CN115786182A - 一株动物双歧杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物和化妆品技术领域，具体涉及一株动物双歧杆菌及应用。经实验证实，本发明提供的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵液的上清液对致病性大肠杆菌、表皮葡萄球菌生长有抑制作用，发酵的上清液对角质细胞增殖有促进作用，无细胞制剂对角质细胞的丝聚蛋白基因FLG转录有促进作用，表明本发明所述动物双歧杆菌在制备医药、护肤品原料方面具有潜在应用价值。特别是上述菌株发酵上清液的稀释液，能促进角质细胞增殖，无细胞制剂促进角质细胞的丝聚蛋白基因FLG的表达，在制备化妆品原料等领域中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物和化妆品技术领域，具体涉及一株动物双歧杆菌及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
双歧杆菌是一种严格厌氧菌，广泛分布于人体和动物肠道，是一种重要的有益微生物，号称肠道健康卫士。双歧杆菌与病原菌竞争吸附肠上皮细胞受体，在肠道粘膜表面形成生理屏障，并通过营养竞争、絮凝、产生活性代谢物等方式阻止病原菌入侵。有报道，双歧杆菌还与肠道相关炎症的代谢改善有关，如降低胰岛素敏感性、脂肪堆积、活性氧损伤，核因子κB(NF-κB)通路激活以及炎症标志物和高密度脂蛋白(HDL)、血浆胆固醇水平降低等作用。随着年龄的增长，双歧杆菌种类和含量发生变化，尤其在机体应激条件下，包括双歧杆菌、乳杆菌在内的肠道有益菌群丰度降低。为此，以双歧杆菌、乳杆菌为主要成分的益生菌受到消费者青睐。
皮肤是人体最大的器官，也是机体防御外界各种物理、化学及病原微生物侵害的重要组织。在皮肤表面栖息着庞大的微生物类群，形成皮肤生态屏障，称为皮肤微生物组。业已证明，许多皮肤疾病都与皮肤微生物组变化有关，如反应性皮炎(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌比例增加)、银屑病(金黄色葡萄球菌比例增加)、痤疮(痤疮丙酸杆菌比例增加)、脂溢性皮炎和头皮屑(马拉色菌数量增加)、白癜风(病变水平上微生物多样性减少和厚壁菌门比例增加)。目前还不清晰微生物组变化引起皮肤疾病的生理机制，但通过比较皮肤微生物组与皮肤代谢物发现，皮肤微生物组通过产生肉碱、组胺和苯乳酸(PLA)等功能因子参与皮肤微生态调节，维护皮肤健康。因此，随着对皮肤微生物组研究的深入，国外对于皮肤功能因子的研究从开发植物源性的多肽、多糖和黄酮物质逐渐转向通过微生物活性代谢物调控皮肤微生态研究。与此同时，化妆品市场也从植物提取物进入微生态护肤时代。益生菌是指摄入一定数量后赋予机体健康的一类活菌制剂，最常用的菌株是乳酸菌如乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等，通过口服或直接涂抹益生菌制剂调节皮肤微生态屏障成为科学研究和市场应用的新热点。在学术界，肠-肤-轴研究备受关注，即通过口服益生菌促进机体免疫，改善过敏性皮炎已有报道。目前国内益生菌及其制剂在护肤品中的应用处于起步阶段，具有益肤功能的乳酸菌及其活性代谢物挖掘还很有限，功效成分和作用机制有待阐明。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一株动物双歧杆菌及应用。该菌株分离自健康成人粪便，经试验证明，其发酵液对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用，该菌株的无细胞制剂能提高角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达，其发酵液促进角质形成细胞增殖，表明该菌株在制备医药、护肤品原料等领域具有广阔的应用前景。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3，该菌株已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.25262。
本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3或其发酵物或其代谢产物。
本发明所述的代谢产物包括菌体胞外代谢产物和/或胞内代谢产物。
本发明中，术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3产生的代谢产物。
以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。本发明通过试验证明，通过BBL培养基发酵培养后获得的上清液可以有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长，以及上清液经稀释(如稀释100倍)后能够显著促进人角质形成细胞增殖，经研究表明，其能够有效促进人角质形成细胞HaCaT丝聚蛋白基因FLG的转录水平上调。
以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，(下文中亦可称为“无细胞制剂”)，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。且经研究表明，通过BBL培养基发酵培养后获得的无细胞提取物能够有效促进人角质形成细胞HaCaT丝聚蛋白基因FLG的转录水平上调。
本发明的第三个方面，提供上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3或上述菌剂在如下(a)和/或(b)中的应用：
(a)抑制病原菌或制备病原菌抑制剂；
(b)促进人角质形成细胞增殖或制备人角质形成细胞增殖促进剂。
上文(a)中，所述病原菌包括但不限于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
具体的，所述病原菌抑制剂可以以如下任意一种或多种制品形式存在，如药品、保健品、食品、卫生用品或(环境)消毒用品。
上文(b)中，所述人角质形成细胞增殖促进剂可以为化妆品，具体可以为护肤品，其具有加快表皮细胞分化、促进伤口愈合以及修复皮肤屏障等功效，此外，所述护肤品还可以具有控油祛痘、除皱修复等功效，上述功效的实现还可以通过在护肤品中添加相应成分得以实现或增强。
本发明的第四个方面，提供一种护肤品，所述护肤品含有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的发酵物或其代谢产物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案公开了一株动物双歧杆菌，实验证实，所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵液的上清液对致病性大肠杆菌、表皮葡萄球菌生长有抑制作用，发酵的上清液对角质细胞增殖有促进作用，无细胞制剂对角质细胞的丝聚蛋白基因FLG转录有促进作用，表明本发明所述动物双歧杆菌在制备医药、护肤品原料方面具有潜在应用价值。特别是上述菌株发酵上清液的100倍稀释液，能促进角质细胞增殖，无细胞制剂促进角质细胞的丝聚蛋白基因FLG的表达，在制备化妆品原料等领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵液在固体培养基上对金黄色葡萄球菌ATCC27217的抑菌圈。
图2为本发明动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵液在固体培养基上对大肠杆菌ATCC25922的抑菌圈。
图3为本发明动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵上清液对人角质形成细胞的增值促进作用。
图4为本发明动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的无细胞制剂对人角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG转录的促进作用。
图5为本发明受试者2号、7号使用前后痘痘改善情况。
图6为本发明受试者25号使用前后紫质改善情况。
图7为本发明受试者2号、5号使用前后红区改善情况(舒缓)。
图8为本发明受试者11号使用前后皱纹改善情况(抗皱)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，目前国内益生菌及其制剂在护肤品中的应用处于起步阶段，具有益肤功能的乳酸菌及其活性代谢物挖掘还很有限，功效成分和作用机制有待阐明。
有鉴于此，本发明提供一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3，分离自健康成人粪便，该菌株的发酵液对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用，特别是该菌株的无细胞制剂能提高角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG的表达，发酵液促进角质形成细胞增殖，表明该菌株在制备护肤品原料中具有广阔的应用前景。
具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3，该菌株已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.25262。
上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)CGMCC No.25262，分离自健康成人粪便，具有双歧杆菌的典型特征，即为：个体形态多杆状，有分叉，呈Y字形，V字形，弯曲状，刮勺状；菌落较小且大小均一，边缘整齐，凸圆，乳白色；专性厌氧，革兰氏阳性，无芽孢，不运动。上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的生理生化特征详见表1。
表1：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的生理生化特征
上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3生长温度为32℃-41℃，最适生长温度为37℃。
上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3在BBL培养基中快速生长，37℃厌氧培养36～48小时后，菌体密度可达2.25，pH值3.82。
上述BBL培养基为培养双歧杆菌的常用培养基，在本发明的一个具体实施方式中，BBL培养基的配方为：蛋白胨15.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化钠5.0g，半胱氨酸0.5g，西红柿浸出液400.0mL，吐温80 1.0mL，肝提取液80.0mL，琼脂20.0g，番茄浸粉5.0g，肝津粉2.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0。115℃灭菌20分钟，备用。
上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的16S rDNA序列如SEQIDNO.1所示，通过与GenBank中序列比对，结果显示菌株W3的16S rDNA基因序列与有关菌株的16S rDNA基因序列虽有相似性(如表2所示)，但却不完全相同，表明本发明的菌株首次分离鉴定。
表2动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3 16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较
本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3或其发酵物或其代谢产物。
本发明所述的代谢产物包括菌体胞外代谢产物和/或胞内代谢产物。
本发明中，术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3产生的代谢产物。
以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。本发明通过试验证明，通过BBL培养基发酵培养后获得的上清液可以有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长，以及上清液经稀释(如稀释100倍)后能够显著促进人角质形成细胞增殖。
以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物(下文中亦可称为“无细胞制剂”)，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。且经研究表明，通过BBL培养基发酵培养后获得的无细胞提取物能够有效促进人角质形成细胞HaCaT丝聚蛋白基因FLG的转录水平上调。
以及，在本发明的实施方式中，为方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)W3或其发酵物或其代谢产物进一步进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术)可采用常规方法进行，在此不再赘述。
本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂还可包括菌剂可接受的辅料。
本发明的又一具体实施方式中，所述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述菌剂可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)W3或上述菌剂在如下(a)和/或(b)中的应用：
(a)抑制病原菌或制备病原菌抑制剂；
(b)促进人角质形成细胞增殖或制备人角质形成细胞增殖促进剂。
上文(a)中，所述病原菌包括但不限于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。上述动物双歧杆菌W3以体积比为3％～5％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36～48小时，即获得活菌数为(6.2～8.6)×108CFU/mL，pH值3.82，乳酸含量8.1g/L的发酵液。实验证明，上述发酵液除掉菌体后得到的上清液可以在LB固体双层平板上抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生长，形成明显的抑菌圈如图1、图2所示。
上述发酵液除掉菌体的方法：上述动物双歧杆菌W3的发酵液，以8000～10000g，10～15min条件离心，通过0.22或0.45μm滤膜过滤除菌后，收集发酵液的上清液。
具体的，所述病原菌抑制剂可以以如下任意一种或多种制品形式存在，如药品、保健品、食品、卫生用品或(环境)消毒用品。
上文(b)中，所述人角质形成细胞增殖促进剂具体选用动物双歧杆菌W3的发酵液的上清液和/或无细胞制剂，其可以为化妆品，具体可以为护肤品，其具有加快表皮细胞分化、促进伤口愈合以及修复皮肤屏障等功效，此外，所述护肤品还可以具有控油祛痘、除皱修复等功效，上述功效的实现还可以通过在护肤品中添加相应成分得以实现或增强。所述护肤品剂型不做具体限定，可以为乳剂、水剂、霜剂等。
具体的，上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3，以体积比为3％～5％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36～48小时，即获得活菌数为(6.2～8.6)×108CFU/mL，pH值为3.82的发酵液。实验证明，发酵液除掉菌体细胞得到的上清液稀释100倍后促进人角质形成细胞HaCaT增殖130.0％～135.6％，如图3所示。
上述发酵液除掉菌体的方法：上述动物双歧杆菌W3的发酵液，以8000～10000g，10～15min条件离心，通过0.22或0.45μm滤膜过滤除菌后，收集发酵液的上清液。
上述上清液稀释的方法：将上述上清液与0.85％生理盐水按照1：99混合制备上清液的100倍稀释液。
上述人角质形成细胞HaCaT培养在RPMI-1640培养基，在含有5％CO2培养箱中37℃培养。
上述RPMI-1640培养基配方为：10％胎牛血清，青霉素-链霉素100IU/mL。
上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3，以体积比为3％～5％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36～48小时，即获得活菌数为(6.2～8.6)×108CFU/mL，pH值为3.82的发酵液。实验证明，该菌株的无细胞制剂能够有效促进人角质形成细胞HaCaT丝聚蛋白基因FLG的转录水平上调，如图4所示。
上述动物双歧杆菌无细胞制剂的制备方法：上述动物双歧杆菌的发酵液，以8000～10000g，离心10～15min，去掉上清液收集菌体细胞，添加适量PBS后，以300～400W，15～20min超声破碎，再将破碎液以8000～10000g，离心10～15min所得上清液，然后经过0.22或0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到动物双歧杆菌的无细胞制剂。
上述人角质形成细胞HaCaT培养在RPMI-1640培养基，在含有5％CO2培养箱中37℃培养。
上述RPMI-1640培养基配方为：10％胎牛血清，青霉素-链霉素100IU/mL。
上述人角质形成细胞HaCaT丝聚蛋白基因FLG的表达水平通过荧光定量PCR方法测定。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种护肤品，所述护肤品含有动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3的发酵物或其代谢产物。
其中，所述发酵物可以为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵液的上清液和/或发酵液的无细胞制剂，发酵培养基可采用任意细菌培养基，在本发明的一个具体实施方式中，所述发酵培养基为BBL培养基。
BBL培养基的配方为：蛋白胨15.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化钠5.0g，半胱氨酸0.5g，西红柿浸出液400.0mL，吐温80 1.0mL，肝提取液80.0mL，琼脂20.0g，番茄浸粉5.0g，肝津粉2.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0。115℃灭菌20分钟，备用。
所述护肤品还可以包含任意化妆品领域允许添加的其他原料成分，包括但不限于乳化剂、润肤剂、保湿剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂和溶剂等，在此不做具体限定。本领域技术人员可根据实际情况进行调整。同时，本发明通过合理添加上述原料成分，也可以以此制备不同护肤品剂型，如水、乳、霜等，同时，基于上述基础护肤品品类，进一步衍生制备的获得的其他化妆品品类，其均属于本申请的保护范围之内。
下面结合实施例对本发明进一步说明。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性前提下，任何对本发明的变化都归属本发明的保护范围。同时，在本发明实施例中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
实施例1：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3菌株的筛选及生理生化特性
使用粪便采样器将采集的新鲜粪便样品，在5mL BBL液体培养基，37℃厌氧富集培养24小时，发酵液涂布在BBL培养基琼脂平板上，平板迅速放入厌氧罐，倒置平板37℃培养48小时，挑取白色圆形且过氧化氢酶阴性的菌落，反复划线确定纯菌落后，接种到BBL培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定，最终筛选得到一株双歧杆菌菌W3，经16S rDNA基因测序及序列分析，鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，命名为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3。
上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3菌株为革兰氏阳性菌，专性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐；显微镜下具有双歧杆菌的典型特征，即为：个体形态多杆状，有分叉，呈Y字形，V字形，弯曲状，刮勺状。生理生化特征是：过氧化氢酶阴性，VP反应阴性，吲哚反应阴性，可利用乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用鼠李糖和山梨糖。
将动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3菌株接种到BBL培养基中，37℃厌氧培养12小时，菌体密度达到2.20，pH值3.82，乳酸产量为8.10g/L。
上述BBL培养基的配方为：蛋白胨15.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化钠5.0g，半胱氨酸0.5g，西红柿浸出液400.0mL，吐温80 1.0mL，肝提取液80.0mL，琼脂20.0g，番茄浸粉5.0g，肝津粉2.0g，蒸馏水1000.0mL，pH 7.0。115℃灭菌20分钟，冷却备用。
上述筛选到的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3已于2022年07月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25262。
实施例2：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3对致病菌的抑制作用
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3菌株以体积比为3％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36小时，即可获得活菌数为6.5x108CFU/mL，pH3.82的发酵液。发酵液8000～10000g离心10～15min除掉菌体，并进一步利用0.22μm滤膜过滤，收集滤液即为发酵液的上清液，备用。
将指示菌金黄色葡萄球菌ATCC27217、大肠杆菌ATCC25922接种在LB培养基中37℃培养过夜，分别取出100μL与4.5mL半固体LB培养基(存放在50℃水浴锅)迅速混匀，然后倒入已经凝固的LB培养基平板上，室温放置30分钟，然后放入牛津杯，向牛津杯中加入200μL动物双歧杆菌发酵液的上清液，平板放置37℃培养箱静止过夜培养，观察并测量抑菌圈大小，结果如图1和图2所示。
实验证实，动物双歧杆菌W3发酵液的上清液，在LB固体双层平板上对金黄色葡萄球菌ATCC27217、大肠杆菌ATCC25922有明显抑菌圈，抑菌圈直径大小分别为1.3cm和2.7cm，说明该菌株的发酵液对两种致病菌生长有抑制作用
上述BBL培养基配方为：蛋白胨15.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化钠5.0g，半胱氨酸0.5g，西红柿浸出液400.0mL，吐温80 1.0mL，肝提取液80.0mL，琼脂20.0g，番茄浸粉5.0g，肝津粉2.0g，蒸馏水1000.0mL，pH7.0。115℃灭菌20分钟，冷却备用。
上述LB培养基液体配方为：蛋白胨10.0g；酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，调节pH值至7.2,121℃灭菌20分钟，备用。
上述LB固体培养基配方为：除以上LB培养基成分外，添加1.5％琼脂粉，121℃灭菌20分钟，备用。
上述LB半固体培养基配方为：除以上LB培养基成分外，添加0.45％琼脂粉，121℃灭菌20分钟，备用。
实施例3：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3对人角质形成细胞增殖的促进作用
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3菌株以体积比为3％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36小时，即可获得活菌数为6.5x108CFU/mL，pH3.82的发酵液。发酵液8000g离心15min除掉菌体，并进一步利用0.22μm滤膜过滤，收集滤液即获得发酵液的上清液。滤液分别稀释100倍、200倍、300倍，400倍、500倍，然后与人角质形成细胞HaCaT在37℃5％ CO2条件下孵育24小时，测定对细胞的毒性及增殖效果，结果如图3所示。
实验证明，发酵液稀释液对角质形成细胞无毒害作用，并且稀释100倍后对角质形成的促增殖效果最好，增殖率达到132.72％，预示着发酵液具有促进伤口愈合，修复皮肤屏障的作用。
实施例4：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3对人角质形成细胞丝聚蛋白基因FLG转录的促进作用
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3菌株以体积比为3％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36小时，即可获得活菌数为6.5x108CFU/mL，pH3.82的发酵液。发酵液8000g离心15min收集菌体，添加适量PBS后，以400W，15min超声破碎，再将破碎液以8000g，15min离心，所得上清液经过0.22μm滤膜过滤收集上清液，即可获得动物双歧杆菌的无细胞制剂。将无细胞制剂分别稀释20倍、40倍、60倍，80倍、100倍，稀释液与人角质形成细胞HaCaT在37℃5％ CO2条件下孵育24小时，通过荧光定量PCR测定细胞丝聚蛋白基因FLG的相对转录水平，结果如图4所示。
实验证明，无细胞制剂促进角质形成细胞中丝聚蛋白基因FLG转录水平上调，是不添加对照组的1.4～3.2倍，预示着该菌株的无细胞制剂具有加快表皮细胞分化、促进伤口愈合的作用。
FLG基因荧光定量PCR的引物为，FLGF：5’-GCCAGGGACAATCAGAGG-3’(SEQ IDNO.2)，FLGR：5’-TGGAAGCAGACCCAGACC-3’(SEQ ID NO.3)。
实施例5：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3祛痘护肤品的制备及应用
上述动物双歧杆菌以体积比为3％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36小时，即可获得活菌数为6.5x108CFU/mL发酵液。发酵液以8000g，15min离心，所得上清液经过0.22μm滤膜过滤收集上清液，将其按每100克物料中添加2g的发酵液上清液混合于护肤水基质中，室温混匀5分钟，即可获得控油祛痘的护肤品。
表3含动物双歧杆菌发酵液成分的护肤水配方表
上述护肤水优选针对具有祛痘控油功效的化妆品，以18-25岁痘痘肌人群为对象，让测试者连续使用含该护肤水14天后检测。通过测定志愿者产品使用前后的皮肤生理状态的变化等指标来评估含该产品的对痘痘肌肤改善的有益影响。拍摄受试者面部照片观察痘痘个数和紫质改善情况，产品经过试用后结果显示，说明使用受试产品14天后具有祛祛痘控油等功效。部分祛痘控油有效例如图5、图6所示。
实施例6：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3护肤品乳液的制备及应用
上述动物双歧杆菌以体积比为3％的量接种于BBL培养基中，37℃发酵36小时，即可获得活菌数为6.5x108CFU/mL培养液，发酵液以8000g，15min离心，所得上清液经过0.22μm滤膜过滤收集上清液然后，将其稀释100倍后，按每100克物料中将2g的上清稀释液和2g无细胞制剂混合于护肤乳液基质中，室温混匀5分钟(室温搅拌混合均匀)，即可获得具有修复功效的护肤品乳液。
表4含动物双歧杆菌发酵液成分的护肤乳液配方表
上述乳液优选针对具有除皱修复功效的化妆品，以25-35岁中国健康女性人群为对象，让测试者连续使用含该乳液56天后检测。通过测定志愿者产品使用前后的皮肤生理状态的变化等指标来评估含该乳液的对皮肤改善的有益影响。拍摄受试者面部照片观察皱纹和红区改善情况，产品经过试用后结果显示，说明使用受试产品56天后具有祛皱抗衰、修护皮肤屏障、舒缓等功效。部分舒缓、抗皱有效例如图7、图8所示。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一株动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3，该菌株已于2022年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25262。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3或其发酵物或其代谢产物。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括菌剂可接受的辅料。
4.权利要求1所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3或权利要求2-3任一项所述菌剂在如下(a)和/或(b)中的应用：
(a)抑制病原菌或制备病原菌抑制剂；
(b)促进人角质形成细胞增殖或制备人角质形成细胞增殖促进剂。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述(a)中，所述病原菌包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述病原菌抑制剂为药品、保健品、食品、卫生用品或(环境)消毒用品中的任意一种或多种。
7.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述(b)中，所述人角质形成细胞增殖促进剂具体选用动物双歧杆菌W3的发酵液的上清液和/或无细胞制剂。
8.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述(b)中，所述人角质形成细胞增殖促进剂为化妆品，具体为护肤品，所述护肤品剂型包括乳剂、水剂和霜剂。
9.一种护肤品，其特征在于，所述护肤品含有动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)W3的发酵物或其代谢产物；
其中，所述发酵物为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)W3发酵液的上清液和/或发酵液的无细胞制剂；进一步的，发酵培养中使用的培养基为BBL培养基。
10.如权利要求9所述的护肤品，其特征在于，所述护肤品还包含任意化妆品领域允许添加的其他原料成分，包括乳化剂、润肤剂、保湿剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂和溶剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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