CN116555070A - 一株双歧双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株双歧双歧杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)，该菌株被命名为LABOFMIC‑321，已于2022年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221461的双歧双歧杆菌。实验表明，LABOFMIC‑321具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高皮肤抗菌能力、美白、更新老化角质的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。

Description

一株双歧双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物的技术领域，具体地涉及一株双歧双歧杆菌及其应用。
背景技术
人体皮肤上栖息着各种细菌、真菌、病毒，还有螨虫等小型节肢动物，它们的集合形成皮肤微生物组或皮肤菌群。皮肤微生物组与皮肤表面的细胞、汗液、皮脂等物质，以及外界环境共同组成一个生态系统，对于维持宿主皮肤健康有重要作用。抗菌肽主要由黏膜表层上皮细胞分泌，在眼、皮肤、口腔粘膜、泌尿生殖系统及呼吸系统的细胞中均有表达。抗菌肽对大多数细菌、某些真菌和病毒都有直接作用。它常见的作用方式是通过其自身带有的正电荷与细菌细胞膜上带负电荷的成分(如脂多糖)相作用，从而增加细菌细胞膜的通透性，裂解细菌，造成细菌的死亡。这些常驻微生物可以直接或通过调控皮肤的角质形成细胞而间接分泌抗菌肽，以抵御外界病原菌定殖；还可分解角质细胞碎屑或脂质，辅助乳化皮脂膜，维持表皮酸性环境，以抵御外界病原菌定殖。
皮肤微生物组在皮肤表面合成具有活性的代谢产物，如短链脂肪酸、B族维生素等，调节皮肤生理功能。越来越多的研究表明，皮肤微生态失衡(又称菌群失衡)会导致一系列皮肤疾病，如特应性皮炎、痤疮、脂溢性皮炎、银屑病、机会性感染等。
当有益菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。二裂酵母发酵产物滤液和二裂酵母发酵溶胞产物目前已经录入《已使用化妆品原料名称目录》2021版，其菌属为双歧杆菌属(Bifidobacterium)，是一种革兰氏阳性厌氧细菌。提供一种利用二裂酵母发酵产物技术开发的皮肤益生菌相关产品，具有巨大的商业应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供了一株双歧双歧杆菌及其应用。
本发明的其一目的是提供了双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)，该菌株被命名为LABOFMIC-321，已于2022年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221461的双歧双歧杆菌。
较佳地，采样于健康女婴粪便中，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BBL固体平板，37℃厌氧培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-321；
显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成乳白色、表面光滑、半透明、圆形小菌落，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
本发明的另一目的是提供了上述双歧双歧杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高皮肤抗菌能力、美白、更新老化角质中的至少一种。
一些实施方案中，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞和/或成纤维细胞的增殖。
其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，对双歧双歧杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，双歧双歧杆菌可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为20.31％～23.33％。
其中，本发明以HFF成纤维为受试对象，对双歧双歧杆菌的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，双歧双歧杆菌可促进HFF细胞增殖，促进增殖率为28.57％～33.99％。
一些实施方案中，所述修护皮肤屏障包括修复SDS诱导的细胞损伤和/或上调屏障修护相关基因的表达；所述屏障修护相关基因包括FLG。
其中，本发明以HaCaT细胞为受试对象，对双歧双歧杆菌的SDS损伤修复能力进行了研究。结果表明，双歧双歧杆菌可修复SDS引起的细胞损伤，提高细胞增殖率，并上调非损伤细胞的屏障修护相关基因的表达。
一些实施方案中，所述保湿包括上调保湿相关基因AQP3的表达。
其中，本发明以HaCaT细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌的对皮肤的保湿效果。结果显示，双歧双歧杆菌可上调保湿相关基因AQP3的表达，促进皮肤细胞保湿。
一些实施方案中，所述抗衰老包括下列所示表达中的至少一种：
a).所述抗衰老包括上调细胞外基质合成相关基因的表达，所述细胞外基质合成相关基因包括TIMP1、LN中的至少一种；
b).所述抗衰老包括下调细胞外基质降解相关基因的表达，所述细胞外基质降解相关基因包括MMP家族基因MMP1、MMP10中的至少一种；
c).所述抗衰老包括上调细胞抗氧化相关基因SIRT-1的表达；
d).所述抗衰老包括上调细胞生长因子相关基因HGF、FGF21的表达；
e).所述抗衰老包括下调细胞凋亡相关基因的表达，所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族Caspase3、Caspase9中的至少一种。
需要说明的是，为了探究所述的双歧双歧杆菌的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞生长因子及细胞凋亡中的至少一个。
其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对HaCaT角质细胞细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可上调细胞外基质合成相关基因TIMP1的表达，促进细胞外基质的合成；下调降解细胞外基质相关基因MMP1的表达，抑制细胞外基质的降解。
其中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对HFF成纤维细胞外基质合成相关基因和降解相关基因的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可上调细胞外基质合成相关基因LN的表达，促进细胞外基质的合成，下调降解细胞外基质相关基因MMP10的表达，抑制细胞外基质的降解。
其中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对HFF成纤维细胞抗氧化相关基因的表达的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可上调抗氧化相关基因SIRT-1的表达，增强细胞的抗氧化能力。
其中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对HFF成纤维细胞生长因子相关基因的表达的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可上调细胞生长因子相关基因HGF、FGF21的表达，促进细胞生长。
其中，本发明以HFF细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对HFF细胞凋亡的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调细胞凋亡相关基因BAX和/或Caspase-3、Caspase-9的表达，抑制细胞凋亡。
一些实施方案中，所述提高皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2、LL-37中的至少一种。
其中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对HaCaT角质细胞抗菌肽相关基因的表达的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2、LL-37的表达，增强皮肤抗菌能力。
一些实施方案中，所述美白包括下列所示表达中的至少一种：
a).所述美白包括下调黑色素合成相关基因TRP-2、GSK3β的表达；
b).所述美白包括下调褐黑素生成相关基因ASIP的表达；
c).所述美白包括下调黑色素分泌相关基因EDN、MC1R的表达；
d).所述美白包括下调黑色素转运相关基因SLAC2A的表达；
e).所述美白包括下调黑色素小体成熟相关基因MATP的表达；
f).所述美白包括下调黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达；
g).所述美白包括抑制酪氨酸酶活性的作用。
需要说明的是，为了探究双歧双歧杆菌的美白效果，本发明对黑色素及褐黑素相关的指标进行了测定，所述的指标包括黑色素合成、褐黑素生成、黑色素分泌、黑色素转运、黑色素小体成熟、黑色素细胞迁移及抑制酪氨酸酶活性中的至少一个。
其中，本发明以A875人黑色素瘤细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对A875细胞黑色素合成相关基因的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调黑色素合成相关基因TRP-2、GSK3β的表达，减少黑色素的合成。
其中，本发明以A875人黑色素瘤细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对A875细胞褐黑素生成相关基因表达的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调褐黑素生成相关基因ASIP的表达，减少褐黑素的生成。
其中，本发明以A875人黑色素瘤细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对A875细胞黑色素分泌的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调黑色素分泌基因EDN、MC1R的表达，减少细胞黑色素的分泌。
其中，本发明以A875人黑色素瘤细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对A875细胞黑色素转运的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调黑色素转运基因SLAC2A的表达，减少细胞黑色素的转运。
其中，本发明以A875人黑色素瘤细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对A875细胞黑色素小体成熟相关基因表达的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调黑色素小体成熟相关基因MATP的表达，减少细胞黑色素小体的成熟。
其中，本发明以A875人黑色素瘤细胞为受试对象，研究双歧双歧杆菌对A875细胞迁移相关基因的表达的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可下调迁移相关基因E-cadherin的表达，减少黑色素细胞的迁移。
其中，本发明以酪氨酸酶为受试对象，研究双歧双歧杆菌对酪氨酸酶的影响。结果表明，双歧双歧杆菌可抑制酪氨酸酶活性作用，减少黑色素的合成。
一些实施方案中，所述更新老化角质包括上调桥粒蛋白降解相关基因KLK5、调节角质细胞分化相关基因CDSN的表达。
其中，本发明以HaCaT细胞为受试对象，对双歧双歧杆菌更新老化角质的效果进行了研究；结果表明，双歧双歧杆菌可上调UBV光老化HaCaT细胞的桥粒蛋白降解相关基因KLK5的表达；上调调节角质细胞分化相关基因CDSN的表达，双歧双歧杆菌可促进老化角质细胞间的桥粒蛋白降解使老化角质细胞脱落，同时调节角质细胞分化更新角质细胞。
本发明的另一目的是提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述双歧双歧杆菌原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的双歧双歧杆菌包括如下所示的至少一种：
(1)双歧双歧杆菌的菌群和/或菌剂；
(2)双歧双歧杆菌的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
进一步的，所述产品还包括含有上述双歧双歧杆菌的菌群。
进一步的，所述产品包括含有上述双歧双歧杆菌及其溶胞物、提取物、代谢产物制成的菌剂，或者含有上述双歧双歧杆菌的菌群制成的菌剂。
进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种。
本发明的另一目的是提供了一种改善肌肤状态的方法，其包括使用本发明所述从产品。所述使用的方法包括涂抹、外敷、熏蒸或注射。
本发明公开的双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)LABOFMIC-321，其保藏编号为CCTCC No:M 20221461的双歧双歧杆菌。实验表明，本发明提供的双歧双歧杆菌具有促进细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高皮肤抗菌能力的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
生物保藏说明
双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)LABOFMIC-321，于2022年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为CCTCC No:M 20221461。
具体实施方式
本发明提供了双歧双歧杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的双歧双歧杆菌菌株LABOFMIC-321，来源于1岁健康女婴粪便，经16S rDNA鉴定为双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成表面光滑半透明的圆形菌落，乳白色，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)LABOFMIC-321，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月20日，保藏编号为CCTCC NO:M 20221461。
本发明提供的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321在本发明所述应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为发酵溶胞产物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为发酵滤液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵滤液和发酵溶胞产物。
本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1LABOFMIC-321的分离
采样于于1岁健康女婴粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BBL固体平板，37℃厌氧培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-321。
革兰氏染色镜检：菌株LABOFMIC-321为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成乳白色、表面光滑、半透明、圆形小菌落，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
实施例2LABOFMIC-321的核酸鉴定
1、16S rDNA基因序列分析：
挑取单菌落置BBL液体培养基中，37℃厌氧培养过夜后，12000r/min转速离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F、1492R、PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃、15s，57℃、15s，72℃、40s，35个循环；72℃延伸10min。
2、结果
PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较(BLASTN)后得出LABOFMIC-321菌株为双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。
实施例3LABOFMIC-321促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验
1、LABOFMIC-321发酵滤液制备：
挑取双歧双歧杆菌LABOFMIC-321单菌落于BBL液体培养基，37℃厌氧培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD600＝0.2、121℃、30min、0.28Mpa灭活，12000r/min转速离心2min，经0.22μm滤膜过滤为发酵滤液。
2、促进HaCaT细胞修复实验
接种HaCaT细胞(5×104cells/孔)至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/mlSDS，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔添加5％(V/V)发酵产物，(对照组分别以等体积PBS替代)培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。
细胞增殖率计算公式及结果如下表：
上表结果可知，LABOFMIC-321发酵滤液可促进可修复SDS引起的HaCaT角质细胞损伤，提高细胞增殖率，促进增殖率为20.31％～23.33％。
实施例4LABOFMIC-321促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
1、LABOFMIC-321发酵溶胞产物的制备：
挑取双歧双歧杆菌LABOFMIC-321单菌落于BBL液体培养基，37℃厌氧培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整至OD600＝0.2，再以12000r/min转速离心2min，移除上清液后其离心沉淀菌体以PBS清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以PBS重悬至离心时体积，再以超声波破碎20分钟，121℃、30min、0.28Mpa灭活，即得发酵溶胞产物。
2、促进HaCaT屏障修护相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入5％(V/V)发酵产物，10％(V/V)溶胞物(对照组分别以等体积PBS替代发酵溶胞产物)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测FLG基因的表达。分别以添加等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
公式：F＝2-ΔΔCT，其中：
△CT实验＝CT实验-CT内参(实验)；
△CT对照＝CT对照-CT内参(对照)；
△△CT＝△CT实验-△CT对照。
发酵溶胞产物上调修复相关基因FLG的表达。结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321发酵溶胞产物具有上调皮肤屏障修护相关因子丝聚合蛋白基因FLG表达的作用，基因表达量上调1.17～1.28倍。表明LABOFMIC-321具有促进皮肤屏障修护的作用。
实施例5LABOFMIC-321上调HaCaT保湿相关基因表达实验
1、LABOFMIC-321发酵滤液和发酵溶胞产物的制备：
制备方法参照实施例3和4。
2、上调HaCaT保湿相关基因表达实验
接种人永生化角质形成细胞HaCaT(2ml/孔，内含5×105细胞)至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。加入10％(V/V)溶胞物(对照组以等体积PBS替代)，培养24h后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测GBA基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵滤液上调保湿相关基因AQP3。结果见下表：
发酵溶胞产物上调保湿相关基因AQP3。结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有上调保湿相关的水通道蛋白3基因AQP3表达的作用，基因表达量上调1.11～1.56倍。表明LABOFMIC-321具有促进皮肤保湿的作用。
实施例6LABOFMIC-321调节光老化HaCaT细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因表达实验
1、LABOFMIC-321发酵滤液及发酵溶胞产物制备：
制备方法参照实施例3和4。
2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤
将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB照射损伤。
3、LABOFMIC-321添加
将5％(V/V)发酵产物、10％(V/V)溶胞物分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞产物)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/细胞自噬/抗氧化相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因TIMP1、MMP1的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵滤液上调细胞外基质相关基因TIMP1，下调降解细胞外基质相关基因MMP1。结果见下表：
发酵溶胞产物上调细胞外基质基因TIMP1。结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有上调HaCaT细胞外基质相关的组织金属蛋白酶抑制物1基因TIMP1，基因相对表达倍数1.19～1.47倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1的作用，基因相对表达倍数0.76～0.84。
实施例7LABOFMIC-321促进人成纤维细胞HFF的增殖
1、LABOFMIC-321发酵滤液及发酵溶胞产物的制备：
制备方法参照实施例3和4。
2、HFF细胞制备及LABOFMIC-321添加
接种以DMEM培养的HFF细胞，以100μl/孔(每孔含3×104细胞)转接至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制200μM H2O2，每孔加入100μl，5％二氧化碳培养箱37℃培养1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入100μl新培养基，分别添加发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞产物10％(V/V)，(对照组以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞产物)。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养4h，检测450nm处吸光度A。
计算公式及结果如下表。
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有促进人成纤维细胞HFF增殖的作用，增殖率28.57％～33.99％。
实施例8LABOFMIC-321调节氧化损伤HFF细胞外基质/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因表达实验
1、LABOFMIC-321发酵滤液及发酵溶胞产物制备：
制备方法参照实施例3和4。
2、HFF细胞制备及H2O2诱导氧化损伤
将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激，37℃静置1h。
3、LABOFMIC-321添加
将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞产物10％(V/V)分别加入刺激过的HFF细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞产物)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化/细胞凋亡/细胞生长因子相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞外基质相关基因LN，抗氧化相关基因SIRT-1，细胞生长因子相关基因HGF、FGF21，以及降解细胞外基质相关基因MMP家族和细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵滤液上调细胞外基质相关基因LN，细胞生长因子相关基因HGF、FGF21；细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX，结果见下表：
发酵溶胞产物上调细胞外基质相关基因LN，抗氧化相关SIRT-1，细胞生长因子相关基因FGF21；下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族和BAX。结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有上调HFF细胞外基质相关的层粘连蛋白基因LN，抗氧化相关的Sirtuins蛋白家族基因SIRT-1，以及细胞生长因子相关的肝细胞生长因子HGF和成纤维细胞生长因子基因FGF21表达的作用，基因相对表达倍数1.14～1.68倍；具下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶10基因MMP10，细胞凋亡相关的BCL2-Associated X蛋白基因BAX和半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase3、Caspase9，基因相对表达倍数0.52～0.83。
实施例9LABOFMIC-321上调HaCaT抗菌肽相关基因表达实验
1、LABOFMIC-321发酵滤液及发酵溶胞产物制备：
制备方法参照实施例3和4。
2、HaCaT细胞制备
将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
3、LABOFMIC-321添加及LPS刺激
将发酵滤液5％(V/V)、发酵溶胞产物10％(V/V)分别加入培养过夜的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵滤液/发酵溶胞产物)。2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的LPS溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
4、qPCR法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2、LL-37基因的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵滤液上调抗菌肽相关基因LL-37、S100A7、S100A8、DEFB4。结果见下表：
发酵溶胞产物上调抗菌肽相关基因S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2。结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321发酵溶胞产物具有上调抗菌肽相关银屑病素基因S100A7、钙粒蛋白基因S100A8、β防御素4基因DEFB4、脂质运载蛋白-2基因LCN-2，以及cathelicidin家族抗菌肽基因LL-37表达的作用。基因相对表达倍数1.17～9.02。
实施例10LABOFMIC-321抑制酪氨酸酶活性实验
1、LABOFMIC-321发酵滤液制备：
挑取双歧双歧杆菌LABOFMIC-321单菌落于BBL液体培养基，37℃厌氧培养箱静置培养16h～18h，酶标仪检测并以BBL液体培养基稀释调整OD600＝2，121℃，30min、0.28Mpa灭活，12000r/min转速离心2min，经0.22μm滤膜过滤为发酵滤液。
2、酪氨酸酶活性抑制率检测
配制250U/mL酪氨酸酶，6.0mM左旋多巴和80mM的PBS。在96孔板每孔内依次加入50μl PBS+20μl发酵滤液+50μl酪氨酸酶+50μl左旋多巴(对照组以等体积BBL液体培养基替代发酵滤液)。反应体系混匀后室温避光静置15min，使用酶标仪检测475nm吸亮度A。
酪氨酸酶活性抑制率计算公式及结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有抑制酪氨酸酶活性的作用。活性抑制率50.98％～53.85％。
实施例11LABOFMIC-321调节A875人黑色素瘤黑色素分泌/黑色素合成/褐黑素生成/黑色素转运/黑色素小体形成/黑色素小体成熟/黑色素细胞迁移相关基因的表达实验
1、LABOFMIC-321发酵溶胞物制备：
制备方法参照实施例4。
2、A875人黑色素瘤细胞制备及紫外线照射
将A875人黑色素瘤细胞消化后以0.5mL/孔(内含8.5×104细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为1J/cm2的紫外线UVB照射诱导黑色素生成。
3、LABOFMIC-321添加
将发酵溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的A875人黑色素瘤细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测黑色素分泌/黑色素合成/褐黑素生成/黑色素转运/黑色素小体成熟/黑色素细胞迁移相关基因的相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测黑色素合成相关基因TRP-2、GSK3β、褐黑素生成相关基因ASIP、黑色素分泌相关基因EDN、MC1R、黑色素转运相关基因SLAC2A、黑色素小体成熟相关基因MATP、黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达。以对照组基因相对表达倍数F＝1，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵溶胞物下调黑色素合成相关基因TRP-2、GSK3β；褐黑素生成相关基因ASIP；黑色素分泌相关基因EDN、MC1R；黑色素转运相关基因SLAC2A；黑色素小体成熟相关基因MATP；黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达，结果见下表：
体外细胞实验表明，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有下调黑色素合成相关的酪氨酸酶相关蛋白2基因TRP-2、糖原合成酶激酶3β基因GSK3β、褐黑素生成相关的刺鼠信号蛋白基因ASIP、黑色素分泌相关的内皮素基因EDN、黑皮质激素1受体MC1R、黑色素转运相关的、黑色素亲和素SLAC2A、黑色素小体成熟相关的黑色素小体膜蛋白基因OA1、膜相关转运蛋白基因MATP、黑色素细胞迁移相关的钙黏蛋白基因E-cadherin基因表达的作用，基因相对表达倍数0.34～0.80。表明LABOFMIC-319具有抑制黑色素相关基因表达的美白作用。
实施例13LABOFMIC-321调节HaCaT细胞更新老化角质相关基因表达实验
1、LABOFMIC-321发酵溶胞物制备：
制备方法参照实施例4。
2、HaCaT细胞制备及紫外线光老化
将HaCaT细胞消化后以0.5mL/孔(内含2×105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm2的紫外线UVB光老化。
3、LABOFMIC-321添加
将发酵溶胞物10％(V/V)分别加入刺激过的HaCaT细胞(对照组分别以等体积PBS替代发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
4、qPCR法检测更新老化角质相关基因相对表达倍数
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测降解桥粒蛋白相关基因KLK5；调节角质细胞分化相关基因CDSN的表达。以等体积PBS处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，利用2-ΔΔCT法计算各样品F值。
发酵溶胞物调节更新老化角质相关基因CDSN的表达，结果见下表：
结果显示，本发明的双歧双歧杆菌LABOFMIC-321具有上调降解桥粒蛋白相关基因激肽释放酶5基因KLK5，调节角质细胞分化相关的角膜锁链蛋白基因CDSN的表达，基因表达量上调1.24～4.98倍。因此LABOFMIC-321具有更新老化角质的作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)，该菌株被命名为LABOFMIC-321，已于2022年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No:M 20221461的双歧双歧杆菌。
2.根据权利要求1所述的双歧双歧杆菌，其特征在于，采样于健康女婴粪便中，将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BBL固体平板，37℃厌氧培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为LABOFMIC-321；
显微镜下呈杆状；在BBL平板上生长，可形成乳白色、表面光滑、半透明、圆形小菌落，边缘整齐；在BBL液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
3.权利要求1～2任一项所述的双歧双歧杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述改善皮肤状况包括促进角质细胞增殖和/或成纤维细胞增殖、修护皮肤屏障、保湿、抗衰老、提高皮肤抗菌能力、美白、更新老化角质中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述修护皮肤屏障包括上调屏障修护相关基因FLG的表达。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿包括上调保湿相关基因AQP3的表达。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括下列所示表达中的至少一种：
a).所述抗衰老包括上调细胞外基质合成相关基因的表达，所述细胞外基质合成相关基因包括TIMP1、LN中的至少一种；
b).所述抗衰老包括下调细胞外基质降解相关基因的表达，所述细胞外基质降解相关基因包括MMP家族基因MMP1、MMP10中的至少一种；
c).所述抗衰老包括上调细胞抗氧化相关基因SIRT-1的表达；
d).所述抗衰老包括上调细胞生长因子相关基因HGF、FGF21的表达；
e).所述抗衰老包括下调细胞凋亡相关基因的表达，所述细胞凋亡相关基因包括BAX和/或Caspase家族Caspase3、Caspase9中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括S100A7、S100A8、DEFB4、LCN-2、LL-37中的至少一种。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述美白包括下列所示表达中的至少一种：
a).所述美白包括下调黑色素合成相关基因TRP-2、GSK3β的表达；
b).所述美白包括下调褐黑素生成相关基因ASIP的表达；
c).所述美白包括下调黑色素分泌相关基因EDN、MC1R的表达；
d).所述美白包括下调黑色素转运相关基因SLAC2A的表达；
e).所述美白包括下调黑色素小体成熟相关基因MATP的表达；
f).所述美白包括下调黑色素细胞迁移相关基因E-cadherin的表达；
g).所述美白包括抑制酪氨酸酶活性的作用。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述更新老化角质包括上调桥粒蛋白降解相关基因KLK5、调节角质细胞分化相关基因CDSN的表达。
10.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1～2任一项所述的双歧双歧杆菌原料制成；所述产品为食品、药品或化妆品，所述产品中的双歧双歧杆菌包括如下所示的至少一种：
(1)双歧双歧杆菌的菌群和/或菌剂；
(2)双歧双歧杆菌的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
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