CN116716206B - 一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用 - Google Patents

一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用，所述长双歧杆菌婴儿亚种的具体名称为长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis BI33，保藏编号为CGMCC No.24474。所述长双歧杆菌婴儿亚种BI33具有DPPH、ABTS、羟基自由基和超氧自由基清除活性；能够改善人表皮细胞抗氧化能力；缓解特应性皮炎相关症状；能够提高皮肤菌群丰度，且效果显著强于其他菌株，这是因为其参与了肠道‑皮肤轴调控，在其作用下，从根本上实现了皮炎等症状的缓解及皮肤内外稳态的维持，可用于制备具有相应功效的产品中。

Description

一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌 婴儿亚种及其应用
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用。
背景技术
肠道和皮肤是血管密集且神经支配丰富的器官，具有重要的免疫和神经内分泌作用，有独特的相关性。其中，皮肤是人体最大的器官之一，最直接与外界接触，是人体免疫系统第一道生理屏障。特应性皮炎、银屑病、鱼鳞病等遗传、环境相关性疾病一直是临床治疗的难题，严重影响着患者的生活质量，而这些疾病的发病基础均与皮肤屏障功能受损有关。近年来对于皮肤屏障的相关研究处于飞速发展阶段，改善皮肤屏障功能为治疗多种皮肤病的根本原则。已有研究表明，肠道菌群是肠-皮肤轴的主要调控者，肠道微生物组，及其代谢产物(如乳酸、短链脂肪酸、多糖、抗菌肽等物质)与皮肤稳态和平衡存在双向联系。胃肠道疾病通常伴有皮肤表现(湿疹、脂溢性皮炎、头皮屑等)，而肠道微生物组也参与了皮肤相关炎症性疾病的病理生理学，其对皮肤屏障功能受损的修复具有积极作用，参与调节宿主炎症、皮肤屏障和皮肤祛皱/抗老、修复、保湿、增强皮肤弹性等生理活动。
益生菌补充或可作为肠道-皮肤轴调控的关键参数。通过口服、皮肤局部涂抹益生菌或其相关裂解物等方式，参与皮肤健康活动，如清除体内氧化代谢产物自由基，减少对身体细胞及组织器官损伤，提高皮肤细胞的抗氧化能力，延缓衰老；增强皮肤屏障功能，有效预防各种皮肤疾病。
因此，如何提供一种可参与肠道-皮肤轴调控，增强皮肤屏障功能，提高皮肤抗氧化能力的微生物制剂，从根本上解决因各种皮肤问题而降低皮肤患者生活质量和困扰，已成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种，所述长双歧杆菌婴儿亚种的具体名称为长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BI33，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24474，保藏日期为2022年03月07日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物，所述培养物由包括如下步骤的方法制得：将长双歧杆菌婴儿亚种BI33接种于培养基中于30-45℃下培养，即得培养物。
上述30-45℃中的具体数值例如30℃、32℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃等，优选为35-40℃。
优选地，所述培养的时间为12-48h，例如12h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、36h、40h、44h、48h等。
优选地，所述培养基中的组分包括蛋白胨、乳清蛋白、葡萄糖、乳糖、柠檬酸氢二铵、K2PO4、MgSO4、MnSO4或L-半胱氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述培养基中的组分以浓度计包括蛋白胨8-12g/L、乳清蛋白12-18g/L、葡萄糖15-25g/L、乳糖8-12g/L、柠檬酸氢二铵1.5-2.5g/L、K2PO4·1-3g/L、MgSO4·0.1-1g/L、MnSO4 0.008-0.015g/L或L-半胱氨酸0.8-1.5g/L中的任意一种或至少两种的组合。
上述8-12g/L中的具体数值例如8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L等。
上述12-18g/L中的具体数值例如12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L等。
上述15-25g/L中的具体数值例如15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L等。
上述1.5-2.5g/L中的具体数值例如1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2.0g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L等。
上述1-3g/L中的具体数值例如1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.7g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.7g/L、3g/L等。
上述0.1-1g/L中的具体数值例如0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等。
上述0.008-0.015g/L中的具体数值例如0.008g/L、0.009g/L、0.01g/L、0.011g/L、0.012g/L、0.013g/L、0.014g/L、0.015g/L等。
上述0.8-1.5g/L中的具体数值例如0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L等。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物，所述发酵溶胞产物由包括如下步骤的方法制得：将长双歧杆菌婴儿亚种BI33接种于培养基中于30-45℃下培养，得到发酵液，升温至65-75℃后保温15-30min，后在25-35℃下与溶菌酶混合12-20h，得混合液，过滤，收集上清，即得发酵溶胞产物。
上述30-45℃中的具体数值例如30℃、32℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃等，优选为35-40℃。
上述65-75℃中的具体数值例如65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃等。
上述15-30min中的具体数值例如15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min等。
上述25-35℃中的具体数值例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等。
上述12-20h中的具体数值例如12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h等。
优选地，所述培养的时间为12-48h，例如12h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、36h、40h、44h、48h等。
优选地，所述升温在15min内进行，例如升温时间可以为1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，所述保温后需要将发酵液在15min内降温至25-35℃，后与溶菌酶混合。
优选地，所述溶菌酶的重量占发酵液重量的0.05％-0.15％，例如0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％等。
优选地，所述混合在搅拌下进行，所述搅拌的转速为300-1000r/min。
优选地，所述过滤后还包括将上清离心，收集上清液，即得发酵溶胞产物。
优选地，所述离心的转速为4000-8000g，时间为5-20min。
优选地，所述培养基中的组分包括蛋白胨、乳清蛋白、葡萄糖、乳糖、柠檬酸氢二铵、K2PO4、MgSO4、MnSO4或L-半胱氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述培养基中的组分以浓度计包括蛋白胨8-12g/L、乳清蛋白12-18g/L、葡萄糖15-25g/L、乳糖8-12g/L、柠檬酸氢二铵1.5-2.5g/L、K2PO4·1-3g/L、MgSO4·0.1-1g/L、MnSO4 0.008-0.015g/L或L-半胱氨酸0.8-1.5g/L中的任意一种或至少两种的组合。
上述数值范围内可取点值参照第二方面，不再赘述。
第四方面，本发明提供一种复合菌剂，所述复合菌剂中包括如第一方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21，所述长双歧杆菌BL21的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10452，保藏日期为2015年01月27日。
优选地，所述复合菌剂中包括长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物和长双歧杆菌BL21的发酵溶胞产物。
优选地，所述长双歧杆菌BL21的发酵溶胞产物的制备方法参照长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物的制备方法进行，具体包括：将长双歧杆菌BL21接种于培养基中于30-45℃下培养，得到发酵液，升温至65-75℃后保温15-30min，后在25-35℃下与溶菌酶混合12-20h，得混合液，过滤，收集上清，即得发酵溶胞产物。
具体方法的优选及数值范围内可取点值参照第三方面中长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物的制备方法，不再赘述。
优选地，所述长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物与长双歧杆菌BL21的发酵溶胞产物的质量比为(1-3):(0.5-1.5)。
上述(1-3)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3等。
上述(0.5-1.5)中的具体数值例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等。
优选地，所述复合菌剂中还包括椰子油和/或乳化剂。
第五方面，本发明提供如第一方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如第二方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如第三方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如第四方面所述的复合菌剂在制备治疗皮炎的药物中的应用。
优选地，所述皮炎包括特应性皮炎。
第六方面，本发明提供如第一方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如第二方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如第三方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如第四方面所述的复合菌剂在制备具有抗氧化功效的药物或化妆品中的应用。
第七方面，本发明提供如第一方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如第二方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如第三方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如第四方面所述的复合菌剂在制备提高皮肤菌群多样性的药物中的应用。
第八方面，本发明提供一种提高皮肤菌群多样性的方法，所述方法包括向目标对象施加如第一方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如第二方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如第三方面所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如第四方面所述的复合菌剂。
所述目标对象包括人类或动物。
优选地，所述施加的方式例如口服、注射、涂抹等。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明新筛选得到一株参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种BI33，其具体功效为：(1)具有DPPH、ABTS、羟基自由基和超氧自由基清除活性；(2)改善人表皮细胞抗氧化能力；(3)缓解特应性皮炎相关症状；(4)提高皮肤菌群丰度。长双歧杆菌婴儿亚种BI33改善皮肤健康状态的效果显著强于其他菌株，这是因为其参与了肠道-皮肤轴调控，在其作用下，从根本上实现了皮炎等症状的缓解及皮肤内外稳态的维持，因此可用于制备具有相应功效的产品中。
另外长双歧杆菌BL21虽效果不如BI33，但二者复配后，在等量的情况下，复配的效果竟好于BI33单菌，可能是两种菌株相互作用，在参与肠道-皮肤轴调控过程中相互促进，因此在清除自由基、改善人表皮细胞抗氧化能力、提升皮肤菌群多样性、缓解特应性皮炎症状、维持皮肤内外稳态方面产生了协同增效的作用。而用其他的菌株则无法实现此效果。
附图说明
图1是不同温度时间对长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌株的培养结果图。
图2是长双歧杆菌婴儿亚种BI33及其溶胞产物的安全性评价结果图，A为体外皮肤刺激试验SIT的测试结果，B为体外眼刺激试验EIT的测试结果。
图3是长双歧杆菌婴儿亚种BI33及其溶胞产物的清除自由基效果测试图，A为BI33菌悬液的测试结果，B为BI33溶胞产物的测试结果。
图4是长双歧杆菌婴儿亚种BI33及其溶胞产物的提高细胞抗氧化能力的效果测试图，A为胞内过氧化氢酶(CAT)测试结果，B为超氧化物歧化酶(SOD)测试结果，C为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试结果，D为丙二醛(MDA)测试结果，E为活性氧(ROS)测试结果。
图5是长双歧杆菌婴儿亚种BI33或复合菌对小鼠背部皮肤菌群α多样性的影响结果图，A为Chao1指数的结果，B为shannon指数的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所有的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
下述涉及的液体培养基C1配方为：蛋白胨10g、乳清蛋白15g、葡萄糖20g、乳糖10g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.6g、MnSO40.01g、L-半胱氨酸1g，加水至1000mL。
下述涉及的长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌悬液的制备方法为：将长双歧杆菌婴儿亚种接种于液体培养基C1中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于液体培养基C1中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，收集沉淀(菌体)，使用PBS重悬菌体，即得菌悬液。
下述涉及的长双歧杆菌婴儿亚种BI33发酵溶胞产物(以下简称为溶胞产物)的制备方法为：将长双歧杆菌婴儿亚种BI33接种(接种量2％)于液体培养基C1中，37℃下厌氧培养24h，得到发酵液；快速升温(升温时间10min)至70℃并保温20min，然后快速(降温时间20min)冷却至30℃，向处理过的发酵液中加入0.1％的溶菌酶，在30℃温度下搅拌(速度650r/min)15h后，用灭菌过的滤布过滤酶解液，然后离心(6000g，10min)除去沉淀，即得半澄清液体状的长双歧杆菌婴儿亚种BI33溶胞产物。
下述涉及的长双歧杆菌BL21溶胞产物、长双歧杆菌ATCC 15707溶胞产物的制备方法均参照长双歧杆菌婴儿亚种BI33溶胞产物的制备方法，区别仅在于菌株种类的替换，其他条件均不变。
实施例1
本实施例筛选一株能够参与肠道-皮肤轴调控的长双歧杆菌婴儿亚种，步骤如下：
(1)选取江苏省苏州市母乳喂养健康婴儿粪便样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40％的甘油进行保藏。
(2)针对保藏的单菌进行体外生理特性测试，具体为如下：
A.耐胃酸能力测试：
使用MRS液体培养基、MRS固体培养基，主要试剂有胃蛋白酶、胰蛋白酶等。把MRS培养基的pH调到3.0，121℃下15min灭菌后按2％的接种量接入已活化两代的液体培养扩培物，37℃培养24h，测定其在24h过程中的吸光度的变化ΔOD600值。以pH＝6.80的PBS缓冲液为基础，再用37％的盐酸将其调至3.0，121℃下15min灭菌后按10％接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。
B.产酸能力测试：
采用滴定法测定菌株的产酸能力。取甘油管保藏的菌株活化后按2％接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养18h，取各菌株的发酵液10mL于50mL无菌水中，滴加2-3滴1g/L的酚酞作为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，以溶液出现粉红色且30s后不褪色为滴定终点，每个样品3次平行。以未接种的MRS液体培养基作空白对照，其计算公式为：总酸度(g·L-1)＝(V1-V2)×c×100×V0-1(V1为样品消耗NaOH溶液的体积，mL；V2为空白对照消耗NaOH溶液的体积，mL；V0为稀释液的总体积，mL；c为标准NaOH的浓度，mol/L)。
综合上述筛选实验，选择产酸量最多且胃酸耐受能力最强的一株菌株。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
(1)形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于38℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可得，菌落为光滑的乳白色小圆点。挑选对数生长期的该菌株，进行光学显微镜检测，经涂片和革兰氏染色后镜检观察到：革兰氏染色为阳性，菌株形态为杆状，无芽孢无鞭毛。
(2)16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，按2％比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养24h后在8000rpm下离心10min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为长双歧杆菌婴儿亚种。
SEQ ID No.1：
CGACTAAGGAGCCTCACCTTAGACGGCTCCATCCCACAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCGCGTCGCCGCGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCACAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAACCCCATCTCTGGGATCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCCGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGCGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCAACGGGTAAACTCACTCACGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCACGGTGGGCCGTTACCCCGCCGTCAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATACCGCGAAAGCTTTCCCAGAAGACCATGCGATCAACTGGAACATCCGGCATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGTATGGGGCAGGTCGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCACCAAGCAAGCTTGATGGATCCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGCACGCCGCCAAAGGCCC。
基于16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于长双歧杆菌婴儿亚种，命名为长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis BI33菌株。
(3)可利用碳源
根据API细菌鉴定标准利用API 50CHL培养基(基础培养基，由48种可发酵碳水化合物的API 50CH试验条组成)和API 50CH试验条对检测菌株BI33进行糖发酵反应判读检测其碳源利用能力。该方法原理是利用需测定的菌株制成悬液接种在每个试验条小管里，经过培养，能够被利用的碳源管会因其发酵产酸，pH下降，从而使指示剂变色。
最后结果得到，长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌株可利用的碳源为：葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、核糖、木糖、蜜二糖、蔗糖、N-乙酰-葡糖胺和棉子糖。
实施例3
本实施例对长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌株的培养条件进行优化，步骤如下：
将长双歧杆菌婴儿亚种BI33接种于液体培养基C1中，分别于10-50℃的不同温度下培养48h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。结果如图1所示。
结果显示，不同温度下长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌株的增殖速率差异较大，与其他温度相比，35-40℃最适宜生长增殖，培养18-24h即可达到生长稳定期。
实施例4
本实施例验证长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌株的耐胃酸能力，步骤如下：
(1)制备人工胃液：以质量分数计，人工胃液中含有0.20％的NaCl以及0.30％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
(2)耐胃酸能力测试：取1.0mL长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌悬液(浓度为1×109CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：存活率(％)＝N1/N0×100％，其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表1。
表1
人工胃液pH 活菌数N0(0h) 活菌数N1(3h) 存活率(％)
2.0 (3.54±0.24)×108 (2.77±0.25)×108 78.3
2.5 (3.60±0.31)×108 (3.29±0.28)×108 91.5
3.0 (3.57±0.29)×108 (3.32±0.30)×108 93.0
由表1可以看出，本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率达78.3％；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达91.5％；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达93.0％。良好的胃酸耐受能力为其在胃肠道定植，维持胃肠道黏膜屏障稳态，参与肠道-皮肤轴调控以及制备预防、改善或治疗皮肤健康问题的产品创造了条件。
实施例5
本实施例评价长双歧杆菌婴儿亚种BI33及其溶胞产物的安全性：
体外皮肤刺激试验SIT：皮肤刺激试验根据经济合作与发展组织OECD TG 439(https://doi.org/10.1787/9789264242845-en)进行。分别利用10μL 3％ BI33菌悬液/溶胞产物、PBS(阴性对照)和5％十二烷基硫酸钠SDS(阳性对照)以局部接触重建的人体表皮(RhE)表面15分钟。处理后，用25mL PBS冲洗活性RhE，并在37℃下孵育42小时。将细胞浸入MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，1mg/mL)中并在培养箱中孵育3小时。加入酸化异丙醇，并在570nm处测定吸光度。
体外眼刺激试验EIT：眼刺激试验根据经济合作与发展组织OECD TG492(https://doi.org/10.1787/9789264242548-en)进行。将42μL 3％BI33菌悬液/溶胞产物、ddH2O(阴性对照)和乙酸甲酯(阳性对照)置于与重建人角膜样上皮(RhCE)表面局部接触30分钟。将活性RhCE用杜氏磷酸缓冲盐溶液冲洗10次，并在37℃下孵育2h。将细胞浸入MTT(1mg/mL)中并在培养箱中孵育3小时。加入酸化异丙醇，并在570nm处测定吸光度。
结果如图2所示：用3％BI33菌悬液或溶胞产物处理的RhE组织活力分别为106.1％、106.8％；用3％BI33菌悬液或溶胞产物处理的RhCE组织活力分别为101.3％、101.4％，根据OECD TG439和TG492刺激分类，该使用剂量预计不会引起皮肤或眼睛刺激。通常双歧杆菌作为食品添加剂和药物几乎没有表现出全身毒性。该试验发现，BI33在局部应用时不会引起刺激，可用作局部制剂中的安全成分。
实施例6
本实施例测试长双歧杆菌婴儿亚种BI33及其溶胞产物对自由基的清除效果：
DPPH清除活性测定：将不同浓度BI33菌悬液或其溶胞产物添加到1mL DPPH(60μM)溶液中。将细胞在室温下无光孵育30min，于517nm波长下测量吸光度。
ABTS清除活性测定：根据总抗氧化能力测定试剂盒(Beyotime，中国北京)。ABTS工作液与不同浓度的BI33或其溶胞产物混合，室温培养2-6min。734nm处测量吸光度。
羟基自由基清除活性测定：羟基自由基生成系统基于Fe2++H2O2的反应。反应混合物为：0.5mL 9mmol/L硫酸亚铁溶液、0.5mL 0.3％H2O2、0.5mL 9mmol/L水杨酸-乙醇和6mL各种浓度BI33菌悬液或其溶胞产物。将混合物在37℃下保持15min，并在510nm处测量混合物的吸光度。
超氧自由基清除活性测定：在碱性条件下被氧化产生超氧自由基(O2-)和有色中间体。将2.8mL 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)与0.1mL BI33菌悬液或其溶胞产物在10mL试管中混合，并在37℃的水浴中保温20min立即加入体积为0.1mL的3mmol/L儿茶酚(预热至37℃)。在325nm处测量吸光度。
结果如图3，测试了不同浓度(0.1％、0.5％、1％、5％、10％和30％)的长双歧杆菌婴儿亚种BI33菌悬液、BI33溶胞产物对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基以及超氧自由基的清除活性，结果显示BI33对体内各种氧化代谢产物具有不同程度的清除作用，浓度为5％-30％的BI33或其发酵溶胞产物均可清除60％的羟基自由基和ABTS自由基，另外，相比于BI33菌悬液，BI33溶胞产物具有更强的超氧自由基的清除能力，总的来说，BI33的使用一定程度上能够减少机体因过多自由基存在而造成的身体细胞和组织器官的损伤，从而延缓机体衰老。
实施例7
本实施例测试长双歧杆菌婴儿亚种BI33及其溶胞产物提高细胞抗氧化能力的效果：
确保了BI33对HaCaT细胞无细胞毒性后开展了相关抗氧化能力测试。测试了胞内过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平，具体为：将HaCaT细胞以3×105个细胞/孔接种在96孔板中，并在37℃下培养24h。0.003％ H2O2预处理6h后，加入2％的BI33菌悬液或BI33溶胞产物，培养18h。对于MDA、CAT、SOD和GSH-Px测定，根据对应试剂盒说明(Beyotime，北京)进行试验。在相应的波长下测量每组OD值。对于ROS测定，将1mL活性氧荧光探针DCFH-DA用无血清培养基以1:1000体积比稀释添加到细胞培养物中。细胞在37℃下孵育20min。用无血清细胞培养基洗涤细胞3次以完全去除未进入细胞的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测细胞内ROS含量。
另设对照组(未经任何处理的HaCaT细胞)，H2O2组(0.003％ H2O2预处理后不用BI33菌悬液或BI33溶胞产物进行干预)，各组细胞培养方法及相关检测方法均统一。
结果如图4所示，HaCaT细胞经0.003％ H2O2处理后，CAT、SOD以及GSH-Px的活性降低，细胞内ROS和MDA水平升高，说明成功建立了氧化损伤模型。经BI33菌悬液或其溶胞产物干预后，HaCaT细胞的CAT、SOD和GSH-Px活性均呈现增加趋势，另外，BI33菌悬液及其溶胞产物也显著抑制了H2O2诱导的ROS和MDA的产生。此结果说明，BI33可以通过清除响应H2O2暴露产生的ROS和MDA来保护HaCaT细胞，从而提高细胞的抗氧化能力。
实施例8
本实施例测试BI33对特应性皮炎小鼠症状的改善效果：
8周龄雄性BALB/c小鼠(平均体重20±2g)购自上海斯莱克实验动物中心。动物实验严格遵循国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》。所有动物均安置在特定的无病原体屏障条件下，于独立笼子适应性喂养一周(12:12小时光照/黑暗循环)后，对所有小鼠背部皮肤组织进行除毛处理。实验前1天使用电动剃毛器剃除小鼠背部2cm×3cm区域毛发，此后，第3天剃毛1次，直至实验结束。小鼠食用标准饲料且正常饮水进食。使用DNCB(Sigma-Aldrich，USA)诱导特应性皮炎样病变。将丙酮和橄榄油按3:1体积比配制成基质溶液，以基质溶液为溶剂配制1％、0.5％DNCB溶液。小鼠随机分为6组，每组10只：
阴性对照组(CTL组)：小鼠背部涂抹200μL丙酮和橄榄油(体积比为3:1)每周2次，连续6周；
DNCB组(MC组)：小鼠于第1周第1、3天均涂抹1％ DNCB 200μL，第2周起涂抹0.5％DNCB 200μL，每周2次，连续5周；
BI33组：在DNCB组处理的基础上，每日涂抹1次含BI33的益生菌乳液200μL，连续6周；
BL21组：在DNCB组处理的基础上，每日涂抹1次含BL21的益生菌乳液200μL，连续6周；
BI33+BL21组(比例2:1)：在DNCB组处理的基础上，每日涂抹1次含BI33+BL21的益生菌乳液200μL，连续6周；
BI33+ATCC 15707组(比例2:1)：在DNCB组处理的基础上，每日涂抹1次含BI33+ATCC 15707的益生菌乳液200μL，连续6周；
益生菌乳液制备方法：称好椰子油20mL，纯净水100mL，乳化剂(甘油)2mL，益生菌溶胞产物3mg(单菌组直接称取该菌溶胞产物，复合菌组按2:1的质量比称取BI33溶胞产物2份+BL21溶胞产物/ATCC 15707溶胞产物1份)，搅拌混匀(约2分钟)即成，备用。
末次给药24h后参考临床特应性皮炎积分SCORAD指数评价标准评估DNCB诱导AD小鼠背部皮肤皮炎的严重程度，评价标准为：(1)重度的红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落为3分；(2)中度的红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落为2分；(3)轻度的红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落为1分；(4)正常皮肤为0分。
皮肤屏障功能检测：末次给药24h后采用多功能皮肤测试仪测定皮肤屏障功能。将Tewameter探头放置在小鼠右侧第1腰椎横突对应的背部皮肤上30s测定经表皮水分丢失量TEWL。Cornemeter探头放置在小鼠背部皮肤上30s测定角质层含水量SCH。
皮肤菌群分析：实验结束时(第42天)处死小鼠，切取背部皮肤行组织病理学检查。通过Illumina Miseq PE300型高通量测序仪检测小鼠背部皮肤菌群16S rRNA基因V3-V4区，使用Usearch11合并获得的配对末端读数并保留长度≥400pb的读数进行以下分析。将所有质量过滤序列映射到无嵌合体的ASV，并使用具有默认设置的USEARCH11创建ASV丰度表。基于ASVs丰度表，用Usearch计算Chao1和Shannon香农多样性的指数(α多样性)通过单因素方差分析(ANOVA)确定干预效应，分析皮肤菌群丰度变化。
试验结果见表2：
表2
表2结果显示：与阴性对照组相比，DNCB组小鼠背部皮损组织出现了较严重的红斑、水肿、鳞屑、表皮脱落现象，同时伴随着皮肤屏障功能受损，该模型组小鼠背部皮肤的经表皮水分丢失水平TEWL升高，角质层含水量SCH下降。而在益生菌BI33干预后，疾病小鼠的皮损评分、TEWL和SCH指标有所改善，效果好于BL21等其他长双歧杆菌。可能是益生菌参与了肠道-皮肤轴调控，在其作用下，病理小鼠特应性皮炎症状得到了缓解，从而维持皮肤内外稳态。
由图5可知，与CLT组(阴性对照)相比，MC组(皮炎模型)小鼠背部皮肤菌群α多样性显著下降，其中，微生物丰富度下降(以Chao1指数表示)，以及微生物多样性下降(以Shannon指数表示)。BI33组与MC组对比显示，BI33干预增加了背部皮肤菌群α多样性。
此外，BL21虽效果不如BI33，但二者复配后，在等量的情况下，复配的效果竟好于BI33单菌，可能是两种菌株相互作用，在参与肠道-皮肤轴调控过程中相互促进，因此在提升皮肤菌群多样性、缓解特应性皮炎症状、维持皮肤内外稳态方面产生了协同增效的作用。而用其他的菌株则无法实现此效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种参与肠道皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种，其特征在于，所述长双歧杆菌婴儿亚种的具体名称为长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)BI33，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24474，保藏日期为2022年03月07日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种的培养物，其特征在于，所述培养物由包括如下步骤的方法制得：将长双歧杆菌婴儿亚种BI33接种于培养基中于30-45℃下培养，即得培养物。
3.一种如权利要求1所述的参与肠道-皮肤轴调控并改善皮肤健康状态的长双歧杆菌婴儿亚种的发酵溶胞产物，其特征在于，所述发酵溶胞产物由包括如下步骤的方法制得：将长双歧杆菌婴儿亚种BI33接种于培养基中于30-45℃下培养，得到发酵液，升温至65-75℃后保温15-30min，后在25-35℃下与溶菌酶混合12-20h，得混合液，过滤，收集上清，即得发酵溶胞产物。
4.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中包括如权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21，所述长双歧杆菌BL21的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10452，保藏日期为2015年01月27日。
5.如权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中包括长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物和长双歧杆菌BL21的发酵溶胞产物。
6.如权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物与长双歧杆菌BL21的发酵溶胞产物的质量比为(1-3):(0.5-1.5)。
7.如权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如权利要求3所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如权利要求4-6中任一项所述的复合菌剂在制备治疗皮炎的药物中的应用。
8.如权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如权利要求3所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如权利要求4-6中任一项所述的复合菌剂在制备具有抗氧化功效的药物或化妆品中的应用。
9.如权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如权利要求3所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如权利要求4-6中任一项所述的复合菌剂在制备提高皮肤菌群多样性的药物中的应用。
10.一种提高皮肤菌群多样性的方法，其特征在于，所述方法为非疾病治疗方法，所述方法包括向目标对象施加如权利要求1所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33、如权利要求2所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的培养物、如权利要求3所述的长双歧杆菌婴儿亚种BI33的发酵溶胞产物或如权利要求4-6中任一项所述的复合菌剂。
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