KR20240035473A - 증가된 장의 투과성의 치료용 프로바이오틱 조성물 - Google Patents

증가된 장의 투과성의 치료용 프로바이오틱 조성물 Download PDF

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KR20240035473A
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마르타 페레즈 가르시아
조르디 에스파달러 마조
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에이비-바이오틱스 에세.아.
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Abstract

비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894를 포함하는 프로바이오틱 조성물이 제공된다. 프로바이오틱 조성물은 폴리포스페이트를 생성함에 의해 치료를 필요로 하는 대상체에서 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 또는 연관된 병태, 또는 이의 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 개선하는 데 유용하다. 적어도 하나의 모유 올리고당과 프로바이오틱 조성물의 조합도 제공된다.

Description

증가된 장의 투과성의 치료용 프로바이오틱 조성물
본 발명은 의학 및 미생물학 분야에 관한 것이고, 특히 인간과 동물의 건강에 유익하고 특히 장의 장벽 기능장애 또는 연관된 병태의 치료에 유용한 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다.
비피도박테리아는 인간 건강에서 중요한 역할을 하는 인간 장내 미생물총의 구성원이다. 유아에서 장내 미생물총은 비피도박테리아에 의해 지배되는 반면 성인기에는 그 수준이 더 낮다. 비피도박테리아의 상이한 종의 존재는 유년기부터 노년기에 이르기까지 연령에 따라 변한다. 비피도박테리아는 장내 미생물총의 정상적인 발달과 그 장벽 효과, 식이 화합물의 흡수 및 생애 첫 단계의 중요한 시기에서 면역계의 성숙에서 유익한 효과를 갖는 중요한 역할을 수행한다.
비피도박테리아에서의 감소는 제왕절개, 조산, 분유 수유, 또는 산전 및 산후 항생제 치료와 같은 요인에 의해 촉발될 수 있는 알레르기, 비만 또는 염증성 장 질환과 같은 장기적인 장애의 더 높은 위험과 연관된다. 결과적으로, 비피도박테리아 균주는 질환의 예방 및 치료에서 프로바이오틱으로 그의 사용에 대해 연구되고 있다.
WO2015018883A2는 유아에서 과도한 울음의 개선에 유용한, 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330을 포함하고 선택적으로 비피도박테리움 롱검 CECT 7894를 포함하는 프로바이오틱 조성물을 개시한다. 두 프로바이오틱 박테리아의 조성물을 테스트한 임상 시험에서는 프로바이오틱 섭취가 일일 평균 울음 시간과 각 에피소드의 지속시간을 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 "상기에 설명된 박테리아 조성물의 관련 특성으로부터, 박테리아 조성물의 투여는 그것이 면역계의 미성숙으로 인한 염증과 연관된 위장 장애를 특징으로 하는 다른 병태를 치료하고; 장의 과민성을 치료하고 장내 바람직하지 않은 박테리아의 과잉을 균형 유지하는 데에 또한 유용하다는 것이 추론된다"는 것이 기술되어 있다. 조성물에 포함된 각각의 프로바이오틱 균주의 특성과 관련하여, WO2015018883A2는 P. 펜토사세우스 CECT 8330이 IL-10을 유도하는 더 높은 능력을 보여주었고 결과적으로 장관에서의 염증을 잠재적으로 개선하는 반면 B. 롱검 CECT 7894는 과도한 울음이 있는 유아에서 일반적으로 풍부한 바람직하지 않은 박테리아의 성장을 억제하는 더 높은 능력을 보여주었다는 것을 개시한다.
JP2006176450A는 인을 흡수하는 수단에 의해 폴리포스페이트를 축적할 수 있는 비피도박테리움 아돌레센티스 JCM 1251 또는 비피도박테리움 브레베 JCM 1273과 같은 유산균을 포함하는 프로바이오틱 조성물을 기술하고 있다. 본 조성물은 소장에서 인의 과도한 흡수를 억제하는 효력을 가질 수 있고 따라서 신장결석 질환을 포함한 다양한 질환의 예방에 긍정적인 효과를 가질 수 있다.
유산균과 비피도박테리아의 일부 균주는 폴리포스페이트(polyP)를 생산하는 능력을 보여주었는데, 이는 장의 장벽 기능을 강화하고 숙주 장의 항상성을 유지하는 그 역할로 인해 포스트바이오틱스 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 숙주-프로바이오틱 상호작용은 프로바이오틱 유래 polyP의 상피 세포내이입을 통해 촉진된다. 장 세포에서, polyP는 인테그린 β1-p38 MAPK 경로를 통해 열 충격 단백질 HSP27과 같은 세포보호 인자를 유도한다.
비피도박테리아의 PolyP 형성 능력은 Qian 등(2011)에 의해 제안되었다. 저자는 비피도박테리아 균주 B. 아돌레센티스 ATCC 15703(JCM 1275), B. 롱검 ATCC 15707, B. 롱검 ATCC 55816, 비피도박테리움 sp. BAA-718 및 B. 스카르도비 BAA-773은 PolyP 과립과 일치할 수 있는 관찰가능한 과립을 생성하지만 이는 입증되지 않았다. 더욱이, 과립의 정량화나 특성화는 수행되지 않았다. 이들 과립은 예를 들어, 금속 또는 단백질 과립을 함유하는 과립과 일치할 수도 있다. 부가적으로, polyP 생합성 효소 PPK를 인코딩하는 ppk 유전자의 발현은 산화적 스트레스에 반응하여 비 프로바이오틱 균주 B. 스카르도비 BAA-773에서 연구되었다.
또 다른 연구는 또한 배양 시간 후 배지에 남아 있는 포스페이트의 양을 측정하는 간접 분석을 통해 polyP를 형성하는 락토바실러스, 비피도박테리아, 락토코커스 및 스트렙토코커스의 능력을 평가한다(Anand 등 2019). B. 아돌레센티스 JCM 1275는 인을 축적하는 가장 높은 능력을 보여주지만 이 실험에서는 polyP의 정량화가 수행되지 않는다.
더욱이, Saiki 등 2016은 폴리포스페이트 키나제(PPK)의 첨가 후 ATP의 직접 정량화를 통해 유산균 및 비피도박테리아에 의한 polyP 생산을 간접적으로 정량화한다. PPK는 ATP와 포스페이트로부터 PolyP와 ADP를 생성하는 가역반응을 촉매하는 효소이다. 결과는 종과 균주 사이의 다양한 polyP-생산 능력을 보여준다. 락티카세이바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 JCM 1163은 가장 높은 polyP 농도를 보여준다.
이들 연구는 polyP를 생산할 수 있는 프로바이오틱 박테리아의 사용을 향한 초기 단계를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 프로바이오틱 특성은 같은 종의 박테리아 사이에서도 균주-의존성이다. 따라서, 숙주에 대해 유익한 효과를 가지는 상당한 양의 polyP를 생산할 수 있는 이들 균주를 찾는 것이 중요하다. 더욱이, 위장 상태에 대한 저항성, 적절한 증식과 같은 모든 프로바이오틱 요구사항에서 우수한 성능을 가지고 대규모 제조에도 적합할 필요가 있다.
2022년 5월 30일에 승인된 Xiao 등의 요약에서는 B. 롱검 CECT 7894가 장내 미생물총과 담즙산 대사를 조절하는 것을 통해 마우스에서 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유도 대장염에 대한 인플릭시맙의 효능을 개선했다고 결론지었다.
발명의 요약
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 장의 장벽 기능장애에 긍정적인 영향을 필요로 하는 대상체에서 장의 장벽 기능장애에 긍정적인 영향을 가질 수 있는 새로운 조성물을 제공하는 것이다.
발명자들은 장의 장벽에 긍정적인 영향을 가지는 폴리포스페이트(polyP)를 다량 생산하는 능력을 갖는 새로운 프로바이오틱 조성물을 발견했다. 프로바이오틱 조성물은 인간 장의 상태에 적응된 인간 장 유래 균주인, 비피도박테리움 롱검 아종롱검 균주를 포함한다. 특히, 본 발명의 비피도박테리움 균주는 부다페스트 조약 하에 스페인 유형 배양 컬렉션(CECT)에 수탁 번호 CECT 7894로 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주(본 설명에서는 KABP-042로도 지칭됨)이다. 현저하게, 본 발명의 균주는 다량의 polyP를 생산하는 능력 외에도, 또한 polyP를 생산하면서 성장할 수 있다. 더욱이, 이는 삶의 모든 단계 중에서 인간 미생물총에 존재하는 B. 롱검 아종 롱검에 속하기 때문에, 신생아부터 노인까지 긍정적인 영향을 가질 가능성이 있다. 부가적으로, 본 발명의 발명자들은 균주가 유아 및 성인의 위장 상태, 예를 들어 위 및 담즙염 스트레스에 대한 저항성, 장 상피에 대한 양호한 부착성, 모유로부터의 복합당의 이용에 잘 적응하고 또한 12개월에 걸쳐 단지 3-배수 감소한 우수한 안정성을 갖는다는 것을 입증하였으며, 이는 놀랍게도 당업계에 알려진 다른 비피도박테리아와 다르다.
본 명세서의 작업 실시예는 그 증식 속도를 손상시키지 않으면서 상당한 양의 polyP를 생산하는 본 발명의 프로바이오틱 조성물의 능력을 입증하는 상세한 실험 데이터를 제공한다. 이 균주의 지속적인 증식으로 인해 장의 장벽에 보호 효과가 있는 포스트바이오틱 분자인 polyP의 증가하는 수준의 생산을 가능하게 한다. 더욱이, 본 문맥에서 당업자가 이해하는 바와 같이, 이 비피도박테리움 균주의 자연 서식지는 인간의 장이다. 따라서, 이 균주는 이들 최적의 환경 상태 하에서 증식하면서 polyP를 생산하는 분명한 잠재력을 보여준다.
실시예 1은 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 테스트된 여러 균주(예를 들어, B. 애니멀리스 BB-12, B. 아돌레센티스 JCM 1275, L. 플란타럼 WCFS1 및 B. 스카르도비 BAA-773)와 비교하여 polyP를 생산하는 가장 높은 능력을 가지고 있다는 것을 보여준다. 더욱이, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 polyP을 생산하면서 증식할 수 있는 높은 잠재력을 보여는데, 이는 장의 그 군집화에 중요하고 생애 초기 단계에서 균주의 증식을 허용할 수 있다. 따라서, 이 건강-증진 균주를 유아에게 조기 투여하면 장에 유익할 수 있고 이후 삶의 단계에서도 그 긍정적인 효과를 유지할 수 있다.
장기적인 관점에서, 본 발명의 균주의 증식률이 polyP의 높은 생산으로 인해 손상되지 않는다는 사실은 후속적으로 인간의 장에서 더 많은 양의 polyP를 얻는데 유리하다. 도 2 및 표 2는 본 연구에서 고려되는 모든 시점에서 증식하면서 높은 양의 polyP를 생합성하는 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894의 뛰어난 성능을 보여준다. 마찬가지로, B. 롱검 아종 롱검 36524™, B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707 및 B. 애니멀리스 BB-12도 높은 양의 polyP를 생성하고 높은 증식률을 갖는다. 그러나, 두 B. 롱검 균주는 16시간에 polyP의 높은 생산을 유지할 수 없었고 B. 애니멀리스 BB-12는 16시간에 단지 검출가능한 양의 polyP만 생산할 수 있었다.
더욱이, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 인간 서식 비피도박테리아(HRB) 균주인 반면, B. 애니멀리스 BB-12는 비-HRB 균주로 분류된다. HRB-균주는 건강한 인간의 대변과 구강에서 자주 단리되고 더 양호한 건강-증진 효과를 발휘하고 따라서 그 대사가 인간의 위장관에 적응되기 때문에 인간 사용에 대해 더 양호한 프로바이오틱 후보로 작용한다는 특징이 있다. 반대로, B. 애니멀리스 BB-12는 인간의 장에 적절하게 적응하고 정착하지 못하고, 인간의 장 상태에 내성이 아니고, 높은 양의 polyP를 생성하면서 그 증식 능력을 보유하지 못할 수 있다.
B. 브레베 JCM 1273은 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894와 비교할 때 6시간에서 유사한 증식률을 나타내고, 16시간에서는 더 높은 증식률을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, polyP를 생산하는 그 능력은 두 시점 모두에서 상당히 낮다.
B. 아돌레센티스 JCM 1275는 또한 일부 양의 polyP를 생성할 수 있지만 동시적으로 증식하는 능력은 갖지 않는다. 결과적으로, 균주의 지속적인 존재, 즉 polyP의 지속적인 생산을 달성하는 것이 목표이기 때문에 전반적인 생산이 손상될 수 있다. 비록 이 균주는 성인-유형 HRB로 간주되지만, 성인과 노인에서 풍부하기 때문에 유아에서는 거의 존재하지 않는 것으로 인지되어 있다.
현저히, 게놈 분석 및 시험관내 실험은 실시예 3에서 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 유아 및 성인 위장관에 적절하게 적응할 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 것을 나타냈다. 부가적으로, 아종 B. 롱검 아종 롱검은 유아에서의 유병률과 풍부도가 다른 균주 및 종보다 높은 장기 정착자이고, 따라서 본 발명의 균주는 유아의 장에 정착할 가능성이 높다. 더욱이, B. 롱검 아종 롱검은 또한 성인과 노인의 장에서 널리 퍼져 있어 숙주에게 유익한 효과를 생성한다.
부가적으로, B. 스카르도비는 활성 ppk 유전자를 갖는 것으로 알려져 있고 뛰어난 성장 능력을 가지고 있지만(실시예 1에서 균주 B. 스카르도비 BAA-773으로 나타난 바와 같음), PolyP를 생산하는 그 능력은 미미했다. 더욱이, B. 스카르도비는 병원성 균주로 알려져 있고, 따라서 프로바이오틱 조성물로는 적합하지 않을 것이다.
마지막으로, L. 플란타럼 WCFS1은 polyP 생산을 통해 장의 장벽을 보호하는 것으로 알려져 있지만 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 훨씬 더 높은 양의 polyP를 생성한다. 부가하여, L. 플란타럼은 유아의 장에서 지배적인 그룹이 아니다.
전반적으로, 본 발명의 균주는 대상체에게 동일한 초기 용량의 프로바이오틱 조성물을 투여할 때 가장 높은 양의 polyP를 생산할 수 있을 것이다. 예로서, 서로 다른 연구된 균주의 동일한 cfu를 함유하는 정제를 비교하면, 본 발명의 균주는 가장 많은 양의 polyP를 생산할 수 있는 가장 높은 잠재력을 가지고 있다.
더욱이, 약학적 조성물에서 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 실시예 2 및 도 4에 도시된 바와 같이 생활 박테리아 계수가 시간이 지나도 안정하다는 것을 보여주었다. 이들 결과는 제조 시 3-배수의 과잉용량이 12개월에 109 cfu의 생활 박테리아를 확보하기에 충분하여 프로바이오틱 조성물의 대규모 제조 및 장기 보관이 가능함을 나타낸다.
프로바이오틱 균주 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894의 이 장기 안정성은 많은 프로바이오틱 비피도박테리아 균주가 산소에 대한 내성이 낮고 따라서 적절한 안정성을 나타내지 않는다는 것이 선행 기술에 잘 알려져 있으므로 예상치 못한 것이다. B. 피스크로에로필럼, B. 인디컴 및 B. 아스테로이데스와 같은 일부 비피도박테리아 균주는 더 높은 안정성을 가지지만, 이들은 프로바이오틱 조성물에 적합한 HRB 균주가 아니다. 이에 반해, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 HRB일 뿐만 아니라 높은 안정성을 보이고 따라서 산소에 대한 저항성을 보여준다. 따라서, 이 균주는 장기간 보관이 필요할 수 있는 프로바이오틱 조성물의 제조에 적합할 것이다.
더욱이, B. 롱검 CECT 7894에 의해 생성된 polyP의 효과는 실시예 4에 나타낸 바와 같이 장벽 무결성, 장의 투과성 및 장의 장벽 항상성에 긍정적인 영향을 가지는 것으로 입증되었다. 부가하여, 그러한 효과는 열충격 단백질(HSP27)의 생성 및 밀착 연접 단백질을 포함한 장벽 무결성의 다른 마커의 유도와 관련되며; 이들 모두는 B. 롱검 CECT 7894로부터 유래된 polyP의 존재에 의해 유도되었다는 것도 입증되었다.
부가적으로, 발명자들은 실시예 5에서 B. 롱검 CECT 7894가 모유의 존재에서 polyP를 생성하는 능력을 입증했으며, 이는 수유 중인 유아에서 B. 롱검 CECT 7894의 유익한 효과를 나타낸다. 모유에는 탄수화물 HMO가 함유되어 있다. HMO 락토-N-테트라오스(LNT)는 실시예 3에서 확인된 바와 같이 B. 롱검 CECT 7894에 의해 사용된다. 더욱이, LNT는 B. 롱검 CECT 7894 균주에서 polyP 생합성에 긍정적으로 영향을 미치는 것으로 입증되었다. 현저하게, 실시예 6은 B. 롱검 CECT 7894가 HMO 2'-푸코실-락토스(2'-FL)를 활용할 수 있는 다른 비피도박테리아의 상등액의 존재에서 성장할 수 있음을 보여준다. 전반적으로, 이들 결과는 B. 롱검 CECT 7894가 모유에 가장 풍부한 2가지 HMO(LNT 및 2'-FL)의 존재에서 성장할 수 있어 polyP의 생성을 증가시킬 수 있음을 입증하고, 따라서 예를 들어, 유아에서의 B. 롱검 CECT 7894 보충의 유익한 역할을 강조한다.
전반적으로, B. 롱검 CECT 7894는 성장하는 동안 다량으로 polyP를 생성하여 장의 투과성에 긍정적인 영향을 갖는다는 것이 타당하게 입증된다. 더욱이, HMO의 첨가는 B. 롱검 CECT 7894에서 polyP 생합성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
2022년 5월 30일에 승인된 Xiao 등의 요약에서는 B. 롱검 CECT 7894가 장 미생물총과 담즙산 대사를 조절하는 것을 통해 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유도 대장염에 대한 인플릭시맙의 효능을 개선했다고 결론지었다. 사용된 실험 모델은 마우스에서 DSS 유도 급성 대장염이다. 궤양성 대장염은 명백한 장 염증과 정상적인 장 박테리아에서 변화를 특징으로 하는 염증성 장 질환으로 간주된다. 요약에 기술된 치료는 인플릭시맙(대장염과 같은 염증성 질환 치료에 사용되는 면역억제 효과를 갖는 단클론 항체)과 인플릭시맙 + B. 롱검 CECT 7894이다. B. 롱검 CEC 7894만을 투여받는 동물군은 없다. 인플릭시맙은 인간과 동물 모델 둘 모두에서 대장염을 치료하는데 매우 효과적이지만 이의 사용은 여러 임상 연구에 의해 감염의 증가된 위험과 연관되어 있다(Shah 등 2017).
저자는 B. 롱검 CECT 7894를 인플릭시맙에 추가하면 미생물총과 담즙산 대사가 변화한다고 기술한다. 저자는 담즙산에서의 변화가 이 효과를 설명할 수 있음을 인정한다. B. 롱검 CECT 7894는 비피도박테리움, 블라우티아, 부티리씨코커스, 클로스트리디움, 코프로코커스, 젬미거 및 파라박테로이데스 속의 상대적 풍부도를 증가시키고 엔테로코커스 및 슈도모나스 박테리아 속의 상대적 풍부도를 감소시켰다. 엔테로콕시와 특히 슈도모나스가 병원성이 있을 수 있고 인플릭시맙의 사용이 염증을 감소시키지만 감염 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다는 점을 고려하면 B. 롱검 CECT7894를 첨가하는 것만으로도 인플릭시맙 요법의 단점을 보완할 수 있고 따라서 이미 장에 있는 병원성 박테리아의 수준을 감소시켜 장의 빠른 치유를 촉진한다. 주목할 점은 관찰된 효과는 기존 장내 미생물총 및 인플릭시맙과의 조합에 따라 달라졌다는 것이다.
게다가, 저자는 여러 담즙산에서의 변화와 연관되어 있는 DSS 대장염 모델에서 개선을 보고한다. 그러나, 마우스 및 인간에서 담즙산의 조성은, 전자는 관련 양의 알파 및 베타 무로콜산을 함유하고 있으나 후자에서는 실제로 부재하여 유의하게 다르고, 따라서 발견을 인간에게 일반화하는 것이 제한된다.
반면에, 그들은 일부 매개변수, 예를 들어 밀착 연접(ZO-1, occludin)이 인플릭시맙 + B. 롱검 CECT 7894 그룹에서 개선된다는 것을 공개했지만, 이 효과를 충분히 입증하는 데이터는 없다. 요약하면, 이 요약은 장 미생물총과 담즙산 대사를 조절함에 의해 마우스에서 (DSS) 유도 대장염의 특정 실험 모델에서 인플릭시맙의 효능에 대한 B. 롱검 CECT 7894의 효과에 대한 일부 결과를 보여준다.
특히 인플릭시맙과 결합하더라도 결과가 결정적이지 않은 밀착 연접의 실험에서, 인플릭시맙으로 치료하지 않고 B. 롱검 CECT 7894 단독으로의 효과를 도출할 수 없었다. 더욱이, 논의된 바와 같이, 인플릭시맙과 조합하여 관찰된 효과는 기존 장의 미생물총에 의존하기 때문에 이 연구에 사용된 대장염의 실험 모델과 다른 질환에서의 B. 롱검 CECT 7894의 효과를 도출할 수 없었다.
현저하게, 질환을 개선하는 것에 대한 B. 롱검 CECT 7894의 효과(이전에 언급했듯이, 미생물총과 담즙산 대사를 조절하여 인플릭시맙의 효능을 향상시킴을 통함)는 간접적인 효과로 간주될 수 있다. 이에 반해, 본 발명에서는 B. 롱검 CECT 78994의 직접적인 효과, 즉 폴리포스페이트의 장 상피로의 직접적인 전달을 통해 장의 투과성의 보호가 나타나 있다. 더욱이, 효과는 질환 모델 및 주변 미생물총과 무관하다.
전체적으로, 발명자들은 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894 균주는 특히 장의 장벽 기능장애로 고통받을 때 인간 장에서 유익한 효과를 발휘하는 프로바이오틱 조성물에 바람직한 모든 주요 특성을 포괄한다는 것을 발견하였다. 여기에는 위장 상태에 대한 저항성(위 스트레스 및 담즙염에 대한 그러한 저항성), 삶의 모든 단계 중에 존재하는 종에 속하는 장기 안정성, 및 증식하는 동안 polyP를 생성하는 탁월한 능력이 포함된다. 따라서, 발명에 따른 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894를 함유하는 프로바이오틱 제형은 장의 투과성이 손상된 임의의 임상 상태의 개선에 유용하다.
따라서, 발명은 폴리포스페이트를 생산함에 의해 장의 장벽 기능장애 또는 이의 연관된 병태, 또는 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 장의 장벽 기능장애 또는 이의 연관된 병태, 또는 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 개선하는 방법에 사용하기 위한, 부다페스트 조약 하에 스페인 유형 배양 컬렉션(CECT)에 수탁 번호 CECT 7894로 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 유래된 박테리아 균주는:
(a) 상응하는 상기 기탁된 균주의 게놈과 적어도 99% 동일한 게놈을 갖고;
(b) 폴리포스페이트를 생산하는 데 있어 상응하는 상기 기탁된 균주의 능력을 보유한다.
"부다페스트 조약 하에 스페인 유형 배양 컬렉션(CECT)에 수탁 번호 CECT 7894로 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주로, 여기서 유래된 박테리아 균주는: (a) 상응하는 상기 기탁된 균주의 게놈과 적어도 99% 동일한 게놈을 갖고; (b) 폴리포스페이트를 생산하는 데 있어 상응하는 상기 기탁된 균주의 능력을 보유한다"는 이하 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주로 약칭된다.
또 다른 양태에서, 발명은 대상체에서 증가된 장의 투과성 및 연관된 병태의 치료에 사용되는, B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공하며, 여기서 상기 증가된 장의 투과성의 치료는 폴리포스페이트를 생성함에 의하고, 연관된 병태는 비 장의(non-intestinal) 병태이다.
본 명세서에서는 프로바이오틱 조성물이 장의 장벽 기능장애, 특히 증가된 장의 투과성을 치료하는데 유용하고, 연관된 병태 자체, 즉 장의 장벽 기능장애, 특히 증가된 장의 투과성과 연관된 병태를 치료하는데도 유용하다는 것이 이해된다. 이는 대안적으로 폴리포스페이트를 생성함에 의해 증가된 장의 투과성을 치료함에 의해 본 명세서에 기술된 병태를 치료하는데 사용하기 위한 프로바이오틱 조성물로서 표현될 수 있다.
발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 조합물에 관한 것이다:
(i) B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주, 및
(ii) 적어도 하나의 모유 올리고당,
여기서 조합물은 동시, 별도 또는 순차적 투여를 위해 구성된다.
이 양태는 대안적으로 적어도 하나의 모유 올리고당과 조합하여 사용하기 위해 본 명세서에 기술된 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물에 관해 제형화될 수 있으며, 여기서 조합물은 동시, 별도 또는 순차적 투여를 위해 구성된다.
또 다른 양태에서, 발명은 대상체에서 증가된 장의 투과성 및 연관된 병태의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 바와 같은 조합물에 관한 것이며, 여기서 상기 증가된 장의 투과성의 치료는 폴리포스페이트를 생성함에 의해 이루어지고, 연관된 병태는 면역 장애 또는 질환, 대사성 또는 심혈관 장애 또는 질환, 신경학적 또는 정신과적 장애 또는 질환 및 위장 장애 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 발명은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
(i) B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주; 및
(ii) 적어도 하나의 모유 올리고당.
발명의 양태에 따른 프로바이오틱 조성물, 조합물, 및 조성물들은 본 명세서에 상세히 기술된 다양한 의료적 적용/용도에 대해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 모든 용도는 본 명세서에 개시된 장의 장벽 기능장애 또는 이의 연관된 병태 또는 증상, 합병증 및/또는 후유증의 치료, 예방 또는 개선을 위한 약학적 조성물, 기능식품 조성물, 수의학 조성물, 또는 식품/영양 조성물의 제조를 위한 본 명세서에 기술된 임의의 조성물의 용도로서 대안적으로 공식적으로 나타내어질 수 있다. 이는 또한 대안적으로 발명의 양태에 따라 본 명세서에 기술된 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 장의 장벽 기능장애 또는 연관된 병태, 또는 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체의 본 명세서에 기술된 장의 장벽 기능장애 또는 연관된 병태, 또는 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 개선하는 방법으로 공식적으로 나타내어 질 수 있다.
발명의 청구범위 및 양태에 사용된 용어는 본 설명에서 이의 광범위하고 일반적인 의미로 이해된다. 그럼에도 불구하고, 이는 이하 발명의 상세한 설명에서 정의된다. 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐 단어 "포함하다" 및 그 변형은 다른 기술적 특징, 첨가제, 구성성분 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다. 발명의 추가적인 목적, 이점 및 특성은 설명을 검토함으로 당업자에게 명백해지거나 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 실시형태와 바람직한 실시형태의 모든 가능한 조합을 포괄한다. 다음 실시예 및 도면은 예시적인 목적으로 본 명세서에 제공되고, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
도 1은 연구된 균주의 성장 곡선을 도시한다. PolyP를 추출하고 6시간과 16시간에 정량화했다. OD는 광학 밀도(595nm에서 측정됨)를 의미하고 t(h)는 시 단위로의 시간을 의미한다.
도 2는 성장의 6 및 16시간 후 연구된 균주의 polyP 생합성(nmol)을 도시한다.
도 3은 조사된 비피도박테리아의 균주에서 PPK 단백질 간의 관계를 보여주는 네이버-조이닝 트리를 도시한다.
도 4는 시간이 흐름에 따라 최종 생성물에서 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 안정성을 도시한다. Log cfu에서의 살아있는 박테리아는 월 단위로 시간에 걸쳐(t(m)) 표시된다.
도 5는 HMO 락토-N-테트라오스(LNT), 글루코스(Gluc)의 존재 및 탄소원(C-)의 부재에서 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 성장을 도시한다. OD는 광학 밀도(595nm에서 측정됨)를 의미하고 t(h)는 시 단위로의 시간을 의미한다.
도 6은 polyP의 높은(sb_MEI) 및 낮은(sb_LP) 양을 갖는 B. 롱검 CECT 7894 상등액에 노출된 Caco-2 장벽의 겉보기 투과성 계수(Papp)(왼쪽) 및 경상피 전기 저항(TEER)(오른쪽)을 도시한다. 세포를 대조군으로 MEM, 비-발효된 MEI 및 LP 배지에 노출시켰다.
도 7은 polyP의 높은(MEI) 및 낮은(LP) 양을 갖는 B. 롱검 CECT 7894 상등액에 노출된 Caco-2 세포에서의 HSP27 단백질의 상대적 발현을 도시한다. HSP27 양은 β-액틴 양으로 정규화되었다(왼쪽). HSP27의 상대적 발현과 상등액에서 nmole P로 표현된 polyP의 양의 상관관계(Pearson r=0.87, p=0.01)(오른쪽).
도 8은 polyP의 높은(mei) 및 낮은(lp) 양을 갖는 B. 롱검 CECT 7894 상등액에 노출된 Caco-2 세포에서 밀착 연접 단백질 Zonula ocludens-1(ZO1), 연접성 접착 단백질-1(JAM1) 및 옥클루딩의 상대적 발현(RE)을 도시한다. 발현은 18S rRNA 및 GADPH 유전자 발현에 대해 정규화되었다.
도 9는 6 및 16시간 동안 상이한 조건 하에 인큐베이션된 B. 롱검 CECT 7894 배양물의 polyP 생합성(nmol)을 도시한다: 대조군(C), 모유(BM), LNT, 폴리아민(Polya).
도 10은 탄소원(C-)의 부재에서 그리고, HMO 2'-푸코실-락토스(SN B. 비피덤 2'-FL), 글루코스(Gluc)로 배양된 B. 비피덤 Bb01의 상등액의 존재에서 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 성장을 도시한다. OD는 광학 밀도(595nm에서 측정됨)를 의미하고 t(h)는 시 단위로의 시간을 의미한다.
정의
프로바이오틱 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 적절한 양의 미생물을 함유하는 숙주 유기체에 건강상 이점을 부여할 수 있는 살아있는 비-병원성 미생물, 예를 들어 박테리아를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 숙주 유기체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 숙주 유기체는 인간이다. 비-병원성 박테리아의 일부 종, 균주 및/또는 하위유형은 현재 프로바이오틱으로 인식된다. 프로바이오틱은 박테리아의 변종 또는 돌연변이 균주일 수 있다. 프로바이오틱 박테리아는 원하는 생물학적 특성, 예를 들어 생존성을 유지, 강화 또는 개선하기 위해 자연적으로 돌연변이되거나 유전적으로 조작되고 변형되어 프로바이오틱 특성을 제공하거나 프로바이오틱 특성을 유지, 강화 또는 개선시킬 수 있다.
로부터 유래된: 본 명세서에 사용된 용어 "로부터 유래된", "유도체", "변이체", "돌연변이체"(예를 들어, "돌연변이체 균주") 또는 이의 임의의 문법적 변형은 이로부터 단리되거나 특정한 분자/물질(예를 들어, 본 개시내용의 균주)을 사용하는 만들어진 구성성분을 지칭한다. 예를 들어, 첫 번째 박테리아 균주(예를 들어, 기탁된 균주)로부터 유래된 박테리아 균주는 첫 번째 균주와 동일하거나 실질적으로 유사한 균주일 수 있다. 박테리아 균주의 경우, 유래된 균주는 예를 들어 자연적으로 발생하는 돌연변이유발, 인공적으로 지향된 돌연변이유발, 인공적으로 무작위 돌연변이유발 또는 기타 유전 공학 기술에 의해 얻을 수 있고, 이는 기탁된 균주의 적어도 하나의 능력을 보유, 강화 또는 개선시킨다.
부형제/담체: 이들 용어는 상호교환적으로 사용되고, 화합물, 예를 들어 본 개시내용의 박테리아 균주의 투여를 추가로 촉진하기 위해 예를 들어 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 예에는 중탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 및 예를 들어 폴리소르베이트를 포함한 계면활성제가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "생리학적으로 허용가능한 부형제/담체" 및 "약학적으로 허용가능한 부형제/담체"는 유기체에 유의한 자극을 일으키지 않고 투여된 박테리아 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 무효화하지 않는 물질 또는 희석제를 지칭한다. 보조제가 이들 용어 하에 포함된다.
조성물: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 발명의 양태에 따른 상이한 조성물 및 조합물을 지칭한다. 더욱이, 이는 부형제/담체와 발명 내에서 유용한 적어도 하나의 화합물의 혼합물과 같은 생성물 형태를 지칭한다. 예를 들어, "약학적 조성물"은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 같은 다른 성분과 함께 발명의 박테리아의 제제를 지칭한다. 약학적 조성물은 환자 또는 대상체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 한다.
동일성: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 중합체 분자 사이, 예를 들어 DNA 분자 및/또는 RNA 분자 사이의 단량체 서열의 전반적인 보존을 지칭한다. 임의의 추가적인 한정자 없는 용어 "동일"은 서열이 100% 동일함(100% 서열 동일성)을 의미한다. 두 서열을 예를 들어 "70% 동일함"으로 기술하는 것은, 예를 들어 "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 기술하는 것과 동등하다.
2개의 중합체 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 백분율의 계산은, 예를 들어 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있음). 특정 양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%이다. 그런 다음 폴리뉴클레오티드의 경우 상응하는 염기 위치의 염기가 비교된다.
두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있는, 갭의 수와 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다. 적합한 소프트웨어 프로그램이 단백질과 뉴클레오티드 서열 둘 모두의 정렬에 이용가능하다. 서열 동일성 퍼센트를 결정하는데 하나의 적합한 프로그램은 BLASTN(핵산 서열을 비교하는데 사용됨) 또는 BLASTP(아미노산 서열을 비교하는데 사용됨) 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행하는 bl2seq이다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어, 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 제품군의 일부인, 니들, 스트레처, 워터 또는 매처이다. 서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE, MAUVE, MUMMER, RAST 등과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 양태에서, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 백분율(% ID)은 %ID = 100 × (Y/Z)로 계산되며, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬에서(예를 들어, 육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된 대로) 동일한 일치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기 또는 핵염기의 수이고 Z는 제2 서열에서 잔기의 총 개수이다. 완전하거나 거의 완전한 게놈 핵염기 서열을 비교할 때, %ID는 때때로 ANI(평균 뉴클레오티드 동일성)로 지칭된다. ANI를 계산하는 것은 일반적으로 게놈 서열의 단편화, 이어서 뉴클레오티드 서열 검색, 정렬 및 동일성 계산을 포함한다.
예방하다: 본 명세서에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는", "예방" 및 이의 변형은, 예를 들어, 다음을 지칭한다
(i) 본 명세서에 개시된 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것;
(ii) 본 명세서에 개시된 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특성 또는 임상적 발현, 합병증 또는 후유증의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것;
(iii) 본 명세서에 개시된 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특성, 발현, 합병증 또는 후유증의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것;
(iv) 본 명세서에 개시된 특정 질환, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는
(v) 본 명세서에 개시된 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된 병리학을 전개하는 위험을 감소시키는 것.
대상체: 용어 "대상체", "환자", "개체", "숙주" 및 이의 변형은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 진단, 치료 또는 요법이 바람직한, 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등), 및 실험 동물(예를 들어, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 기니피그 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 조성물은 인간 요법 및 수의학 적용 둘 모두에 적용가능하다.
유아: 용어 "유아"는 이 설명에서 인간 또는 동물의 아주 어린 자손, 예를 들어, 1세 미만의 어린이로 이해된다. 인간에게 적용될 때, 용어는 "아기"라는 용어와 동의어로 간주된다. 용어 "아동"은 출생 단계부터 사춘기 단계 사이의 인간을 지칭한다. "어린 아동"는 1세에서 7세 사이의 아동, "영아"는 1세에서 3세 사이의 아동을 지칭한다. 그러나 본 설명에서 용어 "유아", "아기", "어린 아동" 및 "영아"는 동의어로 간주되고 상호교환적으로 사용된다.
비 유아 인간 또는 비 유아: 본 명세서에 사용된 바와 같은 이들 용어는 7세 초과의 인간을 지칭한다. 비 유아 인간은 십대, 성인 또는 노인(65세 이상)일 수 있다. 이 범주에는 운동선수와 비 유아 허약한 사람도 포함된다.
이를 필요로 하는 대상체: 본 명세서에 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"는 개시내용의 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체, 예컨대 포유동물 대상체를 포함한다.
치료적으로 유효한 양: 용어 "치료적으로 유효한 용량" 및 "치료적으로 유효한 양"은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 원하는 치료적 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성하기에 충분한 본 개시내용의 조성물의 양을 지칭하기 위해 사용된다. 특히, 용어는 병태, 예를 들어, 설사의 예방, 증상 발병의 지연 또는 증상의 완화를 초래하는 화합물의 양을 지칭한다. 치료적으로 유효한 양은, 예를 들어, 손상된 장 장벽 기능과 연관된 질환 또는 병태의 치료, 예방, 중증도 감소, 발병 지연 및/또는 하나 이상의 증상의 발생의 위험을 감소시키기 충분할 수 있다. 치료적으로 유효한 양뿐만 아니라 치료적으로 유효한 투여 빈도는 당업계에 공지되어 있고 아래에서 논의되는 방법에 의해 결정될 수 있다.
치료: 본 명세서에 사용된 용어 "치료하다", "치료", "요법"은, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 질환 또는 병태의 중증도에서 감소; 본 명세서에 개시된 질환(예를 들어, 장의 장벽 기능장애 또는 연관된 병태)과 연관된 하나 이상의 증상, 합병증 또는 후유증의 완화/개선 또는 제거; 질환 또는 병태를 반드시 치료할 필요 없이, 본 명세서에 개시된 병태/질환을 앓고 있는 대상체에게 유익한 효과의 제공을 지칭한다. 용어는 또한 질환이나 병태, 또는 이의 증상, 합병증 또는 후유증의 예방 또는 방지를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 표현 "치료하는"은 질환, 또는 이의 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 개선하는 것을 포괄한다.
용어는 예를 들어 본 개시내용의 조성물로의 치료의 부재에서 예상되는 것과 관련하여, 질환 또는 병태를 예방하거나; 질환 또는 병태를 치유하거나; 질환 또는 병태의 발병을 지연시키거나; 증상, 합병증 또는 후유증의 발병을 지연시키거나; 질환 또는 병태의 심각성을 감소시키거나; 증상, 합병증 또는 후유증의 심각성을 감소시키거나; 하나 이상의 증상을 개선하거나; 하나 이상의 합병증을 개선하거나; 하나 이상의 후유증을 개선하거나; 하나 이상의 증상을 예방하거나; 하나 이상의 합병증을 예방하거나; 하나 이상의 후유증을 예방하거나; 하나 이상의 증상을 지연시키거나; 하나 이상의 증상을 지연시키거나; 하나 이상의 합병증을 지연시키거나; 하나 이상의 후유증을 지연시키거나; 하나 이상의 증상을 완화/개선하거나; 하나 이상의 합병증을 완화/개선하거나; 하나 이상의 후유증을 완화/개선하거나; 하나 이상의 증상 기간을 단축하거나; 하나 이상의 합병증 기간을 단축하거나; 하나 이상의 후유증의 기간을 단축하거나; 하나 이상의 증상의 빈도를 감소시키거나; 하나 이상의 합병증의 빈도를 감소시키거나; 하나 이상의 후유증의 빈도를 감소시키거나; 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키거나; 하나 이상의 합병증의 중증도를 감소시키거나; 하나 이상의 후유증의 중증도를 감소시키거나; 삶의 질을 향상시키거나; 생존율 증가시키거나; 질환 또는 병태의 재발을 예방하거나; 질환 또는 병태의 재발을 지연시키기 위한 임상적 또는 영양적 개입; 또는 이의 임의의 조합을 지칭한다.
식이 관리 및/또는 식이 2차 예방: 이들 용어는 질환, 장애 또는 의학적 상태로 인해, 환자가 일반 음식이나 그 안에 함유된 특정 영양소, 또는 대사산물을 섭취하고, 소화하고, 흡수하고, 대사하거나 배설하는 능력이 제한되거나, 손상되거나, 교란되거나, 또는 기타 의학적으로 결정된 영양소 요구사항이 있는 것으로부터 고통을 받는 환자의 배타적 또는 부분적 급식을 지칭한다. 본 설명에서 "치료하는" 또는 "치료"는 식이 관리 및/또는 식이 2차 예방을 포괄한다.
증상: 본 명세서에 사용된 이 용어는 대상체에 의해 관찰된 질환 또는 신체적 장애의 주관적 또는 신체적 표시, 징후 또는 증거를 지칭한다. 일반적으로, 용어는 환자에 의해 경험된 임의의 병적 현상 또는 구조, 기능 또는 감각에서의 정상으로부터 벗어난 것 및 질환을 나타내는 것을 지칭한다. 증상은 증상을 경험하는 개체에 의해 느껴지거나 인지되지만, 다른 사람에 의해 쉽게 인지되지 않을 수도 있다. 일부 실시형태에서, 증상은 경증 증상, 중등도 증상 또는 중증 증상일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "경증 증상"은 생명을 위협하지 않고 예를 들어 집중 치료가 필요하지 않은 증상을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "중등도 증상"은 생명을 위협할 수 있고, 예를 들어 입원을 요구할 수 있으므로 모니터링이 필요한 증상을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "중증 증상"은 생명을 위협하고 예를 들어 집중 치료가 필요한 증상을 지칭한다.
합병증: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 질환 또는 병태의 필수적인 부분이 아닌 질환 또는 병태 중에 발생하는 병리학적 과정 또는 사건을 지칭하며; 여기서 그것은 질환/병태 또는 독립적인 원인으로 인해 발생할 수 있다. 예를 들어, 항생제나 비스테로이드성 항염증성 약물로 의료적 병태의 치료는 부작용으로 장에서의 상피 손상을 초래하여 증가된 투과성을 야기할 수 있다. 이 증가된 투과성은 장기적인 합병증으로 알레르기, 염증 또는 대사성 질환의 증가된 위험을 야기할 수 있다. 일부 양태에서, 합병증은 일시적일 수 있다. 일부 양태에서 합병증은 만성적이거나 영구적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "후유증"은 장기간, 만성 또는 영구적 합병증을 지칭한다.
장의 장벽: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 내부 숙주로부터 장의 내강을 분리하는 기능적 실체를 지칭하고, 기계적 요소(점액, 상피층), 체액성 요소(디펜신, IgA), 면역학적 요소(림프구, 선천성 면역 세포), 근육, 신경학적 요소 및 미생물총으로 이루어진다.
장의 투과성: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 특히 장의 벽 전체를 가로지르거나 벽 구성성분을 가로지르는 플럭스 속도를 분석함에 의해 측정가능한 특정 부위에서의 장의 장벽의 기능적 특성을 지칭한다. 장의 투과성은 위장관 내부에서 장 벽을 감싸는 세포를 통해 신체의 나머지 부분으로 통과하는 물질의 제어를 지칭한다. 건강한 장은 선택적 투과성을 나타내어, 영양소가 장을 통과할 수 있도록 하는 동시에 잠재적으로 유해한 물질(예컨대 항원)이 장을 떠나 신체로 더 광범위하게 이동하는 것을 방지하는 장벽 기능을 유지한다.
정상적인 장의 투과성: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 중독, 염증 또는 손상된 장 기능의 징후가 없는 건강한 개체에서 발견되는 안정적인 투과성을 지칭한다.
장의 장벽 기능장애: 용어 "장의 장벽 기능장애", "손상된 장의 투과성", "장의 투과성 불균형" 및 "비정상적인 장의 투과성"이라는 상호교환적으로 사용되고, 정상적인 투과성과 비교하여 비-일시적으로 변화되어 장의 항상성 상실, 기능의 손상 및 질환으로 이어지는 교란된 투과성을 지칭한다.
증가된 장의 투과성: 본 명세서에 사용된 용어 "증가된 장의 투과성"은 장 상피 벽의 접합부가 무결성을 상실하여 내강으로부터 물질이 혈류, 다른 기관 또는 지방 조직으로 전위되는 상태를 지칭한다. 장 벽의 밀착 연접이 느슨해지면 장은 더 투과성이 되어 박테리아와 독소가 장에서 혈류로 통과할 수 있다. 이 현상이 일반적으로 예를 들어 "장 누수"로 지칭된다.
증가된 장의 투과성은 크론병, 복강병, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 류마티스 관절염, 척추관절병증, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 정신분열증, 특정 유형의 암, 비만, 지방간, 아토피, 및 알레르기 질환 등과 같은 여러 질환에서의 인자이다. 대부분의 경우에 증가된 투과성이 질환 이전에 전개되지만, 대부분의 이들 질환에서 증가된 장의 투과성 사이의 인과 관계는 명확하지 않다. 이 이유로, "장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성 및 연관된 병태")가 본 명세서에서 사용된다.
"장의 장벽", "장의 투과성", "정상 장의 투과성", "장의 장벽 기능장애", "손상/증가된 장의 투과성"은 Bischoff 등, 2014에서도 정의된 용어이다.
모유 올리고당: 이 용어는 HMO로 약칭되고 "모유 글리칸"으로도 알려져 있고, 집합적으로 모유에 존재하는 이들 올리고당을 지칭하며, 락토스와 지방에 이어 모유에서 세 번째로 큰 고형 성분을 구성한다. HMO는 일반적으로 환원 말단에 락토스와 비-환원 말단에 푸코스 또는 시알산을 함유하는 탄수화물 코어로 구성되는 단순한 당류의 짧은 중합체이다. HMO는 수유 단계에 따라 모유에 11.3-17.7g/L의 농도로 존재한다. 대략적으로 200개의 구조적으로 서로 다른 HMO가 알려져 있고, 이들은 서로 다른 분류에 따라, 예를 들어, 푸코실화, 시알릴화 및 중성 코어 HMO로 분류될 수 있다. 모유에서 모유 올리고당의 구성은 각 모체에 대해 각기 다르고 수유 기간에 걸쳐서 다양하다. 모든 여성의 80%에서 지배적인 올리고당은 2'-푸코실락토스이며, 이는 모유에 대략적으로 2.5g/L의 농도로 존재하며; 다른 풍부한 올리고당에는 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스 및 락토-N-푸코펜타오스가 포함된다.
합성 혼합물: 이는 화학적 및/또는 생물학적 수단으로 얻은 혼합물을 의미하며, 이는 예를 들어 포유류의 젖에서 자연적으로 발생하는 혼합물과 화학적으로 동일할 수 있다. 본 명세서에 기술된 모든 조성물은 합성 혼합물이다.
영양 조성물: 이 용어는 대상체에게 영양을 공급하는 조성물을 지칭한다. 이 영양 조성물은 일반적으로 경구 또는 정맥주사로 복용되고, 일반적으로 지질이나 지방원 및 단백질원을 포함한다. 특히, 영양 조성물은 대상체의 영양적 요구의 전부 또는 대부분을 충족시키는 완전한 영양 혼합물(예를 들어, 유아용 조제분유)이다. 영양 조성물은 식품으로 구성된다.
유아용 조제분유: 본 명세서에 사용된 이 용어는 생후 첫 달 동안 유아에 의한 특정 영양학적 사용을 위해 의도되고 그 자체로 이 범주의 사람들의 영양 요구사항을 충족하는 식품을 지칭한다(유아용 조제분유 및 후속 조제분유에 대한 2006년 12월 22일의 유럽 위원회 지침 91/321/EEC 2006/141/EC의 2(c)조). 이는 또한 Codex Alimentarius(Codex STAN 72-1981) 및 Infant Specialties(특수 의료 목적을 위한 식품 포함)에서 정의된 유아용 영양 조성물을 지칭한다. 용어 "유아용 조제분유"는 제한 없이 다음 형태를 포괄한다.
스타터 조제분유: 이것은 생후 첫 6개월 동안 유아에 의한 특정 영양학적 사용을 위해 의도된 식품을 의미한다.
후속 조제분유 또는 이어지는 조제분유: 이것은 6개월 이후부터 제공되어질 수 있다. 이것은 이 범주의 사람들의 점차 다양해지는 식이에서 주요 액체 요소를 구성한다.
유아용 조제분유, 이어지는 조제분유 및 스타터 유아용 조제분유는 액상, 즉석섭취용 또는 농축형의 형태일 수도 있고, 물을 첨가하면 재구성되어 조제분유를 형성할 수 있는 건조 분말의 형태일 수도 있다. 이러한 조제분유는 당업계에 잘 알려져 있다.
이유식: 이것은 생후 첫 몇 년 동안 영유아에 의한 특정 영양학적 사용을 위해 의도된 식품을 의미한다.
유아용 시리얼 조성물: 이것은 생후 첫 몇 년 동안 영유아에 의한 특정 영양학적 사용을 위해 의도된 식품을 의미한다.
강화제: 이것은 모유 또는 유아용 조제분유와 혼합하기에 적합한 액상 또는 고형 영양 조성물을 지칭한다.
성장기 우유: 이것은 어린 아이들의 특정한 영양 요구에 맞춰 조정된 우유-기반 음료를 의미한다.
이유기: 이것은 유아의 식이에서 모유가 다른 음식으로 대체되는 기간을 의미한다.
장내 투여: 이것은 위장관(위 포함)에 조성물의 침착을 야기하는 비 유아에게 조성물의 전달을 위한 임의의 통상적인 형태를 의미한다.
경구 투여: 이것은 입을 통하여 비 유아에게 조성물의 전달을 위한 임의의 통상적인 형태를 의미한다. 따라서, 경구 투여는 장내 투여의 형태이다.
프로바이오틱 조성물
일 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 수탁번호 CECT 7894 하에 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검을 포함한다.
균주 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 WO2015018883A2에 기술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 균주는 2011년 3월 30일(30.03.2011)에 스페인 유형 배양 컬렉션(CECT, Parc Cient
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fic de la Universitat de Val
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ncia, Carrer del Catedrtic Agust
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n Escardino Benlloch, 9, 46980 Paterna, Valencia, Spain)에 수탁 번호 CECT 7894로 기탁되었다. 기탁은 부다페스트 조약의 조건 하에서 수행되었고, 생존가능하고 그 기탁과 관련된 모든 특성을 유지한다. 그것은 동일한 신청자에 의해 기탁되었다.
비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894(본 설명에서는 KABP-042로도 지칭됨)는 건강한 모유수유 유아의 대변에서 단리되었다. CECT 7894의 인실리코 및 시험관내 분석은 균주가 인간 위장관의 문제(위 상태 및 담즙염)를 견디고 장 상피에 부착된다는 것을 확인하는 이 균주의 프로바이오틱 속성을 연구하기 위해 수행되었다. 유전형 분석은 이들 특성을 확인하였다.
모유 올리고당(HMO)은 모유에서 발견되는 복합당으로 그 활용은 비피도박테리아 중에서 균주-특이적이다. B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 시험관내에서 HMO 락토-N-테트라오스(모유에서 발견되는 가장 일반적인 HMO 중 하나)를 활용할 수 있는 것으로 본 명세서에서 밝혀졌다. 일치하게, 그 게놈은 액토-N-바이오시다제, 베타-갈락토시다제, 알파-갈락토시다제, 헥소사미니다제 및 베타-글루쿠로니다제를 포함한 대부분의 전형적인 HMO-분해 유전자를 갖는다. 이 분석은 균주가 HMO 활용에 적응되고 따라서 유아 장에 적응됨을 확인한다.
더욱이, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 그 게놈의 다른 유전자가 탄수화물 활성 효소(CAZy)를 인코딩하므로 다양한 탄수화물 대사기능을 가지고 있으며, 이는 광범위한 복합 기질을 분해하는 그 능력을 시사한다. 부가하여, 란티펩티드 B, 세르핀 및 어드헤신을 인코딩하는 유전자도 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894의 게놈에 존재한다. 란티펩티드 B(란티바이오틱)는 광범위의 그람-음성 및 그람-양성 병원성 박테리아에 대해 강력한 항균 활성을 나타내는 클래스-I 박테리오신이다. 세르핀은 인간 호중구 및 췌장 엘라스타제(프로테아제)를 선택적으로 불활성화하여 항염증 효과를 초래하고 장 항상성을 유지하는데 기여한다.
전반적으로, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894의 표현형 및 유전형 분석은 본 명세서에서 균주가 HMO를 분해할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 유아 장을 포함한 인간 위장관에 잘 적응됨을 확인시켜 준다.
본 맥락에서 당업자가 이해하는 바와 같이, 박테리아 균주는 그 자연 환경으로부터 단리되었으며, 즉 그것은 자연 환경에 존재하지 않으므로 자연 환경에 존재하는 다른 유기체 및 물질이 없다.
박테리아에서의 항균제에 대한 내성의 출현과 확산은 인간과 동물의 건강에 위협을 제기하고 막대한 재정적, 사회적 비용을 초래한다. 전체 게놈 서열 분석에 의해 신규한 균주 B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894는 일반적으로 사용되는 항생제에 전염될 수 있는 항생제 내성 유전자를 보유하지 않는다. 전반적으로, 이들 결과는 병원성 종에 대한 항생제 내성의 잠재적인 전이의 위험을 배제한다.
출발 물질로서 기탁된 균주를 사용함에 의해, 당업자는 일상적으로, 통상적인 돌연변이유발 또는 재-단리 기술에 의해, 본 명세서에 기술된 관련 특성 및 발명의 조성물을 형성하는 균주의 이점을 유지, 강화 또는 개선하는 추가의 변이체 또는 돌연변이체를 얻을 수 있다는 것이 분명하다. 따라서, 발명은 또한 본 명세서에 개시된 균주의 변이체/돌연변이체에 관한 것이다. 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 균주 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하며, 여기서 상기 유래된 박테리아 균주는:
(a) 상응하는 상기 기탁된 균주 CECT 7894의 게놈과 적어도 99%의 평균 뉴클레오티드 동일성(ANI)을 갖는 게놈을 갖고; 그리고
(b) 상응하는 상기 기탁된 균주의 폴리포스페이트를 생산하는 능력을 보유, 강화 또는 개선한다.
특정 실시형태에서, 기탁된 균주로부터 유래된 박테리아 균주는 상응하는 기탁된 균주의 게놈에 대해 적어도 99%의 평균 뉴클레오티드 동일성(ANI)을 갖는 게놈을 가지며; 보다 특히, 동일성의 %는 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%이다. 특히 ANI의 %는 적어도 99.5%이다. 보다 특히, ANI의 %는 99.50%, 99.51%, 99.52%, 99.53%, 99.54%, 99.55%, 99.56%, 99.57%, 99.58%, 99.59%, 99.60%, 99.61%, 99.62%, 99.63%, 99.64%, 99.65%, 99.66%, 99.67%, 99.68%,99.69%, 99.70%, 99.71%, 99.72%, 99.73%, 99.74%, 99.75%, 99.76%, 99.77%, 99.78%, 99.79%, 99.80%, 99.81%, 99.82%, 99.83%, 99.84%, 99.85%, 99.86%, 99.87%, 99.88%, 99.89%, 99.90%, 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 또는 99.99%이다. 다른 실시형태에서, ANI의 %는 적어도 99.9%이고; 특히 ANI의 %는 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 또는 99.99%이다.
일부 실시형태에서, 돌연변이는 자연적으로 발생하는 돌연변이유발, 인공적으로 지향된 돌연변이유발, 또는 인공적으로 무작위 돌연변이유발에 의해 획득된다. 일 특정 실시형태에서, 기탁된 균주로부터 유래된 박테리아 균주는 재조합 DNA 기술을 사용하여 획득된다. 따라서, 발명의 또 다른 양태는 기탁된 균주로부터 유래된 균주를 얻는 방법에 관한 것으로, 여기서 방법은 기탁된 균주를 출발 물질로 사용하고 돌연변이유발을 적용하는 것을 포함하고, 여기서 획득된 변이체 또는 돌연변이체는 본 명세서에 개시된 기탁된 균주의 적어도 하나의 능력을 추가로 보유, 강화 또는 개선시킨다.
발명의 조성물의 일부를 형성하는 균주는 생존가능한 세포의 형태일 수 있다. 대안적으로, 균주는 비-생존가능한 세포의 형태일 수 있다. 여기에는 열적으로 사멸된 미생물이나 변경된 pH, 초음파 처리, 방사선 또는 고압에 대한 노출에 의해 사멸된 미생물이 포함될 수 있다. 세포가 식이요법, 의약품 또는 식용 제품에 쉽게 통합될 수 있고, 저장 요건이 생존가능한 세포에 비해 훨씬 덜 제한되기 때문에, 비-생존가능한 세포로의 생성물 조제가 더 간단하다. 비-생존가능한 세포로서 발명의 균주를 포함하는 조성물은 배지에 있는 균주로부터 유래된 생성물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 균주는 적합한 인공 배지 및 적합한 조건 하에서 박테리아를 배양(또는 발효)시킴에 의해 생산된다. 표현에 따르면, "인공 배지"는 천연 물질을 함유하고 선택적으로 혈청의 기능 중 일부를 재현할 수 있는 중합체 폴리비닐 알코올과 같은 합성 화학물질을 함유하는 배지로 이해된다. 일반적으로 적합한 인공 배지는 박테리아 성장에 필요한 탄소원(예를 들어, 글루코스), 질소원(예를 들어, 아미노산 및 단백질), 물 및 염분을 포함한 요소를 함유하는 영양 배지이다. 성장 배지는 액체 형태일 수 있거나 종종 한천이나 다른 겔화제와 혼합하여 고체 배지를 얻을 수 있다. 균주는 단독으로 배양하여 순수 배양물을 형성할 수 있거나, 다른 미생물과 함께 혼합된 배양으로, 또는 서로 다른 유형의 박테리아를 별도로 배양한 다음 원하는 비율로 혼합하여 배양할 수 있다. 배양 후 최종 제형에 따라, 균주를 정제된 박테리아로 사용할 수 있거나, 대안적으로 박테리아 배양물 또는 세포 현탁액을 그대로 또는 적절한 후-처리 후에 사용할 수 있다. 본 설명에서, 용어 "바이오매스"는 배양(또는 배양과 동의어인 용어로서 발효) 후에 획득된 박테리아 균주 배양물인 것으로 이해된다.
특정 실시형태에서, 균주를 인공 배지에서 발효시키고, 발효 후 후-처리를 거쳐 박테리아 세포를 얻고, 생성된 박테리아 세포는 액체 배지 또는 고체 형태이다. 특히, 후-처리는 건조, 동결, 동결-건조, 유동층-건조, 분무-건조 및 액상배지에서의 냉장으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 특히는 동결-건조이다.
용어 "후-처리"는 현재 문맥에서 저장가능한 박테리아 세포를 얻기 위한 목적으로 바이오매스에 대해 수행되는 임의의 가공으로 이해되어야 한다. 후-처리의 목적은 바이오매스에서 세포의 대사적 활성을 감소시켜 세포 유해 반응의 속도를 늦추는 것이다. 후-처리의 결과로, 박테리아 세포는 고체 또는 액체 형태가 될 수 있다. 고체 형태에서 저장된 박테리아 세포는 분말이나 과립일 수 있다. 임의의 경우에, 박테리아 세포를 함유한 고체 및 액체 형태 둘 모두는 자연에 존재하지 않으며, 따라서 이는 인공적인 후-처리 과정의 결과이기 때문에 자연적으로-발생하지 않는다. 후-처리 과정은 특정 실시형태에서 소위 후-처리 작용제 중 하나 이상의 사용을 요구할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 표현 "후-처리 작용제"는 본 명세서에 기술된 후-처리 과정을 수행하는데 사용되는 화합물을 지칭한다. 후-처리 작용제 중에는, 단독으로 또는 조합하여 사용되는, 탈수 작용제, 정균 작용제, 동결-보호 작용제(동결보호제), 불활성 충전제(냉동보호제로도 알려짐), 담체 물질(코어 물질로도 알려짐) 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 세포의 대사적 활성을 감소시키는 2가지 기본적 접근법이 있고, 따라서 후-처리를 수행하는 2가지 접근법이 있다. 첫 번째는 모든 화학반응의 속도를 감소시키는 것으로, 냉장고, 기계 냉동고, 액체 질소 냉동고를 사용하여 냉장 또는 동결에 의해 온도를 낮춤으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 모든 화학 반응의 속도를 감소시키는 것은 박테리아 세포의 성장을 억제하는 물질, 즉 Bstatic으로 약칭된 정균 작용제를 첨가함에 의해 달성될 수 있다.
후-처리를 수행하는 두 번째 접근법은 바이오매스로부터 물을 제거하는 것이며, 이것은 동결건조기를 사용한 물의 승화를 포함할 수 있다. 바이오매스로부터 물을 제거하는데 적합한 기술은 건조, 동결-건조, 분무-건조 또는 유동층-건조이다. 고체 형태를 초래하는 후-처리는 건조, 동결, 동결-건조, 유동층-건조 또는 분무-건조일 수 있다.
후-처리는 특히 동결-건조이며, 이는 감압 하에서 승화에 의하여 동결된 박테리아 현탁액에서 물의 제거를 포함한다. 이 과정은 생성물을 사전-동결하여 동결된 구조를 형성하는 단계, 1차 건조하여 대부분의 물을 제거하는 단계, 및 2차 건조하여 결합수를 제거하는 단계인 3 단계로 구성된다. 동결건조된 박테리아 배양물의 제조 및 단리를 위한 산업적 과정의 객관적이고 예상되는 가변성으로 인해, 후자는 일반적으로 냉동보호제라고도 알려진 일정량의 불활성 충전제를 함유한다. 그 역할은 생성물에 살아있는 프로바이오틱 박테리아의 함량을 표준화하는 것이다. 상업적으로 이용가능한 동결건조된 배양물에는 다음의 불활성 충전제가 사용된다: 수크로스, 사카로스, 락토스, 트레할로스, 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 옥수수 전분, 이눌린 및 기타 약학적으로 허용가능한 비-흡습성 충전제. 선택적으로, 아스코르브산과 같은 기타 안정화제 또는 동결-보호 작용제를 또한 사용하여 점성 페이스트를 형성하고 이를 동결-건조한다. 임의의 경우에, 이렇게-획득된 물질은 분말을 포함하여 적절한 크기로 분쇄될 수 있다.
바이오매스를 고체 형태로 보존하는 대신, 바이오매스를 액체 형태로 보존할 수도 있다. 이는 배양 배지에 또는 세포를 수확하는 중간 단계로 박테리아 성장을 멈추기 위해 상기에서 기술된 정균 작용제를 첨가하고, 정균 작용제를 갖는 식염수 용액에서 펠렛을 재-현탁하고, 선택적으로 냉장함에 의해 수행될 수 있다.
때때로, 예로서 유동층-건조 과정에서 상기에서 기술된 바와 같이, 프로바이오틱 조성물은 유통기한 및/또는 기능성을 개선하기 위해 고정화 및/또는 코팅 또는 캡슐화 과정을 거치게 된다. 박테리아의 고정화, 코팅 또는 캡슐화를 위한 여러 기술이 당업계에 알려져 있다.
다른 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은, 예를 들어, 리포솜, 마이크로버블, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐 등의 캡슐화의 수단에 의해 지속-방출 투여용으로 제형화된다. 적절한 지속-방출 형태뿐만 아니라 이의 제조를 위한 재료 및 방법은 최신 기술에 잘 알려져 있다. 따라서, 발명의 임의의 프로바이오틱 조성물의 경구로 투여가능한 형태는 적어도 하나의 코팅 또는 매트릭스를 추가로 포함하는 지속-방출 형태이다. 지속 방출 코팅 또는 매트릭스는, 제한 없이, 천연 반-합성 또는 합성 중합체, 수-불용성 또는 변형된, 왁스, 지방, 지방 알코올, 지방산, 천연, 반합성 또는 합성 가소제 또는 이들 중 둘 이상의 조합을 포함한다. 장용 코팅은 당업자에게 공지된 통상적인 과정을 사용하여 적용될 수 있다.
조성물에서 균주에 대한 콜로니 형성 단위(cfu)의 유효량은 당업자에 의해 결정될 것이고 최종 제형에 따라 달라질 것이다. 용어 "콜로니 형성 단위"("cfu")는 한천 플레이트 상의 미생물 계수에 의해 밝혀진 박테리아 세포의 수로 정의된다.
당업자에게 알려진 바와 같이, 콜로니 단위의 유효량은 활성 형광 단위의 유효량에 의해 측정될 수도 있다. 용어 "활성 형광 단위"("afu")는 추정되는 살아있는 세포의 형광 특성에 대해 특이적인 게이트에서 유세포 분석 계수에 의해 밝혀진 박테리아 세포의 수로 정의된다. 따라서, 당업자는 상기-언급된 특정 양의 cfu가 거의 동일한 양의 afu인 것을 고려할 것이다.
일 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 고체 조성물이다. 다른 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 액체 조성물이다.
다른 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 약 105 cfu 내지 약 1012 cfu의 균주; 보다 특히 약 108 cfu 내지 약 1011 cfu의 균주를 포함하는 동결-건조된 박테리아 바이오매스를 포함한다.
실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 동결보호제를 포함한다. 특히, 프로바이오틱 조성물은 알레르겐-유리 동결보호제인 적어도 하나의 동결보호제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 말토스, 트레할로스, 만니톨(특히, d-만니톨), 사카로스, 락토스, 덱스트로스, 아스코르브산나트륨, 시트르산나트륨, L-시스테인, 말토덱스트린, 무수 덱스트로스, 전분, 셀룰로오스 및 이눌린과 같은 적어도 하나의 동결보호제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 동결보호제 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체는 트레할로스, D-만니톨, 덱스트로스, 아스코르브산나트륨, 시트르산나트륨, L-시스테인, 말토덱스트린, 전분 및 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 전분은 옥수수, 옥수수 전분 및/또는 감자 전분이다.
보다 구체적으로, 조성물은 에멀젼, 현탁액, 겔, 페이스트, 과립, 분말 및 검으로부터 선택된 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 특히, 담체는 알레르겐-유리 담체이다.
일부 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 말토덱스트린, 셀룰로오스, 다양한 유형의 전분, 이눌린, 락토스, 또는 수분 활성이 감소된 담체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 담체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 다음을 포함하는 조성물이다:
- 약 105 cfu 내지 약 1012 cfu의 균주를 포함하는 동결-건조된 박테리아 바이오매스;
- 에멀젼, 현탁액, 겔, 페이스트, 과립, 분말 및 검으로부터 선택된 동결보호제 및/또는 약학적으로 허용가능한 담체.
폴리포스페이트 생산
일 실시형태에서, 균주 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주의 폴리포스페이트의 생산은 폴리포스페이트 생산이 다음 단계에 의해 배양 6시간 및/또는 16시간에서 결정될 때 대조군 균주의 폴리포스페이트의 생산보다 높다:
(a) 37℃에서 혐기성 조건 하에서 0.5% 효모 추출물, 0.5% 트립톤, 0.4% K2HPO4, 0.5% K2HPO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.005% MnSO4, Tween 80 1ml, 0.05% 시스테인 및 0.5% 글루코스를 함유하는(리터당, w/v) 말산 효소 유도 배지(MEI)에서 OD 0.1에서 접종된 균주를 배양하는 단계;
(b) 실온에서 45분 동안 가볍게 교반하면서 5% 차아염소산나트륨 1ml에서 원심분리 및 용리에 의해 세포를 수확하는 단계;
(c) 불용성 물질을 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 원심분리하여 펠렛을 얻고, 1.5M NaCl 1ml에 더하여 1mM EDTA로 16,000g에서 4℃에서 5분 동안 2회 세정하는 단계;
(d) 1ml의 물로 2번 연속 세정하여 상기 펠렛으로부터 polyP를 추출하고 그 사이에 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 원심분리하는 단계;
(e) 0.1M NaCl 및 1 부피의 에탄올을 첨가하고 이어서 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하여 풀링된 물 추출물에 polyP를 침전시키는 단계;
(f) 16,000g에서 10분 동안 원심분리하고 polyP 펠렛을 50μL의 물에 재현탁시키는 단계;
(g) 다음 단계에 따라, polyP 유래 포스페이트 양과 형광 강도를 연관시키는 표준 곡선을 구축하는 단계:
i. 락토바실러스 플란타럼 WCFS1(Alcntara 등 2014)과 같은 PolyP-생산자 대조군 균주로부터 단리된 PolyP의 샘플의 일련의 희석액을 1 부피의 2M HCl로 가수분해하고 95℃에서 15분 동안 인큐베이션하는 단계;
ii. 절반 부피의 2M NaOH를 첨가함에 의해 상기 희석액을 중화시키는 단계;
iii. BIOMOL Green 키트로 방출된 포스페이트를 측정하여 각 희석액에서 포스페이트의 양을 획득하는 단계;
iv. 형광측정기에서 415nm의 여기 파장 및 550nm에서 방출로 50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 완충액 중 최종 농도 10μM에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, DAPI를 사용하여 형광에 의해 방출된 포스페이트를 측정하여 각 희석액에서 형광 값을 획득하는 단계; 및
v. (iii)에서 획득된 포스페이트 값과 (iv)에서 획득된 상응하는 형광 값을 사용하여 표준 곡선을 구축하는 단계; 및
(h) 단계 (f)의 재현탁된 분획으로부터 polyP를 정량화하는 단계:
1) 형광측정기에서 415nm의 여기 파장 및 550nm에서 방출로 50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 완충액에서 최종 농도 10μM에서 DAPI를 사용하여 형광에 의해 polyP를 측정하는 단계;
2) 표준 곡선의 수단에 의해 polyP의 양을 계산하는 단계; 및
3) polyP 값을 포스페이트의 nmol 단위로 표현하는 단계.
본 명세서에서의 작업 실시예 1(재료 및 방법의 섹션 1.1.2)은 발명의 실시형태의 단계 (a)-(h)로 언급된 바와 같이, polyP를 정량화하고 결과적으로 박테리아 균주의 polyP를 생산하는 능력을 평가하는데 적합한 검정의 자세한 설명을 제공한다.
발명의 실시형태의 단계 (a)-(h)에 개시된 polyP 정량화의 설명 및 조건이 발명의 범주를 제한하지 않는다는 점에 유의하는 것이 관련이 있다. 검정은 박테리아 균주(예를 들어, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894)의 polyP 생산 능력을 테스트하는데 적합한 방법 중 하나이다. 본 실시예 1의 상세한 조건은 본 명세서에서 관심있는 (유래된) 박테리아 균주가 본 발명의 실시형태의 기준에 부합하는지를 결정하기 위한 특정 검정을 형성한다.
따라서, 본 명세서에 기술된 상세한 검정에 기반하여, 당업자는 관심있는 특정 박테리아 균주가 본 발명의 실시형태의 polyP를 생성하는 능력을 갖는지 여부를 객관적으로 결정하기 위해 이 검정을 일상적으로 반복할 수 있다.
언급한 바와 같이, polyP의 생산은 상술한 방법의 수단에 의해 정량화될 수 있다. 이러한 방법은 차아염소산나트륨으로 세포에서 polyP를 추출하는 것부터 시작하여 추출된 polyP를 DAPI로 염색하고 샘플의 형광을 정량화하는 3가지 주요 단계로 구성된다. PolyP 양은 polyP 유래 포스페이트 양과 형광 단위를 연관시키는 표준 곡선으로부터 추론된다. 이 방법은 형광에 의해 포스페이트의 측정을 통한 간접적인 PolyP 정량화 방법이다.
일부 실시형태에서, polyP의 정량화는 대안적인 간접적인 polyP 정량화 방법의 수단에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, polyP 가수분해로부터 방출된 포스페이트는 모든 샘플에 대해 BIOMOL Green 키트로 측정되어, 즉 대조군 균주 및 본 발명의 균주 둘 모두에 대한 포스페이트의 양을 얻는다. 또 다른 특정 실시형태에서, polyP의 정량화는 PPK 효소의 첨가로 수행되어 polyP 이화작용으로부터 포스페이트를 얻는다.
일부 실시형태에서, 발명의 균주 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주의 polyP의 생산은 모든 균주에 대해 동일한 초기 접종원을 고려할 때 배양 6시간 및/또는 16시간에 결정될 때 대조군 균주보다 높다. 특히, polyP의 생성은 6시간 및 16시간에 결정될 때 더 높다. 다른 실시형태에서, polyP의 생성은 하나 이상의 시점, 예를 들어 배양의 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간 및/또는 20시간에 결정될 때 더 높다.
본 명세서에서 이해되는 바와 같은 발명에 따른 대조군 균주는 예를 들어 다음 대조군 균주 중 적어도 하나이다: polyP를 생산하는 것으로 알려진 L. 플란타럼 WCFS1 및 L. 파라카세이 JCM 1163; 포스페이트를 제거할 수 있는 것으로 알려진 B. 브레베 JCM 1273, B. 아돌레센티스 JCM 1275 및 B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707; 및 ppk 유전자를 보유하는 것으로 알려진 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773).
특정 실시형태에서, 대조군 균주는 예를 들어 L. 플란타럼 WCFS1, L. 파라카세이 JCM 1163, B. 브레베 JCM 1273, B. 아돌레센티스 JCM 1275, B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707 또는 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)이다.
기술된 검정이 사용될 때, 일부 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간 및 16시간에서 동일한 시점에서 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산보다 더 높다.
일부 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주의 polyP의 생산보다 적어도 예를 들어 1.2-배수, 1.5-배수, 2-배수, 3-배수, 4-배수, 5-배수, 6-배수, 7-배수, 8-배수, 9-배수, 10-배수, 15-배수, 20-배수, 30-배수, 50-배수 또는 100-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산보다 적어도 10-배수 더 높다. 특히, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산보다 적어도 15-배수 또는 18-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 그의 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 B. 브레베 JCM 1273의 polyP의 생산보다 적어도 3-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 B. 아돌레센티스 JCM 1275의 polyP의 생산보다 적어도 4-배수 더 높다. 특히, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 B. 아돌레센티스 JCM 1275의 polyP의 생산보다 적어도 4.5-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)의 polyP의 생산보다 적어도 100-배수 더 높다. 특히, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 6시간에서 대조군 균주 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)의 polyP의 생산보다 적어도 120-배수, 130-배수 또는 140-배수 더 높다.
일부 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 16시간에서 대조군 균주의 polyP의 생산보다 적어도 예를 들어 1.2-배수, 1.5-배수, 2-배수, 2.5-배수, 3-배수, 4-배수, 5-배수, 6-배수, 7-배수, 8-배수, 9-배수, 10-배수, 15-배수, 20-배수, 30-배수, 50-배수, 100-배수, 200-배수, 300-배수, 400-배수, 500-배수 또는 600-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 16시간에서 대조군 균주의 polyP의 생산보다 높았고 16시간에서 대조군 균주에 의한 polyP 수준은 존재하지 않는다. 특히, 대조군 균주가 L. 플란타럼 WCFS1인 경우 16시간에서 대조군 균주에 의한 polyP의 수준은 존재하지 않는다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 그의 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 16시간에서 대조군 균주 B. 브레베 JCM 1273의 polyP의 생산보다 적어도 2-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 16시간에 대조군 균주 B. 아돌레센티스 JCM 1275의 polyP의 생산보다 적어도 2.5-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 16시간에서 대조군 균주 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)의 polyP의 생산보다 적어도 500-배수 더 높다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산보다 6시간에서 적어도 10-배수 더 높고, 16시간에서 더 높으며, 여기서 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산 및 대조군 균주에 의한 polyP의 수준은 16시간에서 존재하지 않는다. 특히, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산보다 6시간에서 적어도 15-배수 또는 18-배수 더 높고, 16시간에서 더 높으며, 여기서 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 polyP의 생산 및 대조군 균주에 의한 polyP의 수준은 16시간에 존재하지 않는다.
특정 실시형태에서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 대조군 균주 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)의 polyP의 생산보다 6시간에서 적어도 100-배수 더 높고, 16시간에서 적어도 500-배수 더 높다. 특히, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주에 의해 생산된 polyP의 수준은 대조군 균주 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)의 polyP의 생산보다 6시간에서 적어도 120-배수, 130-배수 또는 140-배수 더 높고, 16시간에서 적어도 500-배수 더 높다.
HMO와 프로바이오틱 조성물의 조합
본 명세서에 사용된 용어 프로바이오틱 조성물은 상기에서 기술된 용어에서 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 지칭한다.
언급한 바와 같이, 발명의 양태에 따르면, 본 명세서에 기술된 프로바이오틱 조성물은 적어도 하나의 모유 올리고당을 조합하여 추가로 포함할 수 있다.
프로바이오틱 조성물 및 HMO는 단일 조성물 또는 별도의 조성물로 함께 제형화될 수 있으므로, 이하에 기술된 실시형태는 프로바이오틱 조성물, HMO를 포함하는 조성물 및 둘 모두를 포함하는 조성물을 지칭하기 위해 "본 발명의 조성물" 또는 간단히 "조성물"로 지칭한다.
일부 실시형태에서, 발명의 조성물은 HMO, 즉 락토-N-테트라오스(LNT))를 분해할 수 있는 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주와 다른 추가적인 프로바이오틱을 포함한다. 특정 실시형태에서, 추가적인 프로바이오틱 균주는 비피도박테리움, 보다 구체적으로 비피도박테리움 비피덤 또는 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스이다.
특정 실시형태에서, 비피도박테리움 비피덤은 CECT 30646으로 기탁된 B. 비피덤이다. 균주는 기탁 번호 CECT 30646으로 2022년 5월 17일(17.05.2022)에 스페인 유형 배양 컬렉션(CECT, Parc Cient
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fic de la Universitat de Val
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ncia, Carrer del Catedrtic Agust
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n Escardino Benlloch, 9, 46980 Paterna, Valencia, Spain)에 기탁되었다. 기탁은 부다페스트 조약의 조건 하에서 수행되었고, 생존가능하고 그 기탁과 관련된 그 모든 특성을 유지한다. 그것은 동일한 신청자에 의해 기탁되었다. B. 비피덤 CECT 30646(본 설명에서는 Bb01로도 지칭됨)은 인간 모유에서 단리되었다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 푸코실화된 올리고당, 시알릴화된 올리고당, N-아세틸-락토사민 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HMO를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물은 푸코실화된 올리고당(특히 2'-푸코실락토스(2-FL) 및/또는 디푸코실락토스(DFL)) p 및 N-아세틸-락토사민(특히, 락토-N-테트라오스(LNT))을 포함한다.
HMO는 인간, 소, 양, 돼지 또는 염소 종, 특히 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물에 의해 분비된 우유(들)로부터 잘 알려진 과정에 의해 단리되거나 농후화될 수 있다. HMO는 또한 미생물 발효, 효소적 과정, 화학적 합성 또는 이들 기술의 조합을 사용하는 잘 알려진 공정을 통해 생산될 수 있다.
HMO는 발명의 조성물에서, 예를 들어 물에 용해, 유화 또는 현탁될 수 있다.
일 실시형태에서, HMO는 0.1 내지 50g/L 또는 0.3 내지 5g/L 또는 0.5 내지 1g/L, 또는 0.25 또는 0.5 또는 1 또는 1.5 또는 2g/L의 총량으로 조성물에 존재한다.
푸코실화된 올리고당
발명에 따른 조성물은 하나 이상의 푸코실화된 올리고당을 포함할 수 있다. 특히, 푸코실화된 올리고당은 2'-푸코실락토스(2'-FL) 및/또는 디푸코실락토스(DFL)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 푸코실화된 올리고당은 2'-푸코실락토스(2'-FL), 3-푸코실락토스(3-FL), 디푸코실락토스(DFL), 락토-N-푸코펜타오스(즉, LNFP I, II, III 및 V), 락토-N-디푸코헥사오스(LNDFH I 및 II), 락토-N-디푸코헥사오스 III(LNDFH-III), 푸코실-락토-N-헥사오스(FLNH I 및 II), 푸코실-락토-N-네오헥사오스(FLNnH), 디푸코실락토-N-헥사오스 I, 디푸코실락토-N-네오헥사오스(I 및 II) 및 푸코실-파라-락토-N-헥사오스(FpLNH I 및 II)를 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 푸코실화된 올리고당은 2-FL 또는 DFL 또는 이의 혼합물이다.
푸코실화된 올리고당은 동물 우유와 같은 천연 공급원으로부터 크로마토그래피 또는 여과 기술에 의해 단리될 수 있다. 대안적으로, 이는 효소-기반 발효 기술(재조합 또는 천연 효소) 또는 미생물 발효 기술의 사용을 통하여 특정 푸코실트랜스퍼라제 및/또는 푸코시다제를 사용하는 생명공학적 수단에 의해 생산될 수 있다. 후자의 경우, 미생물은 그 천연 효소와 기질을 발현할 수 있거나 각각의 기질과 효소를 생산하도록 조작될 수 있다. 단일 미생물 배양 및/또는 혼합된 배양이 사용될 수 있다. 대안적으로, 푸코실화된 올리고당은 락토스 및 유리 푸코스로부터 화학적 합성에 의해 생산된다. 푸코실화된 올리고당은 또한, 예를 들어 일본의 Kyowa Flakko Kogyo로부터 이용가능하다.
특히, 발명에 따른 조성물은, 가장 특히 2FL인, 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 푸코실화된 올리고당(들) 0.02 내지 10g, 예를 들어 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 2FL 0.2 내지 0.5g 또는 0.3 내지 5g, 특히 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 2FL 0.1 내지 3g을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 다음 범위 또는 양인 2FL의 양을 포함한다: 조성물이 즉시 공급되는 액체 형태인 경우, 0.05 내지 20g/L 또는 0.1 내지 5g/L 또는 0.2 내지 3g/L 또는 0.1 내지 2g/L 또는 0.25g/L 내지 1g/L 또는 0.25g/L 또는 1g/L의 조성물, 또는 조성물이 분말 형태이고 희석된 액체 형태로 재조성되도록 의도된 경우, 0.05 내지 20g/L 또는 0.1 내지 5g/L 또는 0.2 내지 3g/L 또는 0.1 내지 2g/L 또는 0.25g/L 내지 1g/L 또는 0.25g/L 또는 1g/L(의 액체 희석된 형태), 또는 조성물이 물 또는 모유에서 (각각 2, 5, 10, 20, 50 또는 100배) 희석되도록 의도되거나 농축된 형태로 직접적으로 사용되도록 의도된 농축된 조성물의 형태인 경우, 2, 5, 10, 20, 50 또는 100을 곱한 상기와 동일한 값, 또는 영양 조성물이 건조 분말의 형태로 되는 경우 0.04g 내지 1.5g/100g의 영양 조성물, 또는 0.08 내지 1.2g/100g, 또는 0.1 내지 1g/100g, 또는 0.2 내지 0.8g/100g 또는 0.2g/100g 또는 0.4g/100g 또는 0.8g/100g 또는 1g/100g 또는 1g/100g의 영양 조성물.
N-아세틸-락토사민
일부 실시형태에서 발명의 조성물은 적어도 하나의 N-아세틸-락토사민을 포함하며, 즉 조성물은 N-아세틸-락토사민 및/또는 N-아세틸-락토사민을 함유하는 올리고당을 포함한다. N-아세틸-락토사민을 함유하는 적합한 올리고당은 락토-N-테트라오스(LNT), 락토-N-네오테트라오스(LNnT), 락토-N-네오헥사오스(LNnH), 파라-락토-N-네오헥사오스(pLNnH), 파라-락토-N-헥사오스(pLNH) 및 락토-N-헥사오스(LNH)를 포함한다.
일 실시형태에서, 발명에 따른 조성물은 특히 락토-N-테트라오스(LNT) 및 락토-N-네오테트라오스(LNnT)를 포함하는 군으로부터 선택된 N-아세틸-락토사민을 포함한다.
LNT 및 LNnT는 글리코실트랜스퍼라제를 사용하여 공여체 모이어티로부터 수용체 모이어티로 당 단위의 효소적 전달에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, LNT 및 LNnT는 유리되거나 올리고당(예를 들어, 락툴로스)에 결합된 케토-헥소스(예를 들어, 프럭토스)의 N-아세틸헥소사민 또는 N-아세틸헥소사민-함유 올리고당으로의 화학적 전환에 의하여 제조될 수 있다. 이 방식으로 생산된 N-아세틸-락토사민은 그 다음 수용체 모이어티로서 락토스로 전환될 수 있다. LNT는 또한, 예를 들어 최근 EFSA에서 승인한 것으로 대장균 K-12의 유전적으로 변형된 균주로 미생물 발효에 의해 생산될 수 있다.
특히, 발명에 따른 조성물은 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 N-아세틸-락토사민 0.01 내지 3g을 포함한다. 특히 이는 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 LNnT 0.1 내지 3g, 예를 들어 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 LNnT 0.1 내지 0.25g 또는 0.15 내지 0.5g을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 다음 범위 또는 양인 LNnT의 양을 포함한다: 조성물이 즉시 공급되는 액체 형태인 경우, 0.02 내지 10g/L 또는 0.05 내지 2.5g/L 또는 0.1 내지 1.5g/L 또는 0.05 내지 1g/L 또는 0.12g/L 내지 0.5g/L 또는 0.12g/L 또는 0.5g/L 또는 1g/L의 조성물, 또는 조성물이 분말 형태이고 희석된 액체 형태로 재조성되도록 의도된 경우, 0.02 내지 10g/L 또는 0.05 내지 2.5g/L 또는 0.1 내지 1.5g/L 또는 0.05 내지 1g/L 또는 0.12g/L 내지 0.5g/L 또는 0.12g/L 또는 0.5g/L 또는 1g/L(의 액체 희석된 형태), 또는 조성물이 물 또는 모유에서 (각각 2, 5, 10, 20, 50 또는 100배) 희석되도록 의도되거나 농축된 형태로 직접적으로 사용되도록 의도된 농축된 조성물의 형태인 경우, 2, 5, 10, 20, 50 또는 100을 곱한 상기와 동일한 값, 또는 영양 조성물이 건조 분말의 형태로 되는 경우 0.02g 내지 0.75g/100g의 영양 조성물 분말, 또는 0.04 내지 0.6g/100g, 또는 0.0.5 내지 0.5g/100g, 또는 0.1 내지 0.4g/100g 또는 0.1g/100g 또는 0.2g/100g 또는 0.25g/100g 또는 0.5g/100g 또는 1g/100g 또는 3g/100g의 영양 조성물 분말.
시알릴화된 올리고당
일부 실시형태에서, 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 시알릴화된 올리고당을 포함할 수 있다.
산성 HMO의 예는 3'-시알릴락토스(3'-SL), 6'-시알릴락토스(6'-SL), 3-푸코실-3'-시알릴락토스(FSL), LST a, 푸코실-LST a(FLST a), LST b, 푸코실-LST b(FLST b), LST c, 푸코실-LST c(FLST c), 시알릴-LNH(SLNH), 시알릴-락토-N-헥사오스(SLNH), 시알릴-락토-N-네오헥사오스 I(SLNH-I), 시알릴-락토-N-네오헥사오스 II(SLNH-II) 및 디시알릴-락토-N-테트라오스(DS-LNT)를 포함한다.
일 실시형태에서 발명에 따른 조성물은 특히 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스를 포함하는 군으로부터 선택되는 시알릴화된 올리고당을 포함한다. 더욱 특히, 조성물은 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스 둘 모두를 포함하며, 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스 사이의 비율은 특히 100:1 내지 1:100, 더욱 특히 10:1 내지 1:10, 보다 더욱 특히 5:1 내지 1:2 사이의 범위에 있다.
시알릴락토스의 3'- 및 6'- 형태는 동물 젖과 같은 천연 공급원으로부터 크로마토그래피 또는 여과 기술에 의해 단리될 수 있다. 대안적으로, 이는 효소 기반 발효 기술(재조합 또는 천연 효소), 화학적 합성 또는 미생물 발효 기술에 의해 특정 시알릴트랜스퍼라제 또는 시알리다제, 뉴라미니다제를 사용하는 생명공학 수단에 의해 생산될 수 있다. 후자의 경우 미생물은 그 천연 효소와 기질을 발현할 수 있거나 각각의 기질과 효소를 생성하도록 조작될 수 있다. 단일 미생물 배양 또는 혼합된 배양이 사용될 수 있다. 대안적으로, 시알릴락토스는 락토스 및 유리 N'-아세틸뉴라민산(시알산)으로부터 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 시알릴락토스는 또한 예를 들어 일본의 Kyowa Hakko Kogyo로부터 상업적으로 이용가능하다.
특히 발명에 따른 조성물은 건조 중량 기준으로 조성물 100g당 0.05 내지 10g, 더욱 특히 0.1 내지 5g, 보다 더욱 특히 0.1 내지 2g의 시알릴화된 올리고당(들)을 포함한다.
특정 생성물 형태
본 문맥에서 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 명세서에 제공된 조합과 관련하여, 본 명세서에 언급된 2개의 "화합물"(즉, B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주, 및 HMO)는 예를 들어 단일 섭취로 또는 단일 조성물로 동시적으로 투여되거나, 예를 들어 2개의 별도 조성물로 순차적으로 투여된다. 중요한 점은 2개의 화합물이 환자의 신체에서 함께 그 효과를 발휘할 수 있다는 것이다. 특히, 2개의 화합물은 일정 기간, 예를 들어 성인의 경우 최대 18시간이 걸릴 수 있는 소화 기간 내에 투여된다.
따라서, 용어 "조합"은 본 명세서에서 예를 들어, 순차적 방식으로, 즉 합리적으로 짧은 기간, 예컨대 몇 시간에 하나씩 적용하거나 또는 동시적인 투여의 경우, 단일 조성물, 단일 화합물의 별도 조성물로부터 구성된 조합된 혼합물, 예컨대 "탱크-혼합"에서, 및 단일 화합물의 조합된 사용에서 2개의 화합물의 다양한 조합에 관한 것이다. B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주 및 HMO를 투여하는 순서는 중요하지 않다.
따라서, 프로바이오틱 조성물과 HMO의 조합은 그의 동시, 개별 또는 순차적 투여를 위해 제형화될 수 있다. 특히, 투여가 동시적이지 않은 경우, 화합물은 서로 근접한 비교적 가까운 시간에서 투여된다. 더욱이, 화합물은 동일하거나 다른 복용 형태로 또는 동일하거나 다른 투여 경로로, 특히 경구적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 2개 화합물의 조합물은 예를 들어 다음과 같이 투여된다:
- 동일한 조성물의 일부인 조합으로서, 2개 화합물은 항상 동시적으로 투여되고;
- 2개의 단위/조성물의 조합으로서, 물질 중 하나를 갖는 각각은 동시, 순차 또는 별도의 투여 가능성을 야기함;
예로서, B. 롱검 CECT 7894 또는 그로부터 유래된 박테리아 균주는 HMO로부터 독립적으로(즉, 2개 단위로) 그러나 동시에 투여된다.
B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주, 및 HMO는 본 설명에 기술된 바와 같이 임의의 형태로 제형화될 수 있다. 다양한 조합의 예가 본 명세서에 제공된다:
실시형태에서, 조합은 모유-수유 유아에게 투여되는, B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물, 모유에 존재하는 HMO를 포함한다.
다른 실시형태에서, 조합은 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물, 및 HMO를 포함하는 유아용 조제분유를 포함한다. 따라서, B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 조제분유를 먹는 유아에게 투여된다. 특히, B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 유성 방울의 형태이다.
실시형태에서, 조합은 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주, 및 본 설명에 기술된 임의의 생성물 형태인 HMO를 포함하는 단일 조성물을 포함한다.
실시형태에서, 조합은 비-유아를 위한 것이고 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주, 및 HMO를 포함하는 단일 조성물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조합은 HMO를 포함하는 조성물 및 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 조성물을, 예를 들어 발포성 정제 또는 에너지 바의 형태로, 포함한다.
언급한 바와 같이, 조합은 또한 본 명세서에 기술된 다른 2개의 화합물과의 동시, 별도 또는 순차적 투여를 위해 제형화될 수 있는 추가의 비피도박테리움 균주를 포함할 수 있다.
조성물의 용도
이 섹션의 실시형태는 발명에 따른 임의의 "조성물", 즉 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물, 및 프로바이오틱 조성물과 HMO를 포함하는 조합 및 조성물에 대해 언급된다.
본 명세서에 논의된 바와 같이, 프로바이오틱 조성물은 성장하는 동안 폴리포스페이트를 생산하는데 높은 효능을 제시한다. polyP의 작용 메커니즘은 장의 투과성을 방지함에 의해 상피 세포에 대한 보호 효과와 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 프로바이오틱-유래된 polyP는 장내 장벽 기능을 강화하고 장내 항상성을 유지한다. 장의 투과성을 예방/치료하는데 있어 polyP의 생성과 보호 효과 사이의 관계는 본 명세서에 제공된 실시예(예를 들어, 실시예 4)에 의해 입증되었다. 또한, polyP의 생산을 통해 B. 롱검 CECT 7894가 본 명세서에 기술된 장의 장벽 기능 및 연관된 병태에 긍정적인 효과를 가질 수 있다는 것은 당업자에게 타당할 것이다.
예를 들어, Saiki 등, 2016은 L. 파라카세이 JCM 1163으로부터 추출된 polyP가 마우스 소장에서 산화제 유도 장의 투과성을 억제한다는 것을 보여준다. Segawa 등, 2011은 소장 조직으로 시험관내 실험에서 polyP가 점막 투과성을 억제한다는 것을 보여준다. 먼저 투과성을 증가시키는 산화제에 조직을 노출시킨 다음 보호 효과를 확인하기 위해 polyP를 추가한다. 투과성은 만니톨의 흐름을 정량화함에 의해 측정된다. PolyP는 만니톨 흐름을 감소시켜 투과성을 감소시킨다. 유사하게, Tanaka 등 2015는 polyP가 Caco-2 장 상피 세포를 통한 만니톨의 흐름을 감소시켜 투과성을 감소시킨다는 것을 시험관내에서 입증했다. 마지막으로, Fujiya 등, 2020은 TEER로 장벽의 내항을 측정함에 의해 투과성을 연구한다(본 명세서에서 평가된 바와 같음, 실시예 4, 도 6). 투과성을 증가시키기 위해 Caco-2 장 상피 세포를 TNF-알파로 처리한 다음, polyP가 내성을 향상시킨다는 것을 입증했다(TER을 향상시킨다).
따라서, 본 명세서에서 실험 데이터는 프로바이오틱 조성물이 polyP를 생성함에 의해 장의 장벽 기능장애 및 연관된 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 장의 장벽 기능장애 및 연관된 병태를 치료하는데 유의한 긍정적 효과를 가질 가능성이 있다는 증거를 제공했다.
특정 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 장의 장벽 기능장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애는 증가된 장의 투과성과 연관되어 있다. 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 증가된 장의 투과성을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 증가된 장의 투과성 및 연관된 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
특정 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 보다 특정한 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 특히, 인간은 유아이다. 다른 실시형태에서, 인간은 비-유아이다. 다른 실시형태에서, 인간은 노인, 미숙아, 유아, 운동선수 및 허약한 사람들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 조산, 노화, 고강도 신체 활동, 식이 불균형, 감염, 약물 치료 또는 스트레스와 관련이 있다. 특정 실시형태에서, (예를 들어 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 노화와 관련이 있다.
관련된 병태
건강한 장 장벽은 박테리아 전이, 균혈증, 자가면역, 뇌 장애, 심장 및 간 질환, 비만 등을 예방하는 것으로 간주된다. 장의 장벽 기능장애는 면역 질환, 예컨대 자가면역 질환(크론병, 복강병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염), 기타 면역 질환(천식, 알레르기성 비결막염, 아토피성 피부염, 알레르기/과민증 예컨대 음식 알레르기/과민증), 지방간 질환, 간경화, 제2형 당뇨병 및 비만과 같은 대사 질환, 과민성 대장 증후군(IBS) 또는 소아지방변증과 같은 위장 질환 및 췌장염, 다낭성 난소 증후군 및 자폐증을 포함한 다수의 기타 질환 및 병태와 강력하게 연관되어 있다. 특히, 점막 손상에 기인한 장벽 기능장애는 경구용 항생제 또는 비스테로이드성 항염증성 약물과 같은 일부 약물 치료에서도 발생하는 것으로 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 연관된 병태는 면역 장애 또는 질환, 대사 또는 심혈관 장애 또는 질환, 신경학적 또는 정신과적 장애 또는 질환, 또는 위장관 장애 또는 질환이다. 특히, 면역 장애 또는 질환은 비 장의 면역 장애 또는 질환이다. 또 다른 실시형태에서, 연관된 병태는 비 장의 면역 장애 또는 질환, 대사 또는 심혈관 장애 또는 질환, 또는 신경학적 또는 정신과적 장애 또는 질환이다.
일부 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성)는 장 이외의 장기에서 주로 발생하는 병태와 연관되며, 이는 본 명세서에서 "비 장의 병태" 또는 "장관과 간접적으로 연관된 병태"로 지칭된다. 주목할 만한 점은 증가된 투과성으로 인해, 이러한 조건에서 장의 일부 영역에서 면역 세포의 최소 과잉활성화 또는 침윤이 때때로 발생할 수 있다. 그러나, 그러한 국소적 사건은 존재하는 경우 무증상이고 당업자에게는 그러한 병태를 가진 환자에서 건강 문제의 주요 원인이 아니다. 당업자에게 이들 비 장의 질환의 명확한 예는 신경학적 또는 정신 병태(예컨대 알츠하이머, 자폐 스펙트럼 장애, 정신분열증 또는 우울증), 대사 또는 심혈관 병태(예컨대 당뇨병 전증, 당뇨병, 비만, 지방간 질환, 간경화, 죽상경화증, 고혈압, 뇌졸중 또는 만성 심부전) 또는 전신 수준이나 장에서 먼 신체 위치에서 발생하는 면역 장애(예컨대 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 면역노화, 류마티스 관절염, 천식, 알레르기성 비결막염, 아토피성 피부염 또는 기타 비-영양성 알레르기/과민증)이다. 이러한 병태에서는 박테리아 독소(예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 지질다당류(LPS) 또는 트리메틸아민 N-산화물(TMAO))가 장에서 증가된 투과성로 인해 전신 혈액 순환에 들어갈 수 있고 심장, 뇌, 폐, 또는 피부와 같은 장에서 멀리 떨어진 기관뿐만 아니라 신체 여러 위치에서의 혈관벽이나 면역 세포에서 염증 및 기타 해로운 건강상 영향을 유발할 수 있다.
당업자는 증가된 장의 투과성이 본 명세서에 기술된 비 장의 질환, 예컨대: 알레르기, 관절염 및 대사 질환(Bischoff 등, 2014), 정신 장애(Kelly 등, 2015), 고혈압 및 죽상경화증(Verharr 등, 2020), 심혈관 장애(Rogler 등, 2014), 알츠하이머병(Jiang 등, 2017), 비만(Cox 등, 2015), 아토피 피부염(Pike 등, 1986), 관절염(Tajik 등, 2020) 또는 대사 질환(Massier 등, 2021)과 연관되어 있음을 인식한다.
특정 실시형태에서, 연관된 병태는 특히 자가면역 질환, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 크론병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염 및 알레르기 반응/과민증(예컨대 음식 알레르기/과민증, 천식, 아토피성 피부염 또는 알레르기성 비결막염)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 장애 또는 질환이다. 특히, 면역 장애 또는 질환은 비 장의 면역 장애 또는 질환, 예컨대 비 장의 자가면역 질환(특히 다발성 경화증, 홍반성 루푸스 또는 류마티스 관절염); 면역노화, 비-영양성 알레르기/과민증, 천식, 아토피성 피부염 또는 알레르기성 비결막염이다.
특정 실시형태에서, 연관된 병태는 특히 이에 제한되지는 않지만, 뇌졸중, 만성 심부전, 죽상동맥경화증, 고혈압, 인슐린 저항성(당뇨병전증), 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간 질환 및 간경변증을 포함하는 군으로부터 선택되는 대사성 또는 심혈관 장애 또는 질환이다.
특정 실시형태에서, 연관된 병태는 특히 이에 제한되지는 않지만, 알츠하이머병, 자폐 스펙트럼 장애, 정신분열증 및 우울증을 포함하는 군으로부터 선택되는 신경학적 또는 정신과적 장애 또는 질환이다.
일부 실시형태에서, 비 장의 질환은 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 비알코올성 지방간 질환, 간경변증, 비-영양성 알레르기/과민증, 면역노화, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 홍반성 루푸스, 근육감소증, 천식, 알레르기성 비결막염, 아토피성 피부염, 알츠하이머병, 동맥경화증, 고혈압, 만성 심부전, 뇌졸중, 자폐 스펙트럼 장애, 정신분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 연관된 병태는 특히 이에 제한되지는 않지만, 초기 염증성 장 질환(예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 낭염 또는 림프구성 대장염), 과민성 장 증후군(IBS), 장누수 증후군, 융모 위축, 괴사성 장염, 장 허혈성 손상, 비-스테로이드성 항염증성 약물에 의해 유발된 상피 손상 및 소아지방변증을 포함하는 군으로부터 선택되는 위장 장애 또는 질환이다.
고소득 국가에서 가장 널리 퍼진 위장 장애 중 하나인 IBS는 일반적으로 변화된 장의 장벽의 존재와 연관되어 있다. 장의 장벽에서의 변화는 설사 및 복통과 같은 IBS 환자에서 GI 증상과 연관되어 있는 것으로 보고되었다. 장벽 기능장애는 IBS에서의 초기 사건이고 낮은 등급 장의 염증 및 증가된 내장의 인식에 기여할 수 있는 것으로 보인다. 더욱이, 설사가 우세한 IBS(IBS-D) 및 감염-후 IBS와 같은 IBS 아형에서 장의 투과성은 종종 변화된 장의 장벽 기능에 관련된다.
부가적으로, 만성 염증성 장 질환(IBD)으로 분류되는 궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)은 유사한 증상을 가지고 설사, 복통, 직장 출혈, 및 체중 감소를 포함한 소화 장애를 야기한다. 상피 무결성은 또한 증가된 장의 투과성을 나타내는 IBD 환자에서 저해된다. 장의 장벽 손실은 잠재적으로 IBD 발병의 다중-적중 메커니즘에 기여하는 구성요소이다. 더욱이, 점막 치유가 있는 많은 IBS 환자는 여전히 손상된 장의 투과성과 연관된 지속적인 장 증상을 가지고 있다.
다른 실시형태에서, 연관된 병태는 미세염증, 혈관 손상 및/또는 위장관의 세균불균형을 특징으로 한다.
특히, 연관된 병태는 장관과 직접적으로 연관되어 있다. 보다 특정한 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애 또는 연관된 병태는 과민성 장 증후군(IBS), 염증성 장 질환(IBD), 장의 감염, 위궤양, 설사(예를 들어, 위 또는 감염성 예컨대 재발성 클로스트리듐 디피실리 설사), 복강병, 소화관과 연관된 암, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 미토콘드리아 신경위장 뇌병증(MNGIE), 장누수 증후군, 융모 위축, 괴사성 장염(NEC), 장의 허혈성 손상, 만성 장질환, 만성 변비, 및 장의 점막 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 점막 손상에 기인한 장의 장벽 기능장애는 경구용 항생제 또는 비-스테로이드성 항염증성 약물과 같은 일부 약물 치료에서도 발생하는 것으로 알려져 있다. 특히, 연관된 병태는 과민성 장 증후군(IBS)이다. 특히, 연관된 병태는 염증성 장 질환(IBD)이다. 특히, 연관된 병태는 암이다. 보다 특히, 소화관에서의 암은 식도암, 위암, 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 복통, 변비, 체중 감소, 직장 출혈, 근육감소증, 허약, 악액질, 위장 장애, 경련, 팽만감, 고창, 구토, 메스꺼움, 위통, 피로, 발열, 특정 영양소의 변화된 흡수, 식욕 감소, 전신 염증 및 열사병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 증상, 합병증 및/또는 후유증의 치료에 사용되는 것이다. 특히, 증상, 합병증 및/또는 후유증은 체중 감소, 근육감소증, 허약, 악액질, 피로, 발열, 전신 염증 및 열사병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 프로바이오틱 조성물의 투여는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 결과를 초래한다:
- 장의 투과성 감소, 위장의 장벽 기능 개선, 장의 상피 무결성 개선 또는 장의 점막 보호;
- 장의 민감도 감소 또는 장의 내약성 개선;
- 장의 운동성 개선; 및
- 장의 균형 유지.
용어 "장의 투과성 감소", "위장의 장벽 기능 개선", "장의 상피 무결성 개선" 및 "장의 점막 보호"는 장 내 바람직하지 않은 내강 내용물의 적절한 봉쇄로 이해된다.
용어 "장의 민감도 감소" 및 "장의 내약성 개선"은 통증 자극에 대한 정상적인 내장 반응으로 이해된다.
용어 "장의 운동성 개선"은 위장관의 규칙적인 운동과 그 안에 있는 내용물의 이동으로 이해된다.
용어 "장의 균형 유지"는 균형 잡힌 장의 생태계로 이해된다.
또 다른 실시형태에서, 조성물의 투여는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 결과를 초래한다:
- 장의 투과성-관련된 바이오마커의 수준을 낮추는 것;
- 장의 점막 손상에 기인한 장의 투과성-관련된 바이오마커의 증가를 완화 또는 경감시키는 것; 및
- 장의 점막 손상에 의해 야기된 혈청에서 밀착 연접 단백질 수준 증가를 감소시키는 것.
바이오마커는 순환 지표 예컨대 장의 지방산 결합 단백질(I-FABP, FABP-2로도 알려짐), 조눌린, 클라우딘 3(또는 기타 밀착 연접 단백질), 시트룰린, 지질다당(LPS) 또는 박테리아 DNA; 소변 지표 예컨대 올리고당(예를 들어, 락툴로스, 만니톨, 수크랄로스, 셀로비오스뿐만 아니라 이들의 비율, 예컨대 락툴로스/만니톨 비), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 크롬-에틸렌디아민테트라아세트산(Cr-EDTA); 또는 칼프로텍틴, 조눌린, 알파(α)-1-항트립신(AAT), 디아민 산화효소(DAO) 또는 리포칼린-2(LCN-2)를 포함하는 대변 지표를 포함할 수 있다.
유아에서의 사용
알레르기와 같은 염증성 질환을 포함한 다중 장애와 초기 생애의 미생물총을 파괴하는 요인이 연루되어 있는 증거가 늘어나고 있다. 항생제에 조기 노출된(생후 첫 2년) 어린이는 다른 병태들 중에서도 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 아동기-발현 천식, 소아지방변증, 및 비만의 위험이 증가한다. 더욱이, 제왕절개를 통해 태어난 아기는 자연분만한 아기보다 알레르기성 비결막염 및 천식에 더 취약하고, 비피도박테리아의 감소는 아토피성 피부염 및 알레르기성 천식과 직접적으로 연관되어 있다. 마지막으로, 조제분유를 먹은 유아는 모유를 먹은 유아에 비해 아토피 피부염 발병률이 더 높다. 이들 결과는 장 미생물총이 장의 장벽 구조 형성 및 투과성에서 중요한 역할을 수행하고 장 미생물총에서 변화가 여러 장애에서 증가된 장의 투과성과 연관되어 있다는 사실과 일치한다.
실제로, 비정상적인 장의 투과성은 알레르기와 연루되어 있다. 예로서, 음식 알레르기와 소화기 증상이 있는 어린이의 80%에서 장의 투과성이 비정상적으로 증가한다. 더욱이, 장의 장벽의 손상은 아토피성 피부염의 발병에 관여된다. 마찬가지로, 초기 알레르기 증상이 있는 아기는 비-알레르기 유아에 비해 단백질에 대해 장 투과성이 증가했다.
따라서, 본 명세서에 기술된 프로바이오틱 조성물은 알레르기를 치료하기 위한 치료적 옵션인 장 장벽을 복원하는 능력을 갖는 분자(polyP)를 생성한다. 제왕절개로 태어난 아기, 조제분유를 먹거나 항생제를 투여한 아기 및 미숙아도 알레르기 발현을 줄일 수 있는 예방제로서 이 프로바이오틱 치료의 혜택을 누릴 수 있다.
따라서, 실시형태에서, 대상체는 유아이다. 특히, 유아는 미숙아, 허약한 유아, 출생 체중이 정상 이하로 태어난 유아, 자궁내 성장지연 유아, 제왕절개로 태어난 유아, 항생제를 투여받은 유아, 조제분유 수유 유아, 또는 모유 수유 유아이다. 더욱 구체적으로, 유아는 조산아이다.
보다 구체적으로, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 조산, 제왕절개 출산, 조제분유 수유, 정상 이하 출생 체중 및/또는 항생제 투여와 관련이 있다. 특정 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 조산과 관련이 있다. 특정 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 제왕절개 출생과 관련이 있다. 특정 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 조제분유 수유와 관련이 있다. 특정 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 항생제 투여와 관련이 있다.
추가적으로, 발명의 프로바이오틱 조성물은 이들 병태의 치료 및 비정상적인 유아 미생물총의 복원에 유용할 뿐만 아니라, 건강한 유아 미생물총을 강화함에 의해 향후 이들 병태의 예방에도 유용하다. 따라서, 특정 실시형태에서, 프로바이오틱 조성물은 유아와 관련된 병태의 예방에 사용하기 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 유아와 관련된 연관된 병태는 크론병, 다발성 경화증, 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 궤양성 대장염, 비만, 인슐린 저항성(당뇨병 전증), 당뇨병, 과민성 장 증후군, 소아지방변증, 초기 염증성 장 질환, 알레르기 반응/과민증 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 음식 알레르기/과민증, 천식, 아토피성 피부염 또는 알레르기성 비결막염, 비알코올성 지방간 질환, 자폐 스펙트럼 장애, 정신분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유아와 관련된 연관된 병태는 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 비-영양성 알레르기/과민증, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비결막염, 인슐린 저항성(당뇨병 전증), 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간 질환, 자폐 스펙트럼 장애, 정신분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 유아와 관련된 연관된 병태는 자폐 스펙트럼 장애, 비-영양성 알레르기/과민증, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비결막염, 인슐린 저항성(당뇨병 전증), 당뇨병, 지방간 질환 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 특정한 실시형태에서, 연관된 병태는 조산과 관련되고 알레르기이다. 또 다른 실시형태에서, 연관된 병태는 항생제가 투여된 유아와 관련되고, 알레르기성 비결막염, 아토피성 피부염, 아동기-발현 천식 및 비만을 포함하지만 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 연관된 병태는 제왕절개로 태어난 유아와 관련되고, 알레르기성 비결막염, 아토피성 피부염 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 연관된 병태는 조제분유를 먹인 유아와 관련되고 아토피성 피부염이다.
운동선수에서의 사용
설사, 경련, 구토, 메스꺼움, 위통과 같은 위장 고통 증상은 고강도 훈련 및 경쟁 동안 운동선수들 중에서 일반적이다. 운동 중 열 및 산화 손상의 스트레스는 장의 상피 세포 밀착 연접 단백질을 파괴하여 내강 내독소에 대한 투과성을 증가시킨다. 장기간의 격렬한 신체 운동은 심부 체온과 장의 투과성의 증가와 관련이 있다. 따라서, 운동-유발된 고열의 정도는 장의 투과성에서의 증가와 직접적으로 연관되어 있으며, 이는 신체적 수행성에 영향을 줄 수 있는 전신 염증을 촉발할 수 있고 심한 경우에는 열사병을 유발할 수 있다.
본 명세서에 기술된 프로바이오틱 조성물의 투여는 장-장벽 기능의 무결성을 개선하고 운동선수에서의 위장 장애를 감소시키는 운동-유발된 장 누수에 대응할 수 있으며, 이는 고온 하에서 운동하는 동안 그 수행성을 향상시킬 수 있다.
따라서, 특정 실시형태에서, 대상체는 운동선수이다. 특정 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 고강도 신체 활동과 관련이 있다.
일부 실시형태에서, 발명의 프로바이오틱 조성물은 설사, 경련, 구토, 메스꺼움, 위통, 특정 영양소의 흡수 변화, 전신 염증(신체 수행성에 영향을 미칠 수 있음) 및 심한 경우에는 열사병으로 이루어진 군에서 선택되는 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태, 또는 증상, 합병증 및/또는 후유증을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
노인에서의 사용
노화 과정은 장 미생물총 조성에서 자연적 변화, 저-등급 만성 염증 및 장 투과성에서 증가와 연관되어 있으며 이 사건은 모두 연관되어 있다. 장 미생물총에서 변화는 장 상피 투과성 증가, 그에 따른 장 박테리아와 그 대사산물의 누출, 및 그에 따른 염증을 포함한다. 더욱이, 국소 염증은 또한 미생물총에서의 변화를 통해 직접적으로 조절될 수 있다.
따라서, 특정 실시형태에서, 대상체는 노인이거나 허약한 사람이다. 특정 실시형태에서, 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 노화와 관련이 있다.
특히, 노화와 관련된 장의 장벽 기능장애(예를 들어, 증가된 장의 투과성) 및 연관된 병태는 변비, 설사, 근육감소증, 허약, 재발성 클로스트리듐 디피실리 설사, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 암 및 악액질, 특히 근육감소증, 허약, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 만성 심부전, 면역노화 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
조성물을 포함하는 생성물 형태
이 섹션의 실시형태는 또한 발명에 따른 모든 조성물, 즉 B. 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하는 프로바이오틱 조성물, HMO를 포함하는 조성물 및 둘 모두를 포함하는 조성물에 대해 언급된다.
약학적 형태
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 캡슐, 분말, 현탁액, 정제, 국소 크림 또는 연고와 같은 약학적 형태이다.
용어 "약학적 형태"는 활성 성분, 이 경우에는 적어도 약학적으로(또한 영양학적으로 또는 수의학적으로도 언급됨) 허용가능한 부형제와 함께 본 명세서에 기술된 균주 또는 조성물을 포함하는 임의의 조성물을 포함하여, 가장 넓은 의미로 이해된다. 용어 "약학적 형태"는 의약에만 제한되지 않고 예를 들어 약학적 조성물, 기능식품 조성물 또는 수의학 조성물을 포함한다. 약학적 형태는 생성물 규제 승인 경로에 의존하고 국가에 의존하여 다른 이름을 채택할 수 있다.
기능식품 조성물은 예를 들어, 식품 보충제 또는 식이 보충제로 명명될 수도 있다. 기능식품 조성물은 일반적으로 식품에 사용되는 화합물로 만들어진 식이를 보충하기 위한 제제 또는 생성물로 이해되며, 이는 일반적으로 정상적인 식이에서 섭취되지 않거나 충분한 양으로 소비되지 않을 수 있는 영양소 또는 유익한 성분을 제공한다. 기능식품 조성물은 일반적으로 즉 처방전 없이 "일반의약품"으로 판매된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 균주가 유일한 활성제이거나 하나 이상의 다른 활성제와 혼합되고/되거나 약학적/기능식품적/수의학적으로 허용가능한 부형제와 혼합되는 약학적 형태로 제형화된다. 특히, 추가적인 활성제 또는 활성제들은 발명의 조성물을 형성하는 균주에 길항적이지 않은 다른 프로바이오틱 박테리아이다. 제형에 따라, 균주는 정제된 박테리아, 박테리아 배양물, 박테리아 배양물의 일부, 후-처리된 박테리아 배양물로서, 그리고 단독으로 또는 적합한 담체 또는 성분과 함께 첨가될 수 있다. 조성물에 첨가되어지는 다른 활성 성분의 예는 프럭토-올리고당(예를 들어, 이눌린), 갈락토-올리고당, 자일로-올리고당, 아라비노자일란-올리고당, 펙틴, 베타-글루칸, 모유 올리고당(예를 들어, 락토-N-테트라오스) 또는 부분적으로 가수분해된 구아검과 같은 프리바이오틱이다.
용어 "약학적/기능식품적/수의학적으로 허용가능한"은 당업계에서 인정되고 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 대상체(예를 들어, 인간 또는 동물)의 조직과의 접촉하여 사용하기에 적합한 부형제, 화합물, 물질, 조성물, 담체, 비히클 및/또는 복용 형태를 포함한다. 각 담체, 부형제 등은 제형의 다른 성분과 조화된다는 의미에서 또한 "허용가능"하여야 한다. 적합한 담체, 부형제 등은 표준 약품/기능식품/수의학 문서에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 발명의 일부 실시형태는 상기에서 기술된 바와 같이 적어도 약학적/기능식품적/수의학적으로 허용가능한 부형제와 함께 본 명세서에 기술된 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 기능식품 조성물, 및 수의학 조성물에 관한 것이다.
약학적/기능식품적/수의학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는: 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분, 감자 전분과 같은 전분; 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 그 유도체; 분말화된 트라가칸스; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스; 땅콩유, 면실유, 해바라기유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘, 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 또는 포스페이트 완충 용액을 포함한다.
부형제는 충전제/희석제/팽창제, 결합제, 항접착제, 붕해제, 코팅제, 항케이킹제, 항산화제, 윤활제, 감미제, 향료, 색소 또는 긴장제로 이루어진 군으로부터 제한 없이 선택된다.
충전제는 이눌린, 올리고프럭토스, 펙틴, 변형된 펙틴, 미세결정성 셀룰로오스, 락토스, 전분, 말토덱스트린, 사카로스, 글루코스, 프럭토스, 만니톨, 자일리톨, 비-결정화 소르비톨, 탄산칼슘, 인산이칼슘, 기타 불활성 무기 및 유기 약학적으로 허용가능한 충전제 및 이들 물질의 혼합물로 이루어진 군으로부터 제한 없이 선택된다. 경구 현탁액의 복용 형태에서, 충전제 또는 희석제는 식물성 오일, 올레산, 올레일 알코올, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 기타 약학적으로 허용가능한 불활성 액체 또는 이들 물질의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
결합제는 고체 복용 형태에서 예를 들어, 정제에서의 성분을 함께 유지하고, 정제와 과립이 필요한 기계적 강도로 형성될 수 있도록 보장하고, 저활성 용량 정제에 부피를 제공하기 위해 사용된다. 정제와 같은 고체 복용 형태에서 결합제는: 락토스, 수크로스, 콘(옥수수) 전분, 변형된 전분, 미세결정 셀룰로오스, 변형된 셀룰로오스(예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC) 및 하이드록시에틸셀룰로오스), 기타 수용성 셀룰로오스 에테르, 포비돈으로도 알려진 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리-에틸렌 글리콜, 소르비톨, 말티톨, 자일리톨 및 이염기성 인산칼슘; 다른 적합한 약학적으로 허용가능한 결합제 또는 이들 물질의 혼합물이다.
항접착제는 분말(과립)과 펀치 표면 사이의 접착력을 감소시키고 따라서 정제 펀치에 점착하는 것을 방지하는데 사용된다. 또한 정제가 점착하는 것을 방지하는 데에도 사용된다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 스테아린산 마그네슘이다.
정제 및 캡슐과 같은 고형 복용 형태에서 붕해제 및 초붕해제로서 다음 물질이 제한 없이 사용된다: 가교 폴리비닐피롤리돈, 전분 글리콜산 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘 및 포름알데히드-카제인, 기타 약학적으로 적합한 허용가능한 붕해제 및 초붕해제, 또는 이의 혼합물.
캡슐 충진용 정제 및 과립과 같은 고형 복용 형태의 경우에 코팅은 공기 중 습기에 의해 성분이 변질되는 것을 방지하고, 크고 불쾌한 맛이 나는 정제를 삼키기 쉽게 만들고/만들거나 장용 코팅의 경우 위액의 강한 산성 배지(pH 약 1)를 통해 온전한 통과를 보장하고 이는 십이지장 또는 회장(소장)에서 방출을 허용한다. 대부분의 코팅 정제에는 셀룰로오스 에테르 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC) 필름 코팅이 사용된다. 때때로, 다른 코팅 재료, 예를 들어 폴리비닐아세테이트 프탈레이트(PVAP)와 같은 합성 중합체 및 공-중합체; 메틸 아크릴레이트-메타크릴산의 공-중합체; 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산의 공-중합체; 셸락, 옥수수 단백질 제인 또는 기타 다당류; 밀랍, 스테아르산과 같은 왁스 또는 왁스-유사 물질; 세틸 또는 스테아릴 알코올 같은 고급 지방 알코올; 고체 파라핀; 글리세롤 모노스테아레이트; 글리세롤 디스테아레이트 또는 이의 조합이 사용된다. 캡슐은 젤라틴 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스로 코팅된다.
장용 코팅은 약물 방출의 속도를 제어하고 소화관에서 약물이 방출되는 장소를 결정한다. 장용 코팅에 사용되는 물질은 지방산, 왁스, 셸락, 플라스틱, 및 식물 섬유 및 이의 혼합물을, 또한 상기-언급된 다른 코팅과 조합하여 포함한다.
항케이킹제는 덩어리(케이킹)의 형성을 방지하고 포장, 운송 및 섭취를 용이하게 하기 위해 분말화되거나 과립화된 물질에 배치된 첨가제이다. 정제, 캡슐 또는 분말 같은 고형 복용 형태에서의 항케이킹제로는 다음의 것이 사용된다: 스테아르산 마그네슘, 콜로이드성 이산화규소, 활석, 기타 약학적으로 허용가능한 항케이킹제 또는 이의 혼합물.
윤활제는 성분이 함께 뭉치는 것을 방지하고 정제 펀치나 캡슐 충전기에 점착하는 것을 방지하기 위해 고형 복용 형태, 특히 정제와 캡슐 및 또한 경질 캡슐에 사용된다. 윤활제로서 활석 또는 실리카, 지방, 예를 들어, 식물성 스테아린, 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 및 이의 혼합물이 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐에 가장 자주 사용되는 윤활제이다.
감미료는 성분을 더욱 맛이 좋게 만들기 위해 첨가되는데, 특히 예를 들어 기침 시럽 같은 씹을 수 있는 정제인 고형 복용 형태뿐만 아니라 액체 복용 형태에 첨가된다. 감미료는 인공, 천연 또는 합성 또는 반-합성 감미료로부터 선택될 수 있으며; 감미료의 비제한적인 예는 아스파탐, 아세설팜 칼륨, 시클라메이트, 수크랄로스, 사카린, 당 또는 이의 임의의 혼합물이다.
향료는 임의의 복용 형태에서 불쾌한 맛이 나는 활성 성분을 가리기 위해 사용될 수 있다. 향료는 천연(예를 들어, 과일 추출물) 또는 인공일 수 있다. 예를 들어, (1) 쓴 생성물을 개선하기 위해, 민트, 체리 또는 아니스가 사용될 수 있고; (2) 짠 생성물을 개선하기 위해, 복숭아, 살구, 또는 감초가 사용될 수 있고; (3) 신맛 생성물을 개선하기 위해, 라즈베리; 및 (4) 지나치게 달콤한 생성물을 개선하기 위해, 바닐라가 사용될 수 있다.
부형제의 부류로부터 보조 물질을 제외하고, 본 발명으로부터의 제형은 비타민, 예컨대 약학적으로 허용가능한 화학 형태의 비타민 D(칼시페롤), 염 또는 유도체; 약학적으로 및 영양적으로 허용가능한 화학적 형태의 형태인 미네랄; 및 L-아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 약학적으로 활성이거나 영양적인 물질을 함유할 수 있다.
각 경우에 조성물의 제시는 당업자에게 공지된 수단에 의해 사용되는 투여의 유형에 맞춰질 것이다. 따라서, 조성물은 용액의 형태 또는 임상적으로 허용가능한 투여의 임의의 다른 형태 및 치료적으로 유효한 양으로 제시될 수 있다. 조성물은 따라서 정제, 캡슐, 분말(예컨대 동결건조(냉동-건조) 또는 공기-건조로부터 유래된 것), 과립, 용액, 좌제, 겔 또는 미소구체와 같은 고체, 반고체 또는 액체 제제로 제형화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 액체 형태 또는 고체 형태에서의 투여를 위해 제형화된다.
특정 실시형태에서, 조성물은 정제, 로젠지, 사탕, 씹을 수 있는 정제, 츄잉 껌, 캡슐, 향낭, 분말, 과립, 코팅된 입자 또는 코팅된 정제, 정제, 알약, 트로키제, 위-내성 정제 및 캡슐, 분산성 스트립 및 필름과 같은 고체 형태이다. 보다 특히, 조성물은 캡슐, 분말, 정제, 환제, 로젠지, 향낭 또는 과립의 형태이다. 실시형태에서, 조성물은 수성상과 접촉하여 용액을 형성하는 분말의 형태이다. 수성상은 이눌린과 같은 섬유질을 포함할 수 있다. 2가지 성분(분말 및 수성상)은 별도의 구획/용기에 있을 수 있고 2가지 성분은 현장 재구성을 위해 혼합된다.
실시형태에서, 조성물은 젤라틴 캡슐의 형태이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 식물성 캡슐의 형태이고 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 조성물은 경구 용액, 점적제, 현탁액(예를 들어, 오일), 유제 및 시럽과 같은 액체 형태이다. 특히, 조성물은 점적제의 형태이다. 보다 특히, 조성물은 유성 점적제의 형태이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 단독으로 투여되거나 액체와 혼합되어 투여되는 유성 현탁액의 형태이다. 유성 현탁액은 올리브유, 옥수수유, 대두유, 아마씨유, 해바라기유 또는 쌀유와 같은 적어도 하나의 식용 오일을 포함한다. 오일은 적어도 70% 중량/중량의 양으로 존재한다. 특정 실시형태에서, 유성 현탁액은 또한 유화제, 안정화제 또는 항케이킹제인 적어도 하나의 부형제를 0.1-15% w/w의 양으로 포함한다. 적합한 작용제는 이산화규소, 실리카겔, 콜로이드성 실리카, 침강 실리카, 활석, 규산마그네슘, 레시틴, 펙틴, 전분, 변성된 전분, 곤약 검, 잔탄 검, 젤란 검, 카라기난, 알긴산나트륨, 지방산의 모노- 또는 디글리세리드 예컨대 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 모노올레에이트 및 모노- 또는 디글리세리드의 시트르산 에스테르이다.
특히, 조성물은 유성 현탁액의 형태, 특히 유성 점적제의 형태에서 유아 식품 보충제의 형태이다. 특정 실시형태에서 유성 현탁액은 해바라기유 및 콜로이드성 실리카를, 특히 1중량%로, 그리고 박테리아 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서 유성 현탁액은 해바라기유와 레시틴, 지방산의 모노- 또는 디글리세리드, 카라기난 및 알긴산 나트륨으로부터 선택된 작용제, 및 박테리아 세포를 포함한다.
특히, 예를 들어, 캡슐, 향낭 또는 스틱, 정제 또는 알약은 약 150mg 내지 약 8000mg의 중량을 갖는다. 보다 특히, 캡슐은 약 200mg 내지 약 600mg의 중량을 갖는다. 보다 특히, 향낭 또는 스틱은 약 1.5g 내지 약 6g의 중량을 갖는다. 보다 특히, 정제 또는 알약은 약 400mg 내지 약 1200mg의 중량을 갖는다.
특히, 예를 들어, 스프레이, 유성 점적제(예를 들어, 해바라기 유성 점적제)은 약 3ml 내지 약 50ml의 부피를 갖는다. 보다 특히, 스프레이는 약 5ml 내지 약 50ml의 부피를 갖는다. 보다 특히, 오일 점적제는 약 3ml 내지 약 30ml의 부피를 갖는다.
본 발명의 제형의 제조와 관련하여, 이는 당업자의 범주 내에 있고 최종 복용 제형에 따라 달라질 것이다. 예로서, 제한 없이 최종 복용 형태가 정제, 캡슐, 분말, 과립, 경구 현탁액 등과 같은 경구용 고형 형태인 경우, 제형의 고형 복용 형태의 제조를 위한 과정은: (1) 발명의 후-처리된 프로바이오틱 박테리아를 유효량으로 포함하는 활성 성분(들)과; (2) 하나 이상의 부형제와의 균질화를 포함하여 균질한 혼합물을 형성하며 이는, 예를 들어 요구사항에 따라, 스테아르산 마그네슘 또는 기타 윤활제로 윤활 처리하여 최종 복용 형태의 분말을 생성한다. 이러한 균질한 분말은 일반 젤라틴 캡슐에 충전되거나, 대안적으로 위-내성 캡슐에 충전된다. 정제의 경우에는 직접 타정 또는 과립화에 의해 제조된다. 첫 번째 경우에는 활성 성분과 적절한 부형제 예컨대 무수 락토스, 비-결정성 소르비톨 등의 균질한 혼합물이 제조된다. 두 번째 경우에는 과립화된 형태에서의 혼합물의 정제가 가공된다. 과립은 적합한 충전제, 결합제, 붕해제 및 소량의 정제수와 제형의 활성 성분의 과립화 과정에 의해 제조된다. 이렇게 제조된 과립을 체질되고 <1% w/w의 수분 함량이 될 때까지 건조된다.
액체 복용 형태(예를 들어, 경구 현탁액)의 제조를 위한 과정과 관련하여, 이는 해바라기유, 대두유 또는 올리브유 같은 다양한 식물성 오일; 올레산; 올레일 알코올; PEG 200, PEG 400 또는 PEG 600 같은 액체 폴리에틸렌 글리콜; 또는 기타 불활성 약학적으로 허용가능한 액체와 같은 불활성 액체 희석제(충전제)에 유효량으로 발명의 후-처리된 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 제형의 활성 성분(들)의 균질화를 포함한다. 과정은 (1) 밀랍, 콜로이드성 이산화규소 등 같은 현탁 안정화제의 첨가 및 균질화에 의한 제형의 안정화; (2) 감미료의 첨가 및 균질화에 의한 제형의 감미화; (3) 향료의 첨가 및 균질화에 의한 제형의 향미화를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 과정으로 균질한 혼합물의 처리를 추가로 포함한다.
식품 생성물/영양 조성물
일부 실시형태에서, 조성물은 유아 조제분유 또는 식품, 우유-기반 발효된 생성물(예를 들어, 요구르트, 치즈, 커드), 야채-기반 발효된 생성물, 빵, 바(예를 들어, 에너지 바), 스프레드, 비스킷, 시럽, 음료, 드레싱, 소스, 충전재, 수프, 아이스크림, 오일, 드레싱 또는 과자류와 같은 식품 생성물 또는 식용 조성물의 형태이다.
용어 "식품 생성물 또는 식용 조성물"은 동물, 특히 인간에 섭취될 수 있는 임의의 형태의 제시로된 임의의 유형의 생성물을 포함하여 가장 넓은 의미로 본 명세서에서 사용되지만, 의약품, 기능식품 및 수의학 생성물은 제외된다.
특히, 조성물은 유아 조제분유나 식품에 포함된다. 특히, 조성물은 음료에 포함된다.
기타 식품 생성물의 예는 육류 생성물, 초콜릿 스프레드, 충전재 및 프로스팅, 초콜릿, 과자류, 구운 식품, 소스 및 수프, 과일 주스 및 커피용 크림 대용품이다. 식품 생성물은 특히 오트밀 죽, 유산 발효된 식품, 저항성 전분, 식이섬유, 탄수화물, 단백질 및 글리코실화된 단백질과 같은 담체 물질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 발명의 균주는 캡슐화되거나 코팅된다. 특히, 우유는 동물성 또는 식물성일 수 있다.
실시형태에서, 식품 생성물 또는 식용 조성물은 유아 영양의 분야에서 일반적으로 사용되지만 노인 및 허약한 그룹에서도 사용되는 영양 조성물이다.
특정 실시형태에서, 발명의 조성물은 유아 조제분유이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 예를 들어 스타터 유아 조제분유, 이유식, 유아 시리얼 조성물, 후속 조제분유 또는 성장기 우유 또는 강화제이다. 조성물은 또한 이유 기간 전 및/또는 동안 사용하기 위한 것일 수 있다.
일 실시형태에서 영양 조성물은 완전한 영양 조성물 또는 노화되는, 노인 또는 허약한 사람을 위한 보충제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 발명의 조성물은 예를 들어 노인, 운동선수 또는 면역저하된 개체를 위한 재수화 용액 또는 식이 유지 또는 보충제이다.
발명에 따른 조성물은 표적 모집단의 영양 요구의 100% 또는 대부분을 제공하는 완전한 조성물일 수 있다(예를 들어, 칼로리 요구의 관점에서; 또는 비타민 또는 미네랄 요구의 관점에서, 단백질, 지질 또는 탄수화물 요구의 관점에서). 대안적으로, 발명의 조성물은 정규 식이요법에 부가하여 소비되는 보충제일 수 있다). 그러나 그 경우에, 조성물의 복용량 및 전체 소비는 (예를 들어, 칼로리 부하 및 대상체 칼로리 요구에 비례하여) 심리상의 처리에 대한 주장된 이점을 제공하도록 조정된다.
발명의 조성물의 사용은 조성물이, 바람직하게는 단위 용량의 형태(예를 들어, 정제, 캡슐, 분말의 봉지 등)로 제공된, 보충제인 경우를 포괄할 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 인간 모유 수유에 대한 보충제이다. 단위 복용 형태는 허용가능한 담체, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 물에서의 에탄올 혼합물, 물 및 에멀젼 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 뿐만 아니라 다양한 습윤제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 담체 및 부형제의 예는 본 설명에서 상기에 기술되어 있다.
조성물은 예를 들어 물로 희석하거나 우유(예를 들어, 모유)와 혼합하거나 분말로서 섭취하도록 의도된 분말 조성물의 형태로 될 수 있다. 일 실시형태에서, 발명의 조성물은 바로 마실 수 있거나 물에 희석되거나 우유(예를 들어, 모유)와 혼합되는 액체 형태이다.
조성물은 즉시 공급 액체의 형태로 될 수 있거나, 생성된 일정량의 물을 첨가함에 의해 즉시 공급 액체로 재구성될 수 있는 액체 농축물 또는 분말화된 조제분유일 수 있다.
투여
일부 실시형태에서, 조성물은 단일 용량으로 투여되거나 특정 시간 간격으로 반복 용량으로 투여되며, 예를 들어 특정 일수 동안 매일 또는 특정 복용량 일정에 따라 투여될 수 있다. 특히, 조성물은 10일 내지 90일 동안 투여된다. 보다 특히, 이는 10일 내지 60일 동안 또는 15일 내지 45일 동안, 보다 특히 30일 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 3일마다 1회 내지 1일 3회, 특히 1일 1회 투여된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 경구, 직장, 비경구, 국소, 안구, 귀, 비강, 질내 또는 구강으로 투여되어 국소 및/또는 전신 효과를 제공할 수 있다. 특히, 조성물은 경구로 투여된다. 실시형태에서, 발명의 조성물의 단위 용량은 상기에서 기술된 임의의 형태, 예컨대 정제, 캡슐 또는 펠렛에서, 또는 분말이나 과립으로, 또는 젤, 페이스트, 용액, 현탁액, 유제, 시럽, 볼루스, 지약 또는 슬러리로, 또는 수성 또는 비수성 액체에서 경구로 투여된다.
일 실시형태에서, 조성물은 장내로 투여된다. 장내 투여의 방법에는 비위관 또는 공장관, 경구, 설하 및 직장을 통한 공급이 포함된다. 따라서, 조성물의 단위 복용 형태는 또한 노인 또는 허약한 사람에게 직장 좌약, 에어로졸 튜브, 비위관 또는 위장관 또는 위 안으로 직접 주입에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 조성물은 비강 흡입, 경구 스프레이에 의하거나 또는 비위 경로를 통해 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 조성물은 경구 점적제의 형태로 투여될 수 있다.
실시예
실시예 1: 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 폴리포스페이트 생합성 능력
1.1 재료 및 방법
1.1.1 균주 및 배양 조건
polyP를 생합성하는 능력이 19개 균주에서 평가되었다(표 1). 균주에는 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894), 기타 비피도박테리아 균주 및 락토바실러스 그룹 및 사카로마이세스 속에 속하는 기타 균주가 포함되었다. 균주에는 AB-Biotics S.L. 컬렉션으로부터 유아 및 성인 인간 서식 박테리아(HRB) 균주와 비-HRB 균주 또는 상업적으로 이용 가능한 제품이 포함되었다.
분석에는 다음의 대조군 균주가 포함되었다. polyP를 생성하는 것으로 알려진 L. 플란타럼 WCFS1(Alcntara 등 2014) 및 L. 파라카세이 JCM 1163(Saiki 등 2016); 포스페이트를 제거할 수 있는 것으로 알려진 B. 브레베 JCM 1273, B. 아돌레센티스 JCM 1275 및 B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707(Anand 등 2019); 및 ppk 유전자를 보유하는 것으로 알려진 B. 스카르도비 DSMZ 13734(BAA-773)(Qian 등 2011).
균주는 적절한 한천 플레이트 상에 접종하여 표시된 경우 상업적 제품으로부터 단리되었다. 배양 후, 단일 콜로니를 글리세롤 스톡에 저장하기 위해 성장시켰고, 종 동일성(ID)은 PCR 증폭 및 16S rRNA 유전자의 생거 서열분석에 의해 확인되었다. 대조군 균주는 배양 컬렉션에서 구입하고 종 동일성을 확인했다.
비피도박테리아 균주는 0.05% 시스테인(MRScys)을 갖는 Man, Rogosa 및 Sharpe 한천(MRS)에서 37℃에서 혐기성 조건 하에서 사전-배양되었다. 락토바실러스 균주는 30℃에서 호기성 조건 하에서 MRS에서 사전-배양되었다. 사카로마이세스 보울라르디 CNCM I-754는 YPD 배지에서 37℃에서 호기성 조건 하에서 진탕하면서 사전-배양되었다.
PolyP 생산 검정을 위해, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 트립톤, 0.4% K2HPO4, 0.5% KH2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.005% MnSO4, 1ml의 Tween 80, 0.05% 시스테인 및 0.5% 글루코스를 함유하는(리터당, w/v) 말산 효소 유도(MEI) 배지가 사용되었다(Alcntara 등 2014). MEI에서 성장할 수 없는 균주는 MRScys에서 성장되었다. 배양물은 OD(595nm) 0.1에서 접종되고 각 균주는 상기에 표시된 조건 하에서 성장되었다. 성장은 16시간 동안 OD를 측정함에 의해 모니터링되었다.
표 1. 균주의 특성화. HRB, 인간 서식 비피도박테리아; nHRB, 비-HRB; CECT, 스페인 유형 배양 컬렉션; DSMZ, 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션; ATCC, 미국 유형 배양 컬렉션. 대조군으로 분류된 균주에는 polyP 대사의 일부 공개된 증거가 있다.
1.1.2 폴리포스페이트(polyP) 정량화
PolyP는 이전에 기술된 바와 같이 차아염소산나트륨으로 가수분해에 대한 그 내성에 의해 세포로부터 단리되었다(Alcntara 등 2014). 세포를 원심분리에 의해 수확하고 실온에서 45분 동안 부드럽게 교반하면서 5% 차아염소산나트륨 1ml에 용리시켰다. 불용성 물질을 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 원심분리에 의해 펠렛화하고 1.5M NaCl 1ml에 더하여 1mM EDTA로 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 2회 세정했다. 1ml의 물로 2회 연속 세정하고 그 사이에 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 원심분리 단계로 펠렛으로부터 PolyP를 추출했다. 풀링된 물 추출물에서의 PolyP는 0.1M NaCl과 1 부피의 에탄올을 첨가함에 의해 침전시키고 이어서 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 16,000g에서 10분 동안 원심분리한 후, polyP 펠렛을 50μL의 물에 재현탁시켰다.
균주로부터 추출된 polyP를 정량화하기 위해 포스페이트 양과 형광 강도를 연관시키는 표준 곡선을 구축했다. 첫 번째 단계로서, 폴리포스페이트-생산자 대조군 균주 락티플란디바실러스 플란타럼 균주 WCFS1(Alcntara 등 2014)로부터 단리된 polyP 샘플의 일련의 희석액을 준비했다. 둘째, 희석액을 1 부피의 2M HCl로 가수분해하고 95℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 포스페이트를 방출한 다음 절반 부피의 2M NaOH를 첨가함에 의해 중화했다. 셋째, 각 희석액으로부터 방출된 포스페이트를 제조업체에 의해 권장된 바와 같이 BIOMOL Green 키트(Enzo Life Sciences)로 정량화했다. 동시에, 각 희석액으로부터 방출된 포스페이트를 50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 완충액에서 최종 농도 10μM에서의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 염색하고 형광계에서 415nm의 여기 파장 및 550nm에서의 방출로 형광을 측정했다. 마지막으로, 수득된 포스페이트 값과 상응하는 형광 값으로 표준 곡선을 구축했다.
표준 곡선이 얻어지면, 샘플로부터 polyP 양은 BIOMOL Green 키트를 사용할 필요 없이 형광 값에 따라 정량화될 수 있다. 따라서, 균주 샘플로부터 polyP의 정량화는 표준 곡선을 사용하여 DAPI 형광에 의해 간접적으로 측정되었다. 먼저, 추출된 polyP는 50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 완충액에서 최종 농도 10μM의 DAPI를 사용하여 형광계에서 415nm의 여기 파장 및 550nm에서 방출로 형광에 의해 측정되었다. 그런 다음, polyP의 양은 표준 곡선의 수단에 의해 포스페이트의 nmol로 계산되었다. 적어도 3번의 생물학적 복제가 수행되었다.
1.1.3 인실리코 분석에 의한 ppk 유전자의 검출
비피도박테리아 및 락토바실리 종에서의 ppk 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 각각 수탁 번호 AE014295.3(버전 3, 업데이트 날짜 31.01.2014, B. 롱검 NCC2705의 게놈) 및 AL935263.2(버전 2, 업데이트 날짜 28.02.2015, L. 플란타럼 WCFS1의 게놈)로 NCBI로부터 회수되었고 연구의 게놈에 대한 BLAST 분석을 실시했다. 비피도박테리움 종에서 검출된 PPK 단백질의 아미노산 서열을 정렬하고 ClustalW를 사용하여 트리를 구축했다.
1.2. 결과
polyP 및 이의 연관된 성장을 생성하는 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 능력을 6개의 다른 종에 속하는 12개의 비피도박테리아 균주, 5종에 속하는 6개의 락토바실러스 균주 및 1개의 효모 균주와 비교했다(표 1).
MEI 또는 MRScys에서의 동일한 OD(0.1)에서 균주를 접종하고 16시간 동안 성장시켰다. OD를 모니터링하고, 대부분의 균주에서 유의한 성장이 관찰되는 6시간 및 16시간에 polyP 형성을 연구했다(도 1). PolyP 합성 및 OD 값은 균주 간에 크게 달랐다(도 1, 도 2 및 표 2).
일반적으로 비피도박테리아는 락토바실러스 균주보다 polyP를 형성하는 능력이 더 큰 것으로 나타났다. L. 플란타럼 299v, L. 브레비스 KABP-052(CECT 7840), L. 람노서스 GG, L. 류테리 DSM 17938 및 S. 보울라르디 CNCM I-754 세포에 의해 생성된 PolyP 수준은 매우 낮았다(16시간에서 <2nmol).
비피도박테리아 중에서는 모든 균주가 어느 정도 양의 polyP를 생산할 수 있었다. 그러나, B. 비피덤 ABP671, B. 브레베 ABP734, B. 브레베 M16-V 및 B. 스카르도비 BAA-773은 가장 낮은 양을 생산했다(16시간에 <25nmol, 도 2 및 표 2). 이 결과는 이전에 락토바실리에서 관찰된 바와 같이 비피도박테리아에서 polyP 합성이 다양한 균주 중에서 매우 다양하였다는 것을 나타냈다.
6시간과 16시간에서 polyP 생산을 비교하면, B. 스카르도비와 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)가 아닌 모든 B. 롱검 균주는 16시간보다 6시간에 더 큰 polyP 값을 나타냈다(도 2 및 표 2). 나머지 균주는 16시간에 더 많은 polyP를 생성한 반면 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 두 시점 모두에서 비슷한 양을 생산했다. 따라서, 비피도박테리아에서 polyP 생산은 성장 곡선을 따라 다양하고 이 성장-관련된 변화도 균주에 따라 달라지므로, 성장 곡선을 따라 하나 초과의 시점을 분석하는 것이 중요하다는 것을 강조하는 결론을 내릴 수 있다.
현저히, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 6시간에 polyP를 생산하는 더 큰 능력을 보여주었다(표 2). 놀랍게도, 16시간에서 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)도 polyP를 형성하는 최고의 능력을 보여주었다. 흥미롭게도, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042는 이 행동을 보이는 유일한 B. 롱검 균주였으며, 즉 배양의 연령에 관계없이 높은 polyP의 생산이 관찰되었다. 반대로, 다른 polyP-생산 균주는 배양이 어릴 때만(예를 들어, B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707) 또는 오래되었을 때만(예를 들어, B. 애니멀리스 BB12) 능력을 나타냈다. 따라서, 일정한 방식으로 polyP를 생산하는 능력은 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894) 균주의 추가적인 이점을 나타낸다.
B. 아돌레센티스 JCM 1275와 달리 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 polyP를 생산하면서 증식할 수 있었다는 점은 주목할 만하다. 부가하여, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 훨씬 더 많이 성장할 수 있는 다른 균주보다 더 많은 polyP를 생산했다. 이는 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)가 포스트바이오틱 분자 polyP의 효율적인 생산에 의해 유익한 효과를 확장하는 동시에 증식하고 장에 집락화할 가능성이 가장 높다는 증거이다.
더욱이, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 ppk를 발현하는 것으로 알려진 B. 스카르도비 BAA-773보다 6시간에 140배 더 많은 polyP(1.6 대 230.9nmol, 표 2)를 생산할 수 있었다(Qian 등, 2011). B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 polyP를 생성하는 것으로 알려진 L. 플란타럼 WCFS1보다 18배 더 많은 polyP(12.7 대 230.9nmol, 표 2)를 생성할 수 있었다(Alcntara 등, 2018).
표 2. 연구에서 6시간 및 16시간에 분석된 균주의 PolyP 정량화(nmol) 및 성장(OD550). ppk, 폴리포스페이트 키나제 유전자; NA, 해당 사항 없음.
부가하여, BLAST에 의해 연구 중인 균주의 이용가능한 게놈 중에서 ppk 유전자의 존재를 평가했다(표 2 및 3). 표현형 결과와 일치하게, ppk 서열은 테스트된 모든 비피도박테리아와 일부 락토바실리 게놈에서 발견되었다. 그러나, 균주 간의 polyP 생산에서 차이를 고려할 때, 데이터는 균주 간에 조절 메커니즘이 다르다는 것을 뒷받침한다. 실제로, 박테리아에서의 polyP 생합성은 전사-후 및/또는 번역-후 수준에서 조절되는 것으로 보인다.
표 3. BLAST에 의한 게놈에서 이용가능한 ppk 유전자의 식별. ND: 검출되지 않음.
비피도박테리아 균주에서 ppk 서열 간에 관찰된 차이를 고려하여, 이들의 아미노산 서열을 정렬하고 트리를 구축했다. 결과는 비피도박테리아 PPK가 2개의 균주군으로 그룹화될 수 있음을 보여주었으며(도 3), 하나는 B. 애니멀리스와 B. 아돌레센티스 균주를 포함하고 다른 하나는 B. 스카르도비, B. 롱검 및 B. 브레베 균주를 포함한다.
실시예 2: 최종 생성물에서 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 안정성
프로바이오틱 생성물의 안정성은 산업적 제조 및 보관 과정과 프로바이오틱 균주의 본질적인 특징을 포함한 여러 요인에 따라 달라진다.
산업적 과정은 생산 및 보관 동안 균주의 생존력의 손실을 감소시키기 위해 최적화되었다. 부가하여, 제조업체는 생성물 유통기한 동안 손실에 대응하기 위해 더 높은 용량의 프로바이오틱 박테리아로 시작하는 경향이 있다. 그러나, 비피도박테리아의 자연적인 감소된 공기내성으로 인해 다른 프로바이오틱 종에 비해 생성물 유통기한 연장 동안 안정성의 유지가 더 어려워진다.
본 연구에서는, 최종 생성물에서 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 안정성을 연구했다.
2.1 재료 및 방법
B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 최종 생성물은 활성 성분(최소 109 집락 형성 단위, cfu), 해바라기유(최대 10mL) 및 DL-알파 토코페롤(4mg)을 함유하는 매트릭스로 제형화되었다. 생성물을 호박색 유리병에 포장하고 Zone II 조건(25℃, 60% 상대습도(RH))에서 보관했다.
활성 성분(프로바이오틱 균주)의 양은 이용가능한 지침에 따라 권장된 cfu/용량을 충족하도록 선택되었다.
균주의 안정성은 생산 후 0, 1, 3 및 6개월에 ISO 29981에 따라 플레이트 카운팅에 의해 cfu를 측정하여 연구했다. 결과는 LOG(cfu)로 표현되었다. 추세선을 구하고 12개월에서 예측된 cfu를 추정했다. 0개월에서 12개월 사이의 cfu를 비교하는 배수 및 로그 감소를 계산했다.
2.2 결과
도 4는 시간이 지남에 따라(0-6개월) 최종 생성물에서 발견된 살아있는 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894) 및 예측된 추세선을 나타낸다. 12개월에서, LOG(cfu)는 9.01로 추정되었다. 이 결과는 12개월에 걸쳐 3-배수 감소(즉, ~0.5 LOG 손실)를 나타냈으며 이는 생성물의 우수한 안정성을 나타낸다. 따라서, 제조 시 3X 과잉용량은 12개월에서 109 cfu의 살아있는 박테리아를 확보하기에 충분하다.
실시예 3: 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 추가적인 프로바이오틱 특성
3.1 재료 및 방법
위장관 병태에 저항하고 장 상피에 부착하고 모유 올리고당(HMO)을 활용하는 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894) 능력의 특성화가 수행되었다. L. 람노서스 GG(ATCC 53103) 및 B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707을 표시된 바와 같이 대조군으로 사용했다. 락토바실리 균주는 혐기생활에서 37℃의 MRS에서 일상적으로 성장했다. 비피도박테리아 균주는 MRS에 0.1%(w/v) 시스테인-HCl(MRScys)을 보충한 것을 제외하고 동일한 조건에서 성장했다.
위 스트레스 저항성 및 담즙염 생존은 pH 2.3에서 30분 동안, pH 3에서 90분 동안 모의 위 용액(L당: NaCl 7.3g, KCl 0.52g, NaHCO3 3.78g 및 펩신 3g), 및 180분 동안 0.3%(w/v) 담즙염을 함유하는 배양 배지에 균주를 노출시켜 연구했다. 인큐베이션 시간 전후에 연속 희석 및 계수 방법을 사용하여 증식성 박테리아를 계수했다. 상업용 프로바이오틱 균주 L. 람노서스 GG를 기준으로 사용했다.
장 상피에 대한 부착은 Caco-2 장 상피 세포를 사용하여 시험관내에서 연구했다. 박테리아 현탁액을 Caco-2 단층(감염의 다양성(MOI) 1:5 세포 대 프로바이오틱) 및 대조군으로서 Caco-2 세포가 없는 웰에 첨가했다. 37℃에서 1시간의 인큐베이션 후 배지를 제거하고 세포를 분리하고 현탁액을 회수했다. 박테리아는 연속 희석 및 플레이트 계수에 의해 수득된 현탁액에서 계수되었다. 대조군 웰의 배지에서 박테리아도 또한 정량화되었다. B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707은 47-55의 알려진 부착 백분율로 품질 관리로 사용되었다.
HMO 분해 능력은 고유한 탄소원으로 HMO 락토-N-테트라오스(1%)로 MRS에서 균주를 성장시켜 테스트했다. 글루코스 1%를 갖는 MRS를 양성 대조군으로 사용했다. 탄소원이 없는 MRS를 음성 대조군으로 사용했다. 성장을 24시간 동안 모니터링하였다.
B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894) 게놈 서열은 Illumina Hiseq에 의해 얻어졌으며 판독이 조립되고 주석이 달렸다. 어드헤신, 박테리오신, HMO-분해 효소 및 담즙염 가수분해효소와 같은 관심있는 유전자를 BLAST에 의해 게놈에서 검색했다.
3.2 결과
위 상태에 대한 저항성을 pH 완충(30분 동안 pH 2.3) 없이 빠른-위 통과와 pH 완충(90분 동안 pH 3)을 사용한 느린 식후 소화를 시뮬레이션하여 평가했다. B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)뿐만 아니라 잘 알려진 프로바이오틱 균주 L. 람노서스 GG는 pH 2.3 및 pH 3에서 위 문제에서 <1 log cfu/mL 손실을 나타냈다(표 4). 부가하여, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 L. 람노서스 GG의 유사한 수준에서 <0.5 log cfu/mL 손실로 담즙염에 대한 높은 내성을 나타냈다. 더욱이, 담즙염 가수분해효소를 인코딩하는 - bsh 유전자의 한 복사본이 B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894) 게놈에서 발견되어, 균주가 위장관에 잘 적응되어 있음을 확인했다.
표 4. 위 스트레스 및 담즙염에 대한 저항성 및 장 상피에 대한 부착. 제시된 값은 LOG cfu/mL의 평균 및 표준 편차 또는 LOG cfu/mL의 %이다. L. 람노서스 GG 및 B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707을 대조군으로 사용했다. NA, 해당되지 않음.
B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 70.8% 부착 능력으로 장 상피에 부착하는 것으로 확인되었다(표 4). 균주는 적당하게 부착하는 대조군 균주 B. 롱검 아종 롱검 ATCC 15707(51.2%)보다 더 많이 부착되었다. 게놈 분석은 균주가 여러 부착 단백질과 도메인을 잘 갖추고 있음이 확인하였다. 인간 조직에 대한 박테리아의 부착은 효과적인 박테리아 집락화를 위한 전제조건이며, 이는 결국 지속적인 건강상의 이점 효과를 달성하는데 바람직한 특성이다.
B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 유일한 탄소원으로 HMO 락토-N-테트라오스(LNT)의 존재에서 성장할 수 있었다(도 5). 게놈은 락토-N-바이오시다제, 베타-갈락토시다제, 알파-갈락토시다제, 헥소스아미니다제, 베타-글루쿠로니다제를 포함한 HMO-분해 유전자를 보유하는 것으로 확인되었다. 따라서, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)에 의한 HMO 활용이 표현형 및 유전형으로 확인되어 유아 장에 잘 적응하는 것으로 입증되었다.
부가하여, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894) 게놈은 탄수화물 활성 효소(CAZy)를 인코딩하는 다른 유전자를 보유하고 있으며, 이는 다양한 인간 식이에서 나오는 것과 같은 광범위한 복잡한 물질을 분해하는 그 능력을 시사한다. B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)는 다기능 탄수화물 대사를 하는 것으로 보인다.
추가 분석은 란티펩티드 B, 세르핀 및 어드헤신을 인코딩하는 유전자의 존재를 보여주었다. 란티펩티드 B(란티바이오틱)는 다양한 그람-음성 및 그람-양성 병원성 박테리아에 대해 강력한 항균 활성을 나타내는 B. 롱검 균주에 의해 생산된 클래스-I 박테리오신이다. 세르핀(세린 프로테아제 억제제 유래)은 인간 호중구와 췌장 엘라스타제(프로테아제)를 선택적으로 불활성화하여 항염증 효과를 초래하고 장 항상성 유지에 기여한다.
전반적으로, B. 롱검 아종 롱검 KABP-042(CECT 7894)의 실험실내 및 인실리코 분석은 그것이 HMO를 분해하는 능력이 있기 때문에 유아 장을 포함한 인간 위장관에 잘 적응한다는 것을 나타내는 균주의 프로바이오틱 특성을 확인한다.
실시예 4: 장의 장벽의 보호에 있어서 B. 롱검 CECT7894 유래 polyP의 효과
polyP의 포스트바이오틱 효과는 장의 항상성을 유지하고 장의 장벽 기능을 보호하는데 있어서 그 역할과 관련된다. 하나의 작용 메커니즘은 장의 세포에서 세포보호 인자 열 충격 단백질 HSP27의 유도이다(Alcntara 등, 2018).
B. 롱검 CECT 7894에 의해 생성된 polyP가 장벽 무결성 및 장 투과성에 영향을 미치는지 여부를 연구했다. 부가하여, 효과가 HSP27 생산과 관련이 있는지 또는 밀착 연접 단백질을 포함한 장벽 무결성의 다른 유도 마커와 관련이 있는지 조사했다.
4.1. 재료 및 방법
4.1.1 B. 롱검 CECT 7894 샘플의 제조 및 polyP 생산의 정량화
B. 롱검 CECT 7894는 MEI 배지와 저 포스페이트(LP) 배지에서 성장되었다. 마지막 배지는 MEI와 동일한 조성을 가지지만 polyP 전구체(K2HPO4 및 KH2PO4)를 첨가하지 않아 균주는 높은 양의 polyP를 생산할 수 없다. 16시간 후 성장 배양물을 원심분리하고 상등액을 수집하고 여과하고 중성 pH로 조정했다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 PolyP 양을 측정하였다.
4.1.2. 장벽 무결성 및 투과성의 평가
Caco-2 세포 단층의 무결성은 경상피 전기 저항성(TEER)과 세포주위 이송 마커 Lucifer Yellow의 겉보기 투과성 계수(Papp)에 의한 투과성을 측정함에 의해 평가되었다.
Caco-2 세포는 정점(상부) 및 기저측(하부) 구획을 갖는 다공성 막 삽입물에 시딩되었다. 배지 필수 배지 이글(MEM)이 두 구획 모두에 추가되었다. 세포를 MEI 및 LP 배지에서 성장한 B. 롱검 CECT 7894의 상등액으로 처리하였다. 추가 세포를 MEM, 비-발효된 MEI 및 LP 배지로 처리하고 대조군으로 사용했다.
72시간의 처리 후 TEER과 투과성을 결정했다. TEER은 Milli-cell®-ERS 전압전류계로 측정했다. 투과성 검정을 위해 Lucifer Yellow를 정점 구획에 추가했다. 15, 30, 45, 60, 90 및 120분에 기저측 구획에서 분취량을 취하고 이송된 Lucifer Yellow의 형광을 485/520nm의 여기/방출 파장에서 형광 마이크로플레이트 판독기로 측정했다.
4.1.3. HSP27 생산의 정량화
HSP27의 생산은 Alcntara 등, 2018에서 기술된 대로 일부 변형을 거쳐 웨스턴 블랏 검정에 의해, 컨플루언스에서 Caco-2 장 상피 세포에서 연구하였다. 박테리아 상등액을 세포 배양물에 첨가하고 16시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. MEI 및 LP 배지가 대조군으로 사용되었다. HSP27을 회수하기 위해, 세포를 SDS-PAGE로 용리시키고 5분 동안 끓였다. 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 분리한 다음 나일론 막(블랏)으로 옮겼다. 블랏을 토끼 다클론 항-HSP27 혈청 또는 마우스 단클론 항-β-액틴 항체(정규화에 사용된 단백질)와 인큐베이션했다. 세정 후, 2차 항체 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 IgG와 항-마우스 IgG를 각각 사용하였다. 블랏 이미지를 캡처하고 Imagin 680 시스템에서 단백질을 정량화했다.
4.1.4. 밀착 연접 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현
Caco-2 세포를 MEI 및 LP 배지에서 성장한 B. 롱검 CECT 7894의 상등액에 16시간 동안 노출시켰다. 그런 다음 세포를 회수하고 TRIZOL 시약으로 RNA를 추출하였다. SuperScript VILO cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 얻었다. 정량적 PCR(qPCR) 반응은 제조업체에 의해 표시된 조건에서 SYBR Green으로 수행되었다. 밀착 연접 단백질 Zonula ocludens-1(ZO1), 연접성 부착 단백질-1(JAM1) 및 옥클루딩의 발현을 정량화했다. 18S rRNA 및 GADPH 유전자의 발현을 정규화에 사용했다.
4.2 결과
첫째, MEI 배지에서 성장한 상등액에서의 polyP 양은 LP 배지에서 성장한 상등액에서의 양보다 높았다(표 5). 주목할 점은 MEI에서의 양이 동일한 배지에서 실시예 1에서 정량된 양보다 낮았다. 그러나, 실시예 1에서는 polyP가 세포내에서 측정되는 반면 실시예 4에서는 polyP가 세포외에서 측정된다. 세포외 생산은 장에서의 조건, 즉 장 장벽과 접촉하는 세포외 polyP를 모방하기 위해 여기서 연구되었다.
표 5. 높은(MEI 배지) 또는 낮은(LP 배지) 포스페이트 조건 하에서 16시간 동안 성장한 B. 롱검 CECT 7894 상등액에서 PolyP 양(nmol). 각 조건에서 성장(OD550)이 표시된다.
이중구획 시스템에서 Caco-2 단층의 실험은 고농도의 polyP(즉, MEI 배지에서의 배양물 유래)를 갖는 B. 롱검 CECT 7894의 상등액에 대한 정점 노출이 낮은 polyP 양을 가진 상등액 및 대조군에 비하여 더 높은 TEER(세포 장벽의 더 큰 저항성을 나타냄)를 나타냈음을 보여주었다. 정점에서 기저측 구획으로의 Lucifer Yellow의 흐름에 의해 측정하는 실험은 또한 B. 롱검 CECT 7894로부터 유래된 높은 polyP 농도가 낮은 polyP 상등액 및 대조군과 비교하여 화합물의 투과성을 유의하게 감소시켰다는 것을 나타냈다(도 6에 도시됨). 이들 결과는 B. 롱검 CECT 7894에 의해 생산된 polyP가 장의 투과성을 방지하는 더 강력한 기능적 장벽을 촉진한다는 것을 나타낸다. 중요하게, 상등액에서 polyP의 양이 세포내보다 낮음에도 불구하고 그 효과가 유의하며, 이는 B. 롱검 CECT 7894에 의해 생성된 적은 양의 polyP가 장벽 무결성에 유익한 효과를 갖기에 충분하다는 것을 시사한다.
장 상피 세포에서 HSP27 생산의 웨스턴 블롯 분석은 B. 롱검 CECT 7894에 의해 생산된 고농도의 polyP를 갖는 상등액(즉, MEI 배지에서의 배양물 유래)이 저농도의 polyP를 갖는 배양물로부터 상등액(즉, LP 배지에서의 배양물 유래)에 비해 HSP27의 유의하게 높은 생산을 유도함을 보여주었다. 부가하여, 다양한 양의 polyP를 갖는 다양한 샘플을 사용하여 B. 롱검 CECT 7894의 상등액에서 HSP27 발현과 polyP 농도 사이의 상관관계도 관찰되었다(도 7에 도시됨). 이들 결과는 B. 롱검 CECT 7894가 polyP의 합성을 통해 HSP27 생산에 영향을 미칠 수 있으므로 균주가 장 상피의 보호 효과가 있음을 나타낸다.
더욱이, 장벽 무결성의 유지에 중요한 밀착 연접 단백질 ZO1, JAM1 및 옥클루딘의 발현은 낮은 polyP 상등액과 비교하여 B. 롱검 CECT 7894의 상등액에 높은 양의 polyP의 존재에 의해 유도되었다(도 8에 도시됨).
전반적으로, 이들 결과는 polyP 생산을 통한 균주 B. 롱검 CECT 7894가 세포 보호 단백질 HSP27 및 밀착 연접 단백질의 생산 유도에 의해 장의 투과성을 감소시키는 장벽 무결성을 강화시킬 수 있음을 확인시켜 준다. 따라서, B. 롱검 CECT 7894는 장 장벽 항상성에 긍정적인 영향을 미친다.
실시예 5: B. 롱검 CECT7894의 PolyP 생산 능력에서 모유, HMO 락토-N-테트라오스 및 폴리아민의 영향
B. 롱검은 인간 모유와 유아의 장에서 자연적으로 발견된다. 모유는 다량의 포스페이트(polyP의 기질)를 함유한다. B. 롱검 CECT 7894가 모유의 존재에서 polyP를 생산할 수 있는지 여부를 연구했다. 부가하여, 다른 박테리아의 일부 증거에서는 폴리아민과 탄소원이 polyP 대사에 영향을 미칠 수 있음을 시사했다(Anand 등, 2019). 모유에는 폴리아민과 탄수화물 HMO가 함유되어 있으므로, (실시예 3에서 확인된 바와 같이) B. 롱검 CECT 7894가 활용하는 폴리아민과 HMO 락토-N-테트라오스(LNT)가 연구된 균주에서 polyP 생합성에 영향을 미칠 수 있는지 테스트했다.
5.1. 재료 및 방법
B. 롱검 CECT 7894는 i) 모유(1% v/v); ii) LNT(1% w/v); iii) 모유에서 발견되는 양의 폴리아민: 각각 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민의 70.0, 424.2 및 610.0 10nmol/dl 및 글루코스(0.5% w/v); 및 iv) 양성 대조군으로서 글루코스(0.5% w/v)가 보충된 글루코스 없는 MEI 배지에서 성장시켰다. 성장(OD550) 및 polyP 생산은 인큐베이션 6시간 및 16시간 후에 결정되었다.
5.2 결과
모유(유일한 탄소원으로서 모유에 존재하는 당을 가짐)의 존재에서 B. 롱검 CECT 7894 성장의 분석은 균주가 단지 낮은 OD에 도달했음에도 불구하고 6시간에도 여전히 일정량의 PolyP를 생산할 수 있음이 나타냈다. 유일한 탄소원으로 LNT로의 성장은 6시간에서 대조군 조건에서의 성장보다 낮았다(OD 1.8 대 2.9). 그러나, 균주는 더 큰 양의 polyP를 생성했다(117.0 대 110.2). 부가하여, polyP는 대조군에 비해 LNT에서 더 오랜 기간 동안 유지되었다(16시간에 145.0 대 70.2). 글루코스를 갖는 MEI 배지에 폴리아민의 존재는 성장이나 polyP 생산에 영향을 미치지 않았다(표 6 및 도 9 참조).
표 6. 6시간 및 16시간에서 다양한 조건 하에서 인큐베이션된 B. 롱검 CECT 7894 배양물의 PolyP 정량화(nmol) 및 성장(OD550).
결론적으로, 이들 결과는 B. 롱검 CECT 7894가 모유의 존재에서 polyP를 생성할 수 있고 HMO LNT가 polyP의 생합성을 강화한다는 것을 나타내며, 이는 연구된 균주에서 polyP 대사의 LNT-의존적 조절을 시사한다. 중요하기로는, 이것은 처음으로 HMO와 polyP의 상호작용을 나타낸 것이고 예를 들어, 유아에서 B. 롱검 CECT 7894 보충이 미칠 수 있는 유익한 역할을 강조한다.
실시예 6: 2FL을 활용하는 비피도박테리아와 B. 롱검 CECT 7894의 교차-공급
B. 롱검 CECT 7894가 예를 들어, 모유 또는 인간 장에 존재하는 다른 비피도박테리아의 교차-공급을 통해 HMO 2'-FL과 함께 성장할 수 있는지 여부를 연구했다.
6.1. 재료 및 방법
B. 비피덤 Bb01(CECT 30646)을 2'-푸코실-락토스(2'-FL)(4% w/v)를 유일한 탄소원으로 갖는 MRS 배지에서 48시간 동안 성장시켰다. 상등액을 회수하고 여과하여 세포를 제거했다. 상등액을 탄소원이 없는 새로운 배지 MRS와 혼합했다(1:1). B. 롱검 CECT 7894를 혼합물에서 24시간 동안 성장시키고 OD를 모니터링하였다.
6.2. 결과
B. 롱검 CECT 7894는 0.5의 OD에 도달하는 2'-FL로 배양된 B. 비피덤 Bb01(CECT 30646)의 상등액의 존재에서 성장할 수 있었다(도 10). 이 결과는 B. 롱검 CECT 7894가 2'-FL을 활용하는 다른 비피도박테리아에 의해 공급될 수 있음을 입증한다. 따라서, 실시예 3(도 5)의 결과와 함께, B. 롱검 CECT 7894는 모유에서 2개의 가장 풍부한 HMO(LNT 및 2'-FL)의 존재에서 성장할 수 있다.
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특허 문헌
WO2015018883A2
JP2006176450A

Claims (16)

  1. 프로바이오틱 조성물로서,
    부다페스트 조약 하에 스페인 유형 배양 컬렉션, CECT에 수탁 번호 CECT 7894 하에 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하며, 대상체에서 증가된 장의 투과성 및 이의 연관된 병태의 치료에 사용되고,
    여기서 상기 증가된 장의 투과성의 치료는 폴리포스페이트를 생산함에 의한 것이며,
    여기서 상기 유래된 박테리아 균주는:
    (a) 상응하는 상기 기탁된 균주의 게놈과 적어도 99%의 평균 뉴클레오티드 동일성인 ANI를 갖는 게놈을 가지고;
    (b) 폴리포스페이트를 생산하는 데 있어 상응하는 상기 기탁된 균주의 능력을 보유하며;
    여기서 상기 연관된 병태는 비 장의(non-intestinal) 병태인, 프로바이오틱 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 비 장의 연관된 병태는 면역 장애 또는 질환, 대사 또는 심혈관 장애 또는 질환, 또는 신경학적 또는 정신과적 장애 또는 질환인, 프로바이오틱 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 연관된 병태는 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 비 알코올성 지방간 질환, 간경변증, 비 영양성 알레르기/과민증, 면역노화, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 홍반성 루푸스, 근육감소증, 천식, 알레르기성 비결막염, 아토피성 피부염, 알츠하이머병, 죽상동맥경화증, 고혈압, 만성 심부전, 뇌졸중, 자폐 스펙트럼 장애, 정신분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로바이오틱 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 모유 올리고당을 추가로 포함하는, 프로바이오틱 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 장의 투과성 및 연관된 병태는 조산, 노화, 고강도 신체 활동, 식이 불균형, 감염, 약물 치료 및/또는 스트레스와 관련되는, 프로바이오틱 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간이고, 여기서 인간은 노인, 조산 유아, 유아, 운동선수 및 허약한 사람으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로바이오틱 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 유아는 조산 유아, 허약한 유아, 정상 이하의 출생 체중으로 태어난 유아, 자궁내 성장 지연의 유아 대상체, 제왕절개로 태어난 유아, 항생제를 투여받은 유아, 조제분유를 먹는 유아, 모유를 먹는 유아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 프로바이오틱 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유래된 박테리아 균주는 상응하는 기탁된 균주의 게놈에 대해 적어도 99.5%의 평균 뉴클레오티드 동일성을 갖는 게놈을 갖는, 프로바이오틱 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 균주 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주의 폴리포스페이트의 생산은, 폴리포스페이트 생산이 다음 단계에 의해 배양 6시간 및/또는 16시간에서 결정될 때 대조군 균주의 폴리포스페이트의 생산보다 더 높은, 프로바이오틱 조성물:
    (a) 37℃에서 혐기성 조건 하에서, 리터당, w/v로: 0.5% 효모 추출물, 0.5% 트립톤, 0.4% K2HPO4, 0.5% K2HPO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.005% MnSO4, Tween 80 1ml, 0.05% 시스테인 및 0.5% 글루코스를 함유하는 말산 효소 유도 배지에서 OD 0.1에서 접종된 균주를 배양하는 단계;
    (b) 실온에서 45분 동안 가볍게 교반하면서 5% 차아염소산나트륨 1ml에서 원심분리 및 용리에 의해 세포를 수확하는 단계;
    (c) 불용성 물질을 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 원심분리하여 펠렛을 얻고, 1.5M NaCl 1ml에 더하여 1mM EDTA로 16,000g에서 4℃에서 5분 동안 2회 세정하는 단계;
    (d) 1ml의 물로 2번 연속 세정하여 상기 펠렛으로부터 폴리포스페이트를 추출하고 그 사이에 4℃에서 5분 동안 16,000g에서 원심분리하는 단계;
    (e) 0.1M NaCl 및 1 부피의 에탄올을 첨가하고 이어서 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하여 풀링된 물 추출물에 폴리포스페이트를 침전시키는 단계;
    (f) 16,000g에서 10분 동안 원심분리하고 폴리포스페이트 펠렛을 50μL의 물에 재현탁시키는 단계;
    (g) 다음 단계에 따라, 폴리포스페이트 유래 포스페이트 양과 형광 강도를 연관시키는 표준 곡선을 구축하는 단계:
    i. 대조군 균주 락토바실러스 플란타럼 WCFS1로부터 단리된 폴리포스페이트의 샘플의 일련의 희석액을 1 부피의 2M HCl로 가수분해하고 95℃에서 15분 동안 인큐베이션하는 단계;
    ii. 절반 부피의 2M NaOH를 첨가함에 의해 상기 희석액을 중화시키는 단계;
    iii. BIOMOL Green 키트로 방출된 포스페이트를 측정하여 각 희석액에서 포스페이트의 양을 획득하는 단계;
    iv. 형광측정기에서 415nm의 여기 파장 및 550nm에서 방출로 50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 완충액 중 최종 농도 10μM에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, DAPI를 사용하여 형광에 의해 방출된 포스페이트를 측정하여 각 희석액에서 형광 값을 획득하는 단계; 및
    v. (iii)에서 획득된 포스페이트 값과 (iv)에서 획득된 상응하는 형광 값으로 표준 곡선을 구축하는 단계; 및
    (h) 단계 (f)의 재현탁된 분획으로부터 폴리포스페이트를 정량화하는 단계:
    1) 형광측정기에서 415nm의 여기 파장 및 550nm에서 방출로 50mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM NaCl 완충액에서 최종 농도 10μM에서 DAPI를 사용하여 형광에 의해 포스페이트를 측정하는 단계;
    2) 표준 곡선의 수단에 의해 폴리포스페이트의 양을 계산하는 단계; 및
    3) 폴리포스페이트 값을 포스페이트의 nmol 단위로 표현하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, B. 롱검 아종 롱검 CECT 7894 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주의 6시간에서 폴리포스페이트의 생산은 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 폴리포스페이트의 생산보다 적어도 10배수 더 높고, 16시간에서 더 높으며, 여기서 대조군 균주 L. 플란타럼 WCFS1의 폴리포스페이트의 생산 및 대조군 균주에 의한 폴리포스페이트의 수준은 16시간에서 존재하지 않는, 프로바이오틱 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 수탁 번호 CECT 7894 하에 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주를 포함하는, 프로바이오틱 조성물.
  12. 조합물로서,
    (i) 프로바이오틱 조성물로서,
    부다페스트 조약 하에 스페인 유형 배양 컬렉션, CECT에 수탁 번호 CECT 7894 하에 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 롱검 균주 또는 이로부터 유래된 박테리아 균주를 포함하고, 여기서 유래된 박테리아 균주는:
    (a) 상응하는 기탁된 균주의 게놈과 적어도 99%의 평균 뉴클레오티드 동일성인 ANI를 갖는 게놈을 가지고; 그리고
    (b) 폴리포스페이트를 생산하는 데 있어 상응하는 기탁된 균주의 능력을 보유하는 것인, 프로바이오틱 조성물; 및
    (ii) 적어도 하나의 모유 올리고당
    을 포함하고, 여기서 조합물은 동시, 별도 또는 순차적 투여를 위해 구성되는, 조합물.
  13. 제12항에 있어서, 모유 올리고당은 푸코실화된 올리고당, 시알릴화된 올리고당, N-아세틸-락토사민 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
  14. 제13항에 있어서, 2'-푸코실락토스 및/또는 락토-N-테트라오스를 포함하는, 조합물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 비피도박테리움 비피덤 균주, 특히 B. 비피덤 CECT 30646을 추가로 포함하는, 조합물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 증가된 장의 투과성 및 연관된 병태의 치료에 사용되고, 여기서 상기 증가된 장의 투과성의 치료는 폴리포스페이트를 생산함에 의한 것이고, 연관된 병태는 면역 장애 또는 질환, 대사성 또는 심혈관 장애 또는 질환, 신경학적 또는 정신과적 장애 또는 질환 및 위장 장애 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
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