동안 피임제를 제외한 약물의 사용
진단된 염증성 위장 질환 및/또는 과민성 장증후군
락토스 불내증
조사자의 재량에 따라 대상체의 장 벽 기능을 방해할 수 있는 임의의 기타 질환
스크리닝 전 지난 2개월 동안 다른 임상 시험에 참여
지난 2개월 동안 프로바이오틱스의 정기적 사용
흡연 및/또는 다른 니코틴 제품의 빈번한 사용
이러한 시험의 참여 동안 현재 식이 요법 및/또는 운동 요법을 변경하려는 욕구 및/또는 계획
스크리닝 전 마지막 2개월 이내 완하제, 항설사제, 항콜린제 및 PPI의 사용
스크리닝 전 마지막 4주 이내에 면역 억제제 약의 사용
여성의 경우: 임신 또는 수유
1차 평가 변수는 방문 2 (무작위화) 및 방문 7 (치료 종료) 사이의 캡슐 내시경 루이스 점수의 곡선 아래 영역으로 측정된, 6주 아세틸살리실산 (아스피린 챌린지)에 공동 투여했을 때 소장 점막 손상에 대한 DSM 32356 대 위약의 8주 경구 보충의 효과였다.
순위가 매겨진 2차 평가 변수의 첫 번째는 캡슐 내시경에서 방문 2-방문 7의 궤양 수에 대한 곡선 아래 영역으로서 측정된, 6주 아세틸살리실산 (아스피린) 챌린지에 공동 투여했을 때 소장 점막 손상에 대한 DSM 32356 대 위약의 8주 경구 보충의 효과였다.
전체 시험 동안, 대상체는 식사, 신체 활동 수준 및 수면 습관과 관련하여 습관적인 생활 방식을 유지하도록 지시받았다.
캡슐 내시경을 사용하여 소장 점막 악화를 평가한 것뿐만 아니라, 방문 2-7에서 채취한 대변 및 혈액 샘플에서의 바이오 마커를 이용하여 간접적으로 평가하였다.
프로바이오틱 제품뿐만 아니라, 식품 및 프로바이오틱스를 포함하는 식품 보충제의 섭취는 스크리닝 방문부터 개입 기간이 끝날 때까지 허용되지 않았다. 단일의 위반으로 인해 대상체를 시험으로부터 철회하지 않았지만, 프로토콜 편차로서 위반을 기록하였다.
시험 동안, 불법 약물 (대마초, 아편과 같은 흥분제 또는 각성제)의 임의의 사용을 금지하였다.
대상체는:
살아있는 미생물을 포함할 수 있는 식품 (즉 발효유 제품) 및 섭취를 자제하기
시험 기간 동안 임의의 비스테로이드성 항염증제 (NSAIDs) 복용 자제하기
다른 임상 시험의 참여 자제하기
방문 2-7 전 2일 동안 음주 자제하기
방문 2-7 전 2일 동안 매운 음식 섭취 자제하기
방문 2-7 전 2일 동안 카페인 섭취 자제하기
방문 2-7일 전 2일 동안 격렬한 운동 피하기
방문 2-7 참석 전 (10:00)부터 밤새 금식하기
를 요청받았다. 물, 청량 음료, 디카페인의 차/커피와 같은 투명한 액체는 방문 전날 자정까지 허용되었다.
캡슐 내시경은 융모 부종, 궤양 및 협착 형태의 소장 염증 및 손상을 검출하는 데 유용하다. Medtronic의 Pillcam 캡슐을 사용하여 방문 2-7 동안 캡슐 내시경 방법을 사용하였다.
캡슐 내시경 절차 전에 장을 비우기 위해, 대상체는 방문 전날 10:00부터 금식하도록 요청받았다. 대상체는 방문 당일 아침에 금식하였다. Pillcam 캡슐을 물 한 잔으로 삼키기 전, Pillcam 신호 수신기 벨트를 대상체의 상체에 연결하였다. Pillcam 캡슐은 심실 및 소장을 통과하여 사진 형태의 데이터를 수신기로 보낸다. 캡슐의 데이터는 총 8시간 동안 캡쳐되었고, 그 후 캡슐은 소장을 통과한 것으로 예상된다. 대상체는 8시간 캡슐 기록 동안 사이트를 떠나날 수 있었으나, 이들 8시간 동안 신체 활동을 하지 말라고 조언받았다. 4시간 후, 대상체는 가벼운 식사를 할 수 있었다.
총 5명의 잘 훈련된 위장병 전문의가 캡슐의 비디오 데이터를 검토하고 점수 매기는 데 참여하였다. 캡슐로부터 소장에서 관찰된 손상은 3가지 범주: 융모 부종, 궤양 및 협착으로 나눠졌다. 이들 3가지 범주는 개별적으로 평가되었고, 1차 평가 변수에 대해서도 또한 장 손상에 대해 잘 알려진 임상 및 과학적 점수인 루이스 점수 (문헌[(Gralnek et al., 2008) (Gralnek IM, Defranchis R, Seidman E, Leighton JA, Legnani P, Lewis BS. Development of a capsule endoscopy scoring index for small bowel mucosal inflammatory change. Aliment Pharmacol Ther. 2008;27(2):146-154. doi:10.1111/j.1365-2036.2007.03556.x)])라는 하나의 점수로 결합되었다.
캡슐의 데이터 평가에 다음의 규칙을 적용하였다:
안전:
캡슐 방문 후 1주일 이내, 하나 이상의 캡슐 검토자가 캡슐이 소장을 통과하였음을 (캡슐이 결장에 있음을 마지막 사진으로부터 확인함으로써) 확인하였다.
데이터 품질:
무작위화 시스템이 만들어졌으므로, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356/위약 치료에 무작위화하는 것과 병행하여, 대상체는 또한 해당 대상체의 캡슐 데이터를 감독하기 위해 5명 중 2명의 검토자로 무작위화되었다.
무작위화 시스템에 의해 임명된 2명의 검토자는 해당 대상체에 대한 모든 캡슐 방문으로부터의 모든 캡슐 데이터를 검토하였다. 대상체로부터의 캡슐 데이터를 감독하는 2명의 검토자는 또한 서로 맹검화되었고, 캡슐 데이터와 관련하여 어떤 식으로든 서로 소통할 수 없게 하였다.
이들 2명의 검토자에 대한 평균 캡슐 데이터 값을 계산하였다. 2명의 검토자로부터의 데이터가 4개 이상의 궤양이 상이한 경우, 세 번째 검토자 (책임 조사자)도 또한 해당 방문에 대한 Pillcam 데이터 세트를 검토하고, 모든 3명 검토자의 평균값을 계산하여 해당 방문에 대한 최동 데이터 포인트로서 사용하였다.
ITT 모집단으로부터의 데이터를 보여주는 도면으로 결과를 제공하였다.
결과에서 보여주는 바와 같이, 시험은 그의 1차 평가 변수 및 첫 번째의 2차 평가 변수를 충족하며, 루이스 점수 (도 5), 및 궤양의 총 수 (도 6)에서 관찰되는 바와 같이, 아스피린 유도 장 손상에 대한 DSM 32356 균주의 명확하고 통계적으로 현저한 보호 효과를 보여준다.
실시예 5
혈액 샘플에서 프로스타글란딘 E2 및 트롬복산 B2 농도의 정량화
방법
탐색적 평가 변수로서, 사이클로옥시게나제 (COX)의 혈청 샘플 다운스트림에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 및 트롬복산 B2 (TBX2)에 대한 사후 개입 효과를 연구하였다.
비맹검화한 후, 방문 2 내지 방문 7 동안 수득된 공복 혈청 샘플에서 COX 효소로부터의 2개의 바이오리피드 PGE2 및 TXB2 다운스트림에 대해 사후 실험실 분석을 수행하였다. 문헌[(Le Faouder et al. 2013) Le Faouder, P. et al. LC-MS/MS method for rapid and concomitant quantification of pro-inflammatory and pro-resolving polyunsaturated fatty acid metabolites. J. Chromatogr. B 932, 123-133 (2013)]에서 이전에 기술된 바와 같이, Ambiotis SAS (France)에 의해 추출 프로토콜 및 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 분석 중 개입을 위해 Ambiotis는 맹검화된 상태로 유지되었고, 단일 측정으로 분석을 수행하였다.
결과
아세틸살리실산 (아스피린)의 섭취는 혈청 PGE2 및 TXB2 농도의 강력한 억제와 관련이 있었다 (도 7). 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 개입은 COX의 대사산물 다운스트림에서 잘 기술된 아세틸살리실산 유도 변화를 변경하지 않았다. 이는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356의 보호 작용이 아세틸살리실산의 특정 심혈관 보호 특성을 방해하지 않음을 시사한다.
실시예 6
전신 시토카인 프로파일링
방법
헤파린 혈장으로부터의 시토카인 정량화
시토카인 프로파일을 분석하기 위하여, 위약군의 31명의 대상체, 및 활성군 (비피도박테리움 브레베, DSM 32356의 섭취자)의 35명 대상체로부터의 방문 2 내지 7의 헤파린 혈장 샘플을 수집하였다. 제조자의 프로토콜에 따른 Meso Scale Discovery (Cat.# K15049D)의 브이-플렉스(V-plex) 인간 전염증성 패널 1을 사용하여, IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 분비된 수준을 정량화하였다. 제조자의 지침에 따른 브이-플렉스 단일 분석 (Cat.# K151STD)을 사용하여 C-반응성 단백질 (CRP) 수준도 또한 정량화하였다. 브릿지(bridge) 대조 샘플을 사용하여 플레이트 간 변이를 평가하였다.
통계적 분석
GraphPad Prism 7 소프트웨어 (GraphPad Software, La Jolla, USA)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. Sidak의 비교와 함께 이원분산분석(2-way ANOVA)을 사용하여 시토카인 값을 비교하였다. 데이터는 CRP에 대해 중앙값 + 95% CI (mg/L)으로 표현하고, 나머지의 시토카인에 대해 pg/ml로 표현하였다. 값이 검출 한계 미만의 검출이거나 피팅(fitting) 곡선 미만인 경우, 검출 한계(LOD)의 절반으로 대체하였다
결과
임의의 측정된 시토카인 또는 CRP에서 위약군과 활성군 간의 현저한 차이는 발견되지 않았다. 따라서, 비피도박테리움 브레베 (DSM 32356)의 섭취는 전신 면역 반응을 유도하지 않았다. IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-8, TNF-α 및 CRP의 모든 측정은 검출 범위 이내에 있었고, 플레이트 간 변이 값은 20% 미만이었다 (표 3 및 도 8 내지 도 13 참조). IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2 및 IL-4의 경우 측정의 31.9% 이상이 검출 한계 미만이었고, 플레이트 간 변이를 증가시켰다 (표 3 참조).
표 3. 분석된 시토카인에 대한 최소 검출 한계의 평균, 브릿지 대조 샘플의 CV 값에 기초한 플레이트 간 변이 및 검출 한계 미만의 샘플%. * IL-13 측정을 위한 샘플은 26명의 위약군 및 28명의 활성군이었다.
| 분석 | 평균 LOD (pg/ml) | 플레이트 간 변이 브릿지 대조 CV |
검출 한계 미만의 샘플% |
| IFN-γ | 0.259 | 13.1 | 0 |
| IL-10 | 0.016 | 12.5 | 0 |
| IL-12p70 | 0.036 | 25.2 | 31.9 |
| IL-13 | 0.146 | 33.9 | * 77 |
| IL-1β | 0.022 | 58 | 68.5 |
| IL-2 | 0.036 | 63.2 | 63.2 |
| IL-4 | 0.008 | 47.1 | 76.4 |
| IL-6 | 0.031 | 8.4 | 0 |
| IL-8 | 0.119 | 4.8 | 0 |
| TNF-α | 0.055 | 10.2 | 0 |
| CRP | 1.301 | 17.5 | 0 |
실시예 7
비피도박테리움 브레베 회복 및 대변 샘플의 미생물총 조성물
탐색적 평가 변수로서, 대변 샘플에서 비피도박테리움 브레베 풍부성과 미생물총 조성물에 대한 사후 개입 효과를 연구하였다.
비맹검화한 후, NucleoSpin 96 Soil 키트 (Macherey-Nagel)를 사용하여 수득된 모든 분변 샘플로부터 추출된 DNA에 대해 사후 실험 및 생물 정보학 분석을 수행하고, 무작위로 350 bp 단편으로 전단하였다. Illumina (New England Biolabs)의 NEBNext Ultra Library Prep 키트를 사용하여 라이브러리를 구성하고, 샘플당 3천만개 이상의 리드 페어(read pairs) (2 x 150 bp paired-end Illumina 시퀀싱)로 시퀀싱하였다. 시퀀싱 리드(reads)는 인간 및 저품질 리드를 제거하기 위해 시퀀싱 리드(reads)를 여과하며, Clinical Microbiomics Human Gut 22M 유전자 카탈로그에 맵핑하고, 문헌[(Nielsen et al. 2014) Nielsen, H. B. et al. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes. Nat. Biotechnol. 32, 822-828 (2014)]에서 이전에 기술된 바와 같이, 분류학적 상대적 풍부도 표로서 요약하였다. 관련된 당사자는 개입에 대한 분석 중 맹검화를 유지하였다. 윌콕슨 순위 합계 검정(Wilcoxon rank sum test)을 사용하여 방문 2 및 마지막 시점의 전체(integral) 간의 분류군의 상대적 풍부도의 변화를 시험하고, 본페로니 교정(Bonferroni correction)을 사용하여 다중 비교를 위해 교정하였다. 유사하게, 2개의 아암 간에 방문 2 및 마지막 시점 간의 브레이-커티스 거리(Bray-Curtis distance)를 비교하였다 (t-검정).
결과
연구 제품 순응도를 확인하는 위약 아암과 비교하여, 수득된 모든 분변 샘플의 DNA 시퀀싱은 비피도박테리움 브레베 DSM 32356 아암에서의 대상체로부터 수득된 분변 샘플에서 비피도박테리움 브레베의 무작위화 후의 풍부도가 분명하게 증가한 것으로 나타났다 (도 14).
브레이-커티스 비유사성 지수(Bray-Curtis dissimilarity index)에 의해 밝혀진 바와 같이, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356를 이용한 개입은 특정 미생물 분류군의 풍부도의 현저한 변화 또는 전반적인 마이크로바이옴 조성물의 변화와 관련이 없었다 (도 15).
실시예 8
이러한 실험의 전반적인 목표는 비피도박테리움 브레베 DSM 32356이 시험관 내 아스피린의 저하에 영향을 미치는지를 조사하는 것이었다.
가정
임상 시험에서 각 대상체는 하루 당 300 mg의 아스피린 (아세틸살리실산)을 투여받았다. 용량은 0.3 g / 0.1 L = 3 g/L에 상응하는 약 1 dL 의 물로 섭취되는 것으로 가정되었다. 아스피린의 분자량은 180.157 g/mol이다. 가정된 장 내 최대 노출은 (3 g/L) / (180.157 g/mol) = 0.01665 mol/L = 16.65 mM일 것이다.
광범위한 농도 범위의 아세틸살리실산을 포함하기 위해 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0 mM의 아세틸살리실산 농도를 사용하였다.
비피도박테리움 브레베의 제조
아세틸살리실산으로 배양하기 2일 전에 0.05% 시스테인 염산염 (CyHCl) (Merck 102839, Germany)이 있는 Man Rogosa Sharp (MRS) 브로스 (BD Difco 288110, UK)에서 혐기성으로 밤새 비피도박테리움 브레베 DSM 32356을 배양하였다. 다음날 성장된 배양물을 0.05% CyHCl이 있는 신선한 MRS (0.05% CyHCl이 있는 10 mL MRS의 100 μL 박테리아 현탄액)에 재접종하였다. 혼합 접종된 배양물 1 mL를 0.05% CyHCl이 있는 10 mL MRS로 옮겨 6개의 희석 열을 생성하였다. 이를 5번 반복하였다. 37℃에서 혐기성으로 밤새 비피도박테리아를 배양하였다. 아세틸살리실산으로 배양하는 날에 600nm에서 광학 밀도 (OD600nm)를 측정하여 박테리아의 성장을 평가하고, 후반 지수기/ 초반 정지기를 나타내는 배양물을 선택하였다. 박테리아 펠릿을 수집하기 위하여, 2개의 희석 열마다, 후반 지수기/ 초반 정지기를 나타내는 2개의 바이알을 모으고 (총 3개의 바이알까지 첨가), 배지 대조군 바이알과 함께 튜브를 3500 x g에서 5분 동안 원심분리를 하였다. 상층액을 버리고, 0.05% CyHCl이 있는 35 mL의 MRS를 첨가하며, 박테리아를 세척하고 3500 x g에서 5분 동안 회전시켜 가라앉혔다. 세척 절차를 1회 반복하였다. 또한, 박테리아 펠릿이 있는 3개의 바이알에 대해 각각 0.05%의 15 mL의 MRS를 첨가하였다. 펠릿을 재현탁한 후, 3 x 15 mL 박테리아 현탄액을 1개의 튜브에 모으고, 3500 x g에서 10분 동안 회전시켜 가라앉히고, 상층액을 버렸다. 0.05% CyHCl이 있는 총 20 mL의 MRS를 추가하고 박테리아를 재현탁하였다. 약 4.25 x 109 CFU/mL의 박테리아의 밀도에 상응하는 12로 OD600nm를 조정하였다.
아세틸살리실산 용액의 제조
아세틸살리실산, Sigma, A6810, 400 mg을 계량하고, 0.05% CyHCl이 있는 100 mL의 MRS에서 용해시켰다. 2M NaOH (Merck의 27% 수산화 나트륨 용액으로 희석)을 사용하여 배지 대조군의 pH (pH=6)로 pH를 조정하였다. 0.05% CyHCl이 있는 MRS에서 아스피린 용액을 2배 6배 희석하여 아스피린의 농도 22.2, 11.1, 5.6, 2.8, 1.39, 0.69 및 0.35 mM를 얻고, 멸균 여과하였다.
아스피린과
비피도박테리움 브레베 DSM 32356의 배양
9 mL의 각 아세틸살리실산 용액 (22.2, 11.1, 5.6, 2.8, 1.39, 0.69 및 0.35 mM) 및 대조 조건 (0 mM)을 상이한 멸균 튜브에 이중으로 첨가하였다. 희석 열 중 하나에 1 mL의 DSM 32356 현탄액을 각 튜브에 첨가하여 최종 농도의 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0 mM의 아세틸살리실산 및 4.25 X 108 CFU/mL의 박테리아를 달성하였다. 두 번?? 희석 열에 0.05% CyHCl이 있는 1 mL의 MRS를 첨가하고, 튜브 당 약 30 μL의 HCl (염화나트륨, VWR Chemicals)을 사용하여 pH를 4.5로 조정하였다. 37℃에서 24시간 동안 혐기성으로 두 희석 열 모두를 배양하였다. 배양 후, 각 바이알에서 pH를 측정하고, 용액을 멸균 여과하고, 대사산물 분석까지 -80℃에서 냉동하였다.
대사산물 분석
모든 샘플을 0.1% 포름산 (VWR Chemicals의 LC-MS grade)이 있는 10mM 포름산 암모늄 (VWR Chemicals의 LC-MS grade)에서 10배 희석하였다. 아세틸살리실산 및 살리실산의 적절한 정량화를 보장하기 위해, 샘플 A6 및 B6을 추가로 2배 희석하였고, 샘플 A7 및 B7을 추가로 4배 희석하였고, 샘플 A8 및 B8을 추가로 10배 희석하였다.
품질 관리를 위해, 모든 샘플에서 소량의 분취량을 취하여 혼합 풀링된 샘플 (QC 샘플)을 만들었다. 시퀀스 내내 이러한 QC 샘플을 정기적 간격으로 분석하였다.
고해상도 사중 극자 궤도 질량 분석기 (Q ExactiveTM HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo Fischer Scientific)와 결합된 UPLC 시스템 (Vanquish, Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 분석을 수행하였다. 이온화원(ionization source)으로서 전기분무 이온화 인터페이스를 사용하였다. 음이온 및 양이온화 모드에서 분석을 수행하였다. 화합물 확인을 위해 MS/MS 모드에서 QC 샘플을 분석하였다. Doneanu et al. 2011 (문헌[Doneanu, C. E., Chen, W. & Masseo, J. R. (2011) Waters Application note, 720004042en])에 의해 기술된 프로토콜의 약간 변형된 버전을 사용하여 UPLC를 수행하였다.
Compound Discoverer 3.0 (Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 데이터를 처리하였다.
원 데이터에서 모든 특징을 추출한 다음 동일한 화합물에 속하는 특징을 그룹화하여 특징 검출하는 것에 의해 화합물 추출을 수행하였다. 정확한 질량과 함께 동위 원소 패턴을 사용하여 분자식을 결정하였다. 3가지 수준 중 하나의 주석(annotation)으로 화합물 확인을 수행하였다:
1) 표준을 통해 확인된 정확한 질량, MS/MS 스펙트럼 및 알려진 머무름 시간 머무름 시간으로 확실한 확인.
2) 주석은 2가지 정보를 기반으로 하고, 2개의 하위 수준: a) 동일한 시스템에서 분석된 표준으로부터 얻은 정확한 질량 및 알려진 머무름 시간에 기반, b) 외부 라이브러리로부터 얻은 정확한 질량 및 MS/MS 스펙트럼에 기반하여 나누었다.
3) 이러한 수준의 주석은 정확한 질량 및 원소 조성물만을 사용하는 라이브러리 검색을 기반으로 한다. +/- 3ppm의 허용가능한 질량 편차로 라이브러리 검색을 수행하였다.
수득된 피크 영역 및 아세틸살리실산 농도 간의 상관 계수를 계산하여 아스피린의 첨가된 양과 관련된 화?d물을 찾아내었다. 상관 계수가 0.9보다 높은 화합물의 거동을 자세히 분석하여 아세틸살리실산 유도체화 대사산물일 수 있는지를 조사하였다.
결과
모든 pH 조정 샘플 (B1-B8)은 배양 24시간 전후에 유사한 pH를 갖는 반면, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356으로 접종된 모든 샘플은 배양 전 pH 6, 배양 후 pH 4-4.5를 가졌다 (표 4 참조).
| 최종 아세틸살리실산 농도 (mM) | 샘플 id | 접종물 (~4.25X 10 8 CFU/ml) | 배양 전 pH | 24 시간 배양 후 pH |
| 0 | A1 | + | 6 | 4 |
| 0.3125 | A2 | + | 6 | 4 |
| 0.625 | A3 | + | 6 | 4 |
| 1.25 | A4 | + | 6 | 4 |
| 2.5 | A5 | + | 6 | 4 |
| 5 | A6 | + | 6 | 4 |
| 10 | A7 | + | 6 | 4-4.5 |
| 20 | A8 | + | 6 | 4-4.5 |
| 0 | B1 | - | 4.5 | 4.5 |
| 0.3125 | B2 | - | 4.5 | 4.5 |
| 0.625 | B3 | - | 4.5 | 4.5 |
| 1.25 | B4 | - | 4.5 | 4.5 |
| 2.5 | B5 | - | 4.5 | 4.5 |
| 5 | B6 | - | 4.5 | 4.5 |
| 10 | B7 | - | 4.5 | 4.5 |
| 20 | B8 | - | 4.5 | 4.5 |
아세틸살리실산을 포함하는 모든 샘플에서 대부분의 아세틸살리실산은 비피도박테리움 브레베 DSM 32356과 함께 24시간 배양 후에 또는 산 조정된 후에 살리실산으로 전환되었다. 접종된 희석 열과 산 조정된 희석 열을 비교할 때 샘플의 2개의 세트에서 아세틸살리실산 및 살리실산의 농도 간에 주된 차이가 관찰되지 않았다 (도 16).
중요하게도, 접종된 희석 열 및 산 조정된 희석 열 간에 아스피린의 치료적 효과를 담당하는 2개의 활성 화합물인 아스피린 및 살리실산의 농도가 상이하지 않았다. 첨가된 아세틸살리실산을 검출된 피크 영역 몇몇의 화합물과 비교했을 때, 더 많은 아세틸살리실산이 존재하는 경우, 상관 관계가 있고, 증가된 피크 영역을 갖는 것으로 보인다. 그러나, 접종된 샘플에서 박테리아는 배지에 존재하는 많은 화합물을 섭취하는 것처럼 보이며, 이는 억제된 박테리아의 성장으로 인해 아스피린의 농도가 증가할 때 억제되는 능력이다. 이러한 억제된 성장은 아마도 관찰된 상관 관계의 근본 원인일 것이고, 이들 화합물이 B 샘플 세트에서와 같이 A 샘플 세트에서 높은 아스피린을 갖는 샘플에 동일한 양으로 존재한다는 사실에 의해 뒷받침된다.
결론적으로, 비피도박테리움 브레베 DSM 32356은 아세틸살리실산을 성능 저하시키는 것으로 보이지 않는다.
Claims (15)
- DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve) 균주.
- 제1항에 따른 균주를 포함하는 것인 조성물.
- 제2항에 있어서, 동결보호제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 조성물은 하나 이상의 다른 박테리아 균주를 포함하는 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 하나 이상의 다른 박테리아 균주는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)인 것인 조성물.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 하나 이상의 화합물을 포함하는 것인 조성물.
- 제6항에 있어서, 화합물은 비타민, 프리바이오틱, 섬유질 또는 프락토올리고당 (FOS), 갈락토올리고당 (GOS)이나 모유 올리고당 (HMO)과 같은 다른 화합물인 것인 조성물.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 유일한 프로바이오틱 성분으로서 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주를 포함하는 것인 조성물.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주 및 하나 이상의 다른 균주는, 적용 가능한 경우, 1 x 106 CFU/g 이상의 농도로 존재하는 것인 조성물.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주 및 하나 이상의 다른 균주는, 적용 가능한 경우, 1 x 106 CFU/일 이상의 양으로 존재하는 것인 조성물.
- DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베를 필요로 하는 대상체에서 장 조직 손상에 대한 방어 지원에 사용하기 위한 것인 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베.
- 제11항에 있어서, NSAID 투여 중에 사용하기 위한 것인 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 아세틸살리실산 (아스피린)의 투여 중에 사용하기 위한 것인 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 장 점막 결손 또는 병변의 감소에 사용하기 위한 것인 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베.
- 제1항에 따른 수탁 번호 DSM 32356으로 기탁된 비피도박테리움 브레베 균주의 박테리아를 생산하는 단계 및 박테리아를 106 CFU/g 이상의 농도에서 사료 또는 식품, 식이 보충제 또는 약학적 조성물로 혼입하는 단계를 포함하는,
사료 또는 식품, 식이 보충제 또는 약학적 조성물을 생산하기 위한 방법.
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