CN113088470A - 一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其应用，属于生物技术领域。本发明公开的一株鼠李糖乳杆菌L.rB16，保藏编号为CGMCCNo.21573。本发明的鼠李糖乳杆菌L.rB16能够制备成降胆固醇的药物。

Description

一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其应用。

背景技术

人类的血浆胆固醇主要来源于食物的摄取和肝脏的合成作用，其主要包括高密度脂蛋白胆固醇(high-densitiy lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-densitiy lipoprotein cholesterol,LDL-C)以及极低密度脂蛋白胆固醇(verylow-density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)等。高胆固醇血症是一种脂代谢异常的代谢性疾病，表现为血液中胆固醇尤其是LDL-C的异常升高。LDL-C的异常升高是动脉粥样硬化和冠心病的独立危险因素，严重威胁人类健康。降低异常升高的胆固醇可有效降低心血管事件的发生。

益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物的总称，当摄入足够数量后能在宿主中定植并维持宿主肠道菌群平衡，从而发挥作用。目前可以用作益生菌的微生物主要是乳酸菌，大体分为乳杆菌属、双歧杆菌属和革兰式阳性球菌属三大类。经过多年的探索与研究，益生菌相关产品的临床应用越来越广泛，功能主要包括调节胃肠道失调、增强肠道免疫功能、降低血浆胆固醇、抗过敏反应和保护心血管系统等。目前，研究表明益生菌可通过抑制脂类合成、吸收及促进胆固醇排出等途径降低血浆胆固醇，有望成为传统降脂药物的替代品，应用于高脂血症的防治。

因此，提供一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其在制备降胆固醇药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其在制备降胆固醇药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L.rB16，其保藏编号为CGMCCNo.21573，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年12月30日，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。

进一步，所述鼠李糖乳杆菌L.rB16在制备降胆固醇药物中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株鼠李糖乳杆菌L.rB16及其应用，鼠李糖乳杆菌L.rB16是一株来源于本实验室前期从大学生志愿者粪便中分离的乳杆菌；L.rB16能够制备成降胆固醇的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明L.rB16在MRS琼脂平板上的菌落形态；

图2附图为本发明L.rB16在厌氧血琼脂平板上的菌落形态；

图3附图为本发明L.rB16革兰染色镜下形态，1000倍镜；

图4附图为本发明高脂血症小鼠模型体重变化；

图5附图为本发明高脂血症小鼠模型体重增长率；

图6附图为本发明高脂血症小鼠模型糖耐量检测结果示意图；

图7附图为本发明高脂血症小鼠模型TC水平结果示意图；

图8附图为本发明高脂血症小鼠模型TG水平结果示意图；

图9附图为本发明高脂血症小鼠模型LDL-C水平结果示意图；

图10附图为本发明高脂血症小鼠模型HDL-C水平结果示意图；

图11附图为本发明高脂血症小鼠模型T-AOC水平结果示意图；

图12附图为本发明高脂血症小鼠模型GSH水平结果示意图；

图13附图为本发明高脂血症小鼠模型CAT水平结果示意图；

图14附图为本发明高脂血症小鼠模型MDA水平结果示意图；

图15附图为本发明高脂血症小鼠模型肝脏组织HE染色结果；

图16附图为本发明高脂血症小鼠模型回肠组织HE染色结果；

图17附图为本发明高脂血症小鼠回肠组织学损伤评分；

其中，*，P<0.05；**，P<0.01，***，P<0.001；****，P<0.0001。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1L.rB16的的分离培养及鉴定

(1)样本来源

选取健康大学生作为志愿者。采样前两周需正常饮食并且近期无肠道感染史与抗生素服用史，采样当天取晨便，收集后迅速使用南京法迈特公司的智能微生物分离系统进行粪菌分离。分离完成后迅速收集粗提粪菌液，加入冻存保护液(含20％甘油的MRS肉汤培养基)后置于-80℃超低温冰箱中冻存备用。

(2)L.rB16的分离

取1mL的粗提粪菌液加入到9mL的生理盐水，充分混匀后进行梯度稀释。吸取稀释浓度为10^-3～10^-7的菌液各100μL，分别密集涂布于MRS琼脂培养基、TPY琼脂培养基及M17琼脂培养基，37℃厌氧条件培养48h-72h。初步根据菌落特征，挑选圆形、凸起、表面光滑、边缘完整以及颜色呈乳白色的单菌落在上述对应琼脂培养基上进行分区划线纯培养。收获纯培养后的适量菌体细胞置于菌种保藏管，-80℃冰箱保存备用。

(3)L.rB16培养特性

将L.rB16菌株，分区划线接种于MRS琼脂平板和厌氧血琼脂平板，MRS琼脂平板进行37℃常规条件培养48h，厌氧血琼脂平板进行37℃厌氧条件培养48h；观察MRS平板以及厌氧血琼脂平板上菌落特征，结果见图1-图2；结果显示，L.rB16为兼性厌氧菌，在MRS平板上菌落呈圆形、中等大小、凸起、微白色、湿润、边缘整齐，在厌氧血琼脂平板上不溶血。

(4)L.rB16的革兰染色菌体形态

挑取MRS琼脂平板上的L.rB16菌落，涂片进行革兰染色，油镜下观察菌细胞的形态，结果见图3；结果显示，L.rB16为革兰染色阳性的杆菌，无芽孢、无荚膜，成短链排列。

(5)L.rB16的生化鉴定

使用法国梅里埃生物公司的API 50CHL细菌生化鉴定系统进行鉴定。首先按照API50CHL鉴定试剂条说明书，将活化后的L.rB16菌悬液调整到2麦氏浊度，分别加到试剂条上的50个微生化孔中，并用无菌液体石蜡覆盖生化孔。35℃条件静置培养24h观察一次结果，继续培养至48h，再次观察结果。结果判定：25号管颜色由紫变黑为阳性，其余各管颜色由紫变黄为阳性，否则为阴性。将菌株的反应结果用API鉴定软件进行分析，获得菌株的鉴定结果。L.rB16生化反应结果见表1。鉴定结果为鼠李糖乳杆菌，鉴定率99.9％，T值0.3。

表1 L.rB16生化反应结果

其中，0号管为空白对照管。

实施例2高脂血症小鼠模型的建立

选用SPF级雄性C57BL/6小鼠(6～8周龄，体质量16～18g)24只。将小鼠随机分为3组，分别为对照组(给予正常饮食和生理盐水灌胃，normal diet，ND组)、模型组(给予高脂饮食和生理盐水灌胃，high-fat diet，HFD组)、L.rB16组(给予高脂饮食和1x10¹⁰CFU/mLL.rB16灌胃)，每组8只。每天固定时间点给予各实验组小鼠灌胃处理，每次1mL，1次/天。持续饲养9周后，经眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，留取小鼠血液，肝脏，回肠等标本用于后续检测与分析。实验期间每天记录小鼠体重。

实施例3高脂血症小鼠模型的评估

(1)一般情况评估

每日观察每组小鼠进食、活动、毛发等一般情况，每天上午用电子天平称量每只小鼠的体重。

各实验组小鼠体重变化及增长率((第9周小鼠体重-第1周小鼠体重)/第1周小鼠体重)结果见图4和图5，结果显示，饲养9周后，HFD组小鼠体重随着时间的增加均高于ND组和L.rB16组小鼠的体重，而L.rB16组小鼠的体重低于ND组。HFD组小鼠的体重增长率显著高于ND组和L.rB16组(P<0.05)，L.rB16组小鼠体重增长率与ND组小鼠体重增长率之间没有明显改变。

(2)高脂血症小鼠糖耐量检测

处死小鼠前一天进行糖耐量检测。测量小鼠血糖前一晚，移除小鼠食物，可自由饮水。次日8点使用血糖仪检测每只小鼠空腹血糖。接下来给小鼠腹腔注射20％葡萄糖溶液，于注射后30min、60min、90min、120min测定小鼠血糖，结果见图6。图6结果显示，各组小鼠在注射葡萄糖30min后，血糖浓度升高至最高点，随后在60min、90min和120min后血糖浓度逐渐下降，且ND组小鼠血糖值低于HFD组，提示高脂饮食导致小鼠糖耐量受损；而L.rB16组小鼠血糖浓度均低于HFD组，提示L.rB16可缓解高脂饮食引起的小鼠糖耐量受损。

(3)高脂血症小鼠血脂检测

小鼠饲养9周后进行眼球取血，收集血清，采用全自动生化仪(迈瑞)测定血清胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、LDL-C、HDL-C水平，结果见图7-图10。图7-图10结果显示，HFD组小鼠血清TC，TG和LDL-C水平高于ND组(P<0.05)，而血清HDL-C水平无明显改变，提示成功建立高脂血症小鼠模型；与HFD组小鼠相比，L.rB16组小鼠血清TC，TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高(P<0.05)。因此L.rB16在一定程度上可调节高脂血症小鼠的血脂水平。

(4)高脂血症小鼠肝脏抗氧化因子检测

小鼠颈椎脱臼处死后摘取肝脏，取0.1g肝组织加入1mL预冷裂解液(索莱宝)，超声破碎后，收集匀浆液，4℃，10000r/min，离心5min，收集上清液。采用总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、还原性谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、和过氧化氢(CAT)活性检测试剂分别测定肝脏组织中抗氧化因子水平，同时采用丙二醛(MDA)检测试剂盒测定肝脏脂质过氧化水平，结果见图11-图14。图11-图14结果表明，与ND组相比，HFD组肝脏T-AOC，GSH和CAT水平显著降低，MDA水平增高(P<0.05)；与HFD组相比，L.rB16组T-AOC，GSH和CAT水平显著增加，MDA水平降低(P<0.05)。表明L.rB16可提高肝脏抗氧化能力，降低高脂饮食造成的机体氧化应激水平的增加。

(5)高脂血症小鼠肝脏组织HE染色

①处死小鼠后，取出各组小鼠肝脏，用4％甲醛溶液固定，经石蜡包埋并切片。②将石蜡切片浸泡于二甲苯溶液中，微波炉加热5min；再次将石蜡切片浸泡入二甲苯溶液中，微波炉加热5min；再分别浸泡于无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇溶液1min共两次；然后用自来水进行冲洗。③苏木素染色5min后，用流水冲洗，1％盐酸酒精分化，再次用流水冲洗；伊红染色1min。再次浸泡于75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇溶液1min共两次，于二甲苯溶液中浸泡5min两次后，用中性树脂封片。④显微镜下观察并拍照。光学显微镜下观察比较各组小鼠肝脏组织病理学改变，如脂肪变性，结果见图15。图15结果显示，ND组为正常结构；HFD组可见肝细胞形态不规则、细胞核粗糙疏松、排列紊乱、炎症细胞浸润、大量脂肪滴沉积，可见脂肪样变性；L.rB16组的组织病理较HFD组相比，肝细胞形态规则、细胞核紧密、炎性细胞浸润减少、脂肪滴沉积减少，肝脏脂肪变性减轻。可见L.rB16对肝脏脂肪变性有明显的预防效果。

(6)高脂血症小鼠回肠组织HE染色及组织学损伤评分

①处死小鼠后，取出各组小鼠回肠，用10％甲醛溶液固定，经石蜡包埋并切片。②将石蜡切片浸泡于二甲苯溶液中，微波炉加热5min；再次将石蜡切片浸泡入二甲苯溶液中，微波炉加热5min；再分别浸泡于无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇溶液1min共两次；然后用自来水进行冲洗。③苏木素染色5min后，用流水冲洗，1％盐酸酒精分化，再次用流水冲洗；伊红染色1min。再次浸泡于75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇溶液1min共两次，于二甲苯溶液中浸泡5min两次后，用中性树脂封片。④显微镜下观察并拍照。光学显微镜下观察比较各组小鼠回肠组织病理学改变，结果见图16。图16结果显示，ND组为正常结构，肠壁结构完整，肠绒毛无断裂、缺失，上皮细胞完整，炎症细胞浸润较少；HFD组可见肠壁结构缺损、绒毛断裂，上皮细胞脱落，炎症细胞大量浸润，回肠组织损伤严重；L.rB16组的组织病理较HFD组有了明显改善。

(7)高脂血症小鼠回肠组织学损伤评分

组织学损伤评分：0分，正常肠黏膜；1分，肠黏膜顶端上皮下轻度水肿、毛细血管扩张充血；2分，肠黏膜上皮细胞与固有层间隙增大；3分，肠黏膜部分固有层顶端裸露、上皮细胞脱落；4分，黏膜固有层裸露或腺上皮结构消失、毛细血管扩张充血，可能伴随固有层炎细胞侵润；5分，肠黏膜出血、溃疡，固有层崩解。评估结果见图17，结果显示L.rB16组小鼠回肠组织损伤程度评分显著低于HFD组。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (2)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)L.rB16，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.21573。

2.权利要求1所述的一株鼠李糖乳杆菌L.rB16在制备降胆固醇药物中的应用。

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