CN114711429A - 一株具有增强骨健康作用的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种用于预防治疗骨质疏松症的罗伊氏乳杆菌及其应用。其中所使用的罗伊氏乳杆菌具有增强骨密度、预防骨质疏松症的功能。所述的罗伊氏乳杆菌VHPribo E18(Lactobacillus reuteri VHPribo E18)，已于2021年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021153。本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18株可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18具有增强骨健康，预防骨质疏松症作用。单独使用该菌株且无需与益生元和/或其它益生菌复配即可对骨质疏松等与年龄相关的衰老问题起到改善功效，具有重要的应用价值。

Description

一株具有增强骨健康作用的罗伊氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有增强骨健康作用 的罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
随着人口老龄化问题日趋严重，骨质疏松症、骨流失等骨骼疾病已经成为威 胁人类健康的重大公共健康问题。根据世界卫生组织统计数据显示，在50岁以 上的人群中，50％的女性以及25％的男性患有骨质疏松。骨质疏松发病初期没有 明显症状，随着病情的发展，患者感觉到乏力，腰背容易酸疼。当出现跌倒等意 外情况时，患者容易发生骨折。严重的骨质疏松还可导致身体出现驼背等变形情 况。尽管有很多药物能够预防骨流失缓解骨质疏松症，但是长期使用会有严重副 作用，例如二磷酸盐药物能够引起关节和肌肉的疼痛。因此，寻找一种能够有效 预防和/或治疗骨质疏松症的干预措施意义重大。
越来越多的证据表明，益生菌对于人体的健康影响不仅局限于肠道，还有更 广泛的作用范围，如内分泌调节、免疫调节、神经系统调节、呼吸系统调节等。 因此，通过服用益生菌来延缓衰老，预防和/或治疗骨质疏松症，提高骨骼健康 状况成为一种新的治疗思路。
近年来关于益生菌增强骨健康作用的研究和报道有所出现，例如授权号为CN108379297B的中国发明专利公开了一种Akk菌，该菌或其外膜囊泡能制备成 防治骨质疏松症的药物；公开号为CN111109607A的中国发明专利公开了一种用 于预防和治疗骨质疏松症的健康食品，由益生元和益生菌复配制成。目前公开的 益生菌或者是纯厌氧菌，工业生产成本高，或是复配菌株作用机制不明确。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有增强骨健康作用的罗伊氏乳杆菌及其应用。其 中所使用的罗伊氏乳杆菌具有增强骨密度、预防骨质疏松症的功能。
本发明首先提供罗伊氏乳杆菌VHPribo E18(Lactobacillus reuteri VHPriboE18)的一种新用途，是在制备用于预防和治疗骨质疏松症的制品中的应用。
所述的罗伊氏乳杆菌VHPribo E18(Lactobacillus reuteri VHPribo E18)，已于2021年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址：中国武汉，其保藏 号为CCTCCNO：M2021153。
所述的罗伊氏乳杆菌VHPribo E18，其Riboprinter指纹图谱如图2所示； RAPD指纹图谱如图3所示，rep-PCR指纹图谱如图4所示。
所述的罗伊氏乳杆菌VHPribo E18，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。
所述的制品，优选为功能性食品。
本发明还保护具有预防和/或治疗骨质疏松症功效的功能性食品，所述的功 能性食品中包含有上述的罗伊氏乳杆菌VHPribo E18株。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18对人工肠胃液具有很强的耐受性， 在人工肠胃液中的能进行萌发；该菌株对红霉素和氨苄西林等常见的抗生素敏感， 不产生溶血素，不能够溶解血细胞，具有良好的生物安全性。该菌株抗氧化能力 较强，菌体抗脂质过氧化抑制率菌体为6.76％、上清液为9.93％、胞内提取物为 10.68％；DPPH清除率达到32.8％，HRS清除率达到4.32％。该菌株还能降解胆 固醇，降解率达到16.24％；另外，该菌株细胞表面疏水性为61.7％，黏附能力 为4.7。
在预防骨质疏松症功效研究中，罗伊氏乳杆菌VHProbi E18能降低小鼠血清TNF-α、INF-γ和IL-1β炎症因子水平，尿液中钙、磷水平降低骨流失现象减少。 益生菌组小鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th指标相较于对照组上升，Tb.Sp和 SMI指标下降，结果表明罗伊氏乳杆菌VHProbi E18能减少骨流失，增强骨密度， 改善骨健康水平，起到预防因衰老而造成的骨质疏松症等现象。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18符合法规要求，可以作为一种食品 原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。本发明提供的罗伊氏乳杆 菌VHProbiE18具有增强骨健康，预防骨质疏松症作用。单独使用该菌株且无 需与益生元和/或其它益生菌复配即可对骨质疏松等与年龄相关的衰老问题起到 改善功效，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为E18菌株API 50CHL碳源代谢图谱；
图2为E18菌株Riboprinter指纹图谱；
图3为E18菌株的RAPD指纹图谱；
图4为E18菌株的rep-PCR指纹图谱；
图5为各组别小鼠皮毛感官评分结果；
图6为各组别小鼠皮肤含水量测定结果；
图7为各组别小鼠皮肤MDA含量测定结果。
图8为各组别小鼠皮肤羟脯氨酸含量测定结果。
图9为各组别小鼠皮肤HE染色结果图，其中(A)3月龄对照组；(B)12月 龄对照组；(C)12月龄涂抹组；(D)12月龄灌胃组；
图10为各组别小鼠皮肤毛囊数量、表皮厚度、真皮厚度和胶原纤维含量测 定结果图，其中(A)3月龄对照组；(B)12月龄对照组；(C)12月龄涂抹组；(D) 12月龄灌胃组；*指与3月龄对照组，p<0.05；**指与12月龄对照组，p<0.05；
图11为各组别小鼠尿中钙含量测定结果图，其中*指与正常组相比，P<0.05， **指与对照组相比，P<0.05；
图12为各组别小鼠尿中磷含量测定结果图，其中*指与正常组相比，P<0.05， **指与对照组相比，P<0.05；
图13为各组别小鼠血清炎症因子含量测定结果图，其中*指与正常组相比， P<0.01，**指与对照组相比，P<0.05；
图14为股骨骨小梁Micro-CT扫描分析结果图，其中*指与正常组相比， P<0.01，**指与对照组相比，P<0.05，#指与对照组相比，P<0.01；
图15为股骨骨小梁Micro-CT扫描成像图。
具体实施方式
在之前的研究中，申请人筛选获得了罗伊氏乳杆菌VHProbi E18株，并发现 其具有抗衰老功效，且长期服用不会有副作用及过量的风险。而进一步的研究发 现罗伊氏乳杆菌VHProbi E18株还能够有效的预防和治疗与骨质疏松等年龄相 关的衰老问题；在此基础上建立了本发明。
本发明所使用的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18株保藏于武汉大学的中国典型 培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021153。
下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
实施例1罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的分离筛选及理化性质分析
按照生物样品取样的标准程序，获得了百岁老人的新鲜粪便样本，从中筛选 获得了本发明所使用的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18；筛选的流程包含有MRS琼 脂培养基上的单菌落初筛和耐酸性培养复筛；在20株乳酸杆菌发酵液中活菌量 的对数值中，E18菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达8.01Log CFU/mL。从而说明E18号菌株耐酸能力最高。
将E18菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见E18单 菌落呈乳白色，菌落直径在1.5-2mm左右，表面光滑，显微镜下末端呈圆形的 弯曲杆菌。盐度耐受性试验结果显示E18菌株最大耐受盐浓度为5％。过氧化氢 酶实验观察到E18菌株不产生气泡，是阴性反应。
利用API 50CHL试剂条对E18菌株进行碳源代谢实验，结果表明E18菌株 的％ID＝93且T值＝0.74，API结果为发酵乳杆菌，鉴定评语为好的鉴定(目前 API可鉴定种属中没有罗伊氏乳杆菌，故鉴定结果为发酵乳杆菌)。E18菌株API 50CHL碳源代谢结果如图1所示。
通过测序获得E18菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI 数据库中进行比对，确定E18菌株为罗伊氏乳杆菌；其Riboprinter指纹图谱结 果见图2，RAPD指纹图谱如图3所示，rep-PCR指纹图谱如图4所示。
将E18菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站 http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.htmL，同时结合文献De Clerck E， etal.Systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。 综合分子生物学的鉴定结果，确定E18菌株为一株新的罗伊氏乳杆菌，将其命 名为罗伊氏乳杆菌VHProbi E18。
对罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的其它理化性质检测如下：
1、对罗伊氏乳杆菌VHProbi E18对人工胃液和人工肠液的耐受性试验，
活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测 定菌量，该菌株经过人工肠液消化后的活菌量(Log CFU/mL)见表1。
表1.人工胃肠液消化后的活菌量
Figure BDA0003105795520000061
从表1可知，本发明使用的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18经人工胃液和人工肠 液消化后，活菌量上升。从而说明该菌株能够耐受人工胃液和人工肠液，而且还 可以进行一定的萌发。
2、罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的溶血性及抗生素耐受性实验
1)溶血性实验
称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养 基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。将测试菌株 划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观察测试菌是否有 溶血现象。
结果显示：罗伊氏乳杆菌VHProbi E18不能生长，血细胞平板没有变化，说 明罗伊氏乳杆菌VHProbi E18不产生溶血素，不能够溶解血细胞。
2)抗生素耐受性实验
微量肉汤稀释法测定抗生素对罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的最小抑菌浓度 MIC值具体结果见表2。
表2.罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的抗生素MIC值
Figure BDA0003105795520000062
MIC单位μg/mL
从表2的结果可以看出，本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18对红霉素 和氨苄西林等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
3、罗伊氏乳杆菌VHProbi E18抗氧化功能测定
1)菌株清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)和羟基自由基(HRS)能 力测定
取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基 溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长 517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和 DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按 下列公式计算：清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。结果见表3。
表3.DPPH自由基清除率表
Figure BDA0003105795520000071
2)菌株清除HRS能力的测定
将100μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离 子水和200μL乳酸菌PBS菌悬液混匀后加入100μL过氧化氢溶液(3mM)，37℃ 水浴15min后在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式 进行计算。
清除率％＝(A样品-A控制)/(A空白-A控制)×100％，其中A控制为去离子水替代 样品，A空白为去离子水替代样品和H2O2，结果见表4。
表4.HRS自由基清除率表
Figure BDA0003105795520000081
3)菌株抗脂质过氧化实验鉴定
亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。
0.5mL的PBS溶液(pH 7.4)中加入1mL亚油酸的乳化液，1mLFeSO4 (1％)，再加入0.5mL样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2mL TCA(4％)， 2mL TBA(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min， 收集上清液在532nm下测吸光度即为A；对照组以0.5mL蒸馏水代替样品即为 A0。抑制率/％＝(A0－A)/A0×100％
注：A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度，结果见表5。
表5.抗脂质过氧化抑制率表
Figure BDA0003105795520000082
3、罗伊氏乳杆菌VHProbi E18体外胆固醇降解实验
本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18对胆固醇的降解率达到16.24％(此 为不含胆盐的数据)。
4、罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的疏水性细胞表面测试
本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18细胞表面疏水性为61.76％，标准 差为0.27％。
5、罗伊氏乳杆菌VHProbi E18的细胞粘附性测试
Caco-2细胞，进行复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量。加入 胰酶后将细胞放回培养箱，肉眼观察到细胞完全脱落后使其尽量成为单细胞状态。 使用血球计数板进行细胞计数，使用PBS适量稀释细胞悬液。使用MRS培养基 将菌体重悬备用。将待测菌悬液与Caco-2细胞共同孵育2h后再用PBS洗去未 黏附的细菌。加入胰酶消化后再加入细胞培养液终止消化，收集液体涂布计数。 粘附能力(CFU/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。 经检测，罗伊氏乳杆菌VHProbi E18黏附能力为4.7。
实施例2、罗伊氏乳杆菌VHProbi E18在改善衰老小鼠皮肤中的应用 2.1实验设计
对C57小鼠SPF级进行试验，小鼠适应性饲养7天后随机分为3月龄对照 组、12月龄对照组组、12月龄涂抹组、12月龄灌胃组，每组6只小鼠。12月龄 灌胃组按照0.2mL/10g灌胃给予益生菌菌液，12月龄涂抹组涂抹与灌胃组等量 的益生菌液，3月龄对照组和12月龄对照组灌胃与益生菌等量的生理盐水。共 持续70天。
终末时，对小鼠背部皮毛感官评分，评分规则如表6所示。检测小鼠皮肤含 水量、SOD活性和MDA含量变化，检测小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量。
表6.小鼠背部皮毛感官评分量表
Figure BDA0003105795520000091
Figure BDA0003105795520000101
试验结束后取背部皮肤组织，4％多聚甲醛固定，取材，脱水，石蜡包埋， 切片，HE染色，检测毛囊数量、真皮厚度和皮脂腺细胞。
所有实验数据以均数±标准差表示，用Microsoft EXCEL进行数据统计和作 图，两组数据间比较采用t检验，以P<0.05判定为有显著性差异。
2.2实验结果
2.2.1小鼠背部皮毛感官评定
终末期时，3月龄小鼠毛发浓密，光泽整齐；12月龄对照组小鼠毛发干枯， 脱毛较多并且有花白毛发；12月龄涂抹组小鼠毛发有光泽，无白色毛发；12月 龄灌胃组小鼠毛发浓密有光泽，且呈现黑色。各组小鼠背部皮毛感官评分比较结 果如图5所示。
2.2.2小鼠皮肤含水量、MDA和羟脯氨酸含量变化
12月龄各组别在终末约14～15月龄相对比3月龄对照组终末约5～6月龄， 皮肤含水量均显著降低(p<0.05)，下降率约为15.95％；12月龄灌胃组相比12 月龄对照组皮肤含水率上升，且具有显著性差异(p<0.05)。各组小鼠皮肤含水 率比较如图6所示。
与12月龄对照组相比，12月龄灌胃组皮肤MDA含量显著降低，且具有 显著性差异(p<0.05)，12月龄涂抹组皮肤MDA含量显著降低，也具有显著性 差异(p<0.05)，12月龄涂抹组与12月龄灌胃组终末状态皮肤MDA含量相比 差异不具有显著性(p>0.05)。各组小鼠皮肤MDA含量比较如图7所示。
与12月龄对照组相比，12月龄灌胃组和涂抹组皮肤和尾腱中的羟脯氨酸 含量升高，且具有显著性差异(p<0.05)，12月龄涂抹组与12月龄灌胃组终末 状态皮肤羟脯氨酸含量相比差异不具有显著性(p>0.05)。各组小鼠皮肤和尾腱 中羟脯氨酸含量比较如图8所示。
2.2.3小鼠背部皮肤组织学检查
光学显微镜下可见，3月龄对照组小鼠表皮结构完整，细胞分层清晰，具有 明显的表皮突和真皮乳头，视野内未见炎性细胞浸润，可见皮脂腺增生，视野内 可见真皮层胶原纤维，排列分布均匀成带状；12月龄对照组小鼠表皮变薄明显， 角质层脱落可见，结构完整度欠缺，细胞数量减少，排列不规则，胶原纤维层明 显减少，纤维断裂、分布不均匀、稀疏，成纤维细胞减少；12月龄灌胃组小鼠 上皮细胞增生，排列偶有疏松紊乱，毛囊皮脂腺时有增生，炎性细胞偶有出现， 胶原纤维分布松散，断裂可见；12月龄涂抹组上皮细胞增生明显，角质层脱落 可见，毛囊和皮脂腺增生明显，炎性细胞可见，皮肤松散可见，胶原纤维层排列 分布松散，断裂现象明显。小鼠皮肤典型HE切片结果如图9。
终末时，与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤毛囊密度下降，且 具有显著性差异(P<0.05)；与12月龄对照组小鼠相比，12月龄涂抹组和12月 龄灌胃组毛囊密度上升，且具有显著性差异(P<0.05)。
与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤表皮厚度有下降，但没有显 著性差异；12月龄各组小鼠肤表皮厚度没有差异。
与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤真皮厚度下降，且具有显著 性差异(P<0.05)；与12月龄对照组小鼠相比，12月龄涂抹组和12月龄灌胃组 皮肤真皮厚度上升，且具有显著性差异(P<0.05)。
与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤胶原纤维面积下降，且具有 显著性差异(P<0.05)；与12月龄对照组小鼠相比，12月龄涂抹组和12月龄灌 胃组皮肤胶原纤维面积上升，且具有显著性差异(P<0.05)。各组别小鼠皮肤衰 老程度对比结果如图10所示。
由上述结果可知，与12月龄对照组小鼠相比，12月龄灌胃组和12月龄涂 抹组小鼠皮毛光泽度均有改善，没有出现白毛，脱毛现象减少。12月龄灌胃组 和12月龄涂抹组小鼠皮肤含水率上升，MDA含量下降。羟脯氨酸作为真皮内含 量丰富稳定的氨基酸，其含量可以直接反映出真皮内胶原蛋白的含量变化，是检 测皮肤衰老的指标之一。12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠皮肤和尾腱中羟脯 氨酸含量上升，涂抹和灌胃罗伊氏乳杆菌VHProbi E18可以提高真皮内胶原蛋白 的含量。从小鼠皮肤组织学检查看，与12月龄对照组小鼠相比，12月龄灌胃组 和12月龄涂抹组小鼠表皮结构完整度改善，炎性细胞减少，成纤维细胞增多， 并且灌胃组效果好于涂抹组。此外，12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠皮肤毛 囊数量上升，真皮厚度增加，胶原纤维含量上升。结果表明罗伊氏乳杆菌VHProbi E18无论是灌胃还是涂抹均可以改善衰老小鼠皮肤指征达到延缓修复皮肤衰老 效果。
实施例3罗伊氏乳杆菌VHProbi E18在改善小鼠骨健康中的应用
3.1实验动物
C57小鼠SPF级，雌雄各半，14周龄小鼠18只，体重19～25g。
3.2实验方法
小鼠适应性饲养7天后随机分为对照组、空白组和益生菌组，每组6只小 鼠。益生菌组连续8周肌肉注射糖皮质激素，同期按照0.2mL/10g每天灌胃给 予益生菌菌液；对照组连续8周肌肉注射糖皮质激素，同期灌胃等量的MRS 液体培养基；空白组不建模，同期按照0.2mL/10g每天灌胃给予生理盐水。
试验结束后取小鼠左侧股骨标本，采用Micro-CT测量骨密度、骨小梁体积 分数、骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁分离度和SMI指数。终末时，测量小鼠 血清细胞因子TNF-α、IL-1β和INF-γ。终末时收集小鼠尿液测量其钙、磷含量。
所有实验数据以均数±标准差表示，用Microsoft EXCEL进行数据统计和 作图，两组数据间比较采用t检验，以P<0.05判定为有显著性差异。
3.3实验结果
3.3.1终末期小鼠尿液钙、磷含量测定
终末期时，对照组和益生菌组小鼠尿液中钙含量与正常组相比显著升高， 说明对照组和益生菌组小鼠机体内钙存在流失现象。其中，对照组与正常组相比 具有显著性差异(P<0.05)，说明建模成功。益生菌组与对照组相比，尿液中钙 含量下降，差异具有显著性(P<0.05)，测定结果如图11所示。
终末期时，对照组和益生菌组小鼠尿液中磷含量与正常组相比显著升高，说 明对照组和益生菌组小鼠机体内磷存在流失现象。其中，对照组与正常组相比具 有显著性差异(P<0.05)，说明建模成功。益生菌组与对照组相比，尿液中磷含 量下降，差异具有显著性(P<0.05)，测定结果如图12所示。
3.3.2终末期小鼠血清细胞因子测定
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠血清TNF-α含量升高，差异具有极 显著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组小鼠血清TNF-α含量降低，差异具 有显著性(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠血清INF-γ含量升高，差异具有极显 著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组小鼠血清INF-γ含量降低，差异具有 显著性(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠血清IL-1β含量升高，差异具有极显 著性(P<0.01)，与对照组相比，益生菌组小鼠血清IL-1β含量降低，差异不具 有显著性。各组别小鼠血清细胞因子检测结果如图13所示。
3.3.3终末期小鼠股骨Micro-CT扫描分析
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠骨体积分数BV/TV降低，差异具有 极显著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组BV/TV升高，差异具有显著性 (P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠骨小梁厚度Tb.Th降低，差异具有极 显著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组骨小梁厚度Tb.Th升高，差异具有 极显著性(P<0.01)；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠骨小梁分离度Tb.Sp上升，差异具有 极显著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组骨小梁分离度Tb.Sp下降，差异 没有显著性；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠骨小梁数量Tb.N降低，差异具有极 显著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组骨小梁数量Tb.N升高，差异没有显 著性；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠结构模型指数SMI升高，差异具有 极显著性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组结构模型指数SMI降低，差异具 有显著性(P<0.05)；
终末期时，与正常组相比，对照组小鼠骨密度BMD降低，差异具有极显著 性(P<0.01)。与对照组相比，益生菌组小鼠骨密度BMD升高，差异具有显著 性(P<0.05)；
各组别小鼠Micro-CT指标计算结果如图14所示。
各组别小鼠Micro-CT扫描结果显示，正常组小鼠股骨骨小梁结构完整，对 照组小鼠股骨骨小梁隐窝结构出现缺失，益生菌组小鼠股骨骨小梁结构完整度较 高，出现部分缺失，扫描结果如图15所示。
动物实验结果显示：罗伊氏乳杆菌VHProbi E18能使骨质疏松小鼠尿液中钙、 磷水平降低，骨流失现象减少。益生菌组小鼠血清中细胞因子TNF-α、INF-γ和 IL-1β水平下降，罗伊氏乳杆菌VHProbi E18能够调节免疫反应，降低骨质疏松 小鼠炎症水平。益生菌组小鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th指标相较于对照组 上升，Tb.Sp和SMI指标下降，结果表明罗伊氏乳杆菌VHProbi E18能预防缓解 骨流失现象，增强骨密度，改善骨健康水平，起到预防因衰老而造成的骨质疏松 症等现象。
综上所述，本发明提供的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18对模拟人工肠胃液具 有很强的耐受能力，这对于益生菌株顺利经过胃肠道在结肠处定植下来发挥益生 功能奠定了基础。抗生素抗性试验证实罗伊氏乳杆菌VHProbi E18对常见抗生素 敏感，不产溶血素，生物安全性良好。同时，罗伊氏乳杆菌VHProbi E18能够清 除DPPH和HRS自由基，抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化功能活性，能够 降解胆固醇，具有降低血清胆固醇的益生特性。经动物实验证实，罗伊氏乳杆菌 VHProbi E18能预防缓解骨流失现象，增强骨密度，改善骨健康水平，起到预防 因衰老而造成的骨质疏松症等现象。这说明罗伊氏乳杆菌VHProbi E18在提升与 衰老相关的骨健康上具有潜在的应用价值。
本发明的罗伊氏乳杆菌VHProbi E18用于制备预防治疗骨质疏松症的制品， 应用前景广阔。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一株具有增强骨健康作用的罗伊氏乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaggttagg ccaccgactt tgggcgttac aaactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccgact 120
tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg aactgagaac ggctttaaga gattagctta 180
ctctcgcgag tttgcgactc gttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240
aaggggcatg atgatctgac gtcgtcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca 300
ctagagtgcc caactcaatg ctggcaacta gtaacaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360
aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cgaccatgca ccacctgtca ttgcgtcccc 420
gaagggaacg ccttatctct aaggttagcg caagatgtca agacctggta aggttcttcg 480
cgtagcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540
agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctccggcact 600
gaagggcgga aaccctccaa cacctagcac tcatcgttta cggcatggac taccagggta 660
tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga gcctcagcgt cagttgcaga ccagacagcc 720
gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc tacgcattcc accgctacac atggagttcc 780
actgtcctct tctgcactca agtcgcccgg tttccgatgc acttcttcgg ttaagccgaa 840
ggctttcaca tcagacctaa gcaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggat 900
aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt gactttctgg 960
ttggataccg tcactgcgtg aacagttact ctcacgcacg ttcttctcca acaacagagc 1020
tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg cggtgttgct ccatcaggct tgcgcccatt 1080
gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtatgga ccgtgtctca gttccattgt 1140
ggccgatcag tctctcaact cggctatgca tcatcgcctt ggtaagccgt taccttacca 1200
actagctaat gcaccgcagg tccatcccag agtgatagcc aaagccatct ttcaaacaaa 1260
agccatgcgg cttttgttgt tatgcggtat tagcatctgt ttccaaatgt tatcccccgc 1320
tccggggcag gttacctacg tgttactcac ccgtccgcca ctcactggtg atccatcgtc 1380
aatcaggtgc aagcaccatc aatcagttgg gccagtgcgt acgactgc 1428

Claims (5)

1.保藏编号为CCTCC NO：M2021153的罗伊氏乳杆菌在制备预防和治疗骨质疏松症的制品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的罗伊氏乳杆菌的Riboprinter指纹图谱如图2所示；RAPD指纹图谱如图3所示，rep-PCR指纹图谱如图4所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的罗伊氏乳杆菌的16s rDNA序列为SEQID NO:1。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的制品为功能性食品。
5.一种具有预防和/或治疗骨质疏松症功效的功能性食品，其特征在于，所述的功能性食品中包含有保藏编号为CCTCC NO：M2021153的罗伊氏乳杆菌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116814503A (zh) * 2023-07-27 2023-09-29 山东奈思健康科技有限责任公司 一种促补钙护骨的后生元制品及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755091A (zh) * 2012-06-04 2015-07-01 生命大地女神有限公司 预防哺乳动物骨质疏松的乳酸杆菌的选择和应用
US20200101121A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Research Development Foundation Methods and probiotic compositions for the treatment of bone disorders

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104755091A (zh) * 2012-06-04 2015-07-01 生命大地女神有限公司 预防哺乳动物骨质疏松的乳酸杆菌的选择和应用
US20200101121A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Research Development Foundation Methods and probiotic compositions for the treatment of bone disorders

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116814503A (zh) * 2023-07-27 2023-09-29 山东奈思健康科技有限责任公司 一种促补钙护骨的后生元制品及其制备方法和应用
CN116814503B (zh) * 2023-07-27 2024-01-30 山东奈思健康科技有限责任公司 一种促补钙护骨的后生元制品及其制备方法和应用

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