KR20230154400A - 락토바실러스 플란타럼 hom3201 균주 및 이의 생균 제제, 제조 방법 및 용도 - Google Patents

락토바실러스 플란타럼 hom3201 균주 및 이의 생균 제제, 제조 방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230154400A
KR20230154400A KR1020230055044A KR20230055044A KR20230154400A KR 20230154400 A KR20230154400 A KR 20230154400A KR 1020230055044 A KR1020230055044 A KR 1020230055044A KR 20230055044 A KR20230055044 A KR 20230055044A KR 20230154400 A KR20230154400 A KR 20230154400A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
hom3201
lactobacillus plantarum
blood sugar
glucose
Prior art date
Application number
KR1020230055044A
Other languages
English (en)
Inventor
디 장
시치 장
양양 지
징징 장
팅팅 왕
이수원
임종윤
Original Assignee
코리 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 코리 컴퍼니 리미티드 filed Critical 코리 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20230154400A publication Critical patent/KR20230154400A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/169—Plantarum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 미생물 기술 분야에 관한 것으로, 구체적으로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HOM3201 균주, 이를 함유하는 생균 제제 및 이의 제조 방법과 용도에 관한 것이다. 상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 기탁 번호는 CGMCC No.22700이다. 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 수준을 현저히 감소시키고, 포도당에 대한 유기체의 내성을 증가시키며, 인슐린 저항성 지수를 감소시킬 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주 및 이의 생균 제제, 제조 방법 및 용도{LACTOBACILLUS PLANTARUM HOM3201 STRAIN AND ITS LIVE BACTERIAL PREPARATION, PREPARATION METHOD AND APPLICATION}
본 발명은 미생물 기술 분야에 관한 것으로, 구체적으로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HOM3201 균주, 이를 함유하는 생균 제제 및 이의 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)는 프로바이오틱스를 충분한 양을 섭취하면 숙주에 유익한 활성 미생물이라고 정의하였다. 과학적 연구를 통해 건강에 유익한 것으로 입증된 균주만이 "프로바이오틱스"라고 불릴 수 있다. 프로바이오틱스의 핵심 특징은 충분한 양, 생균 상태 및 유익한 건강 기능이다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)은 보편적으로 존재하는 프로바이오틱스의 일종으로, 흔히 쏸차이, 파오차이 등의 발효 식품 및 인체에서 분리된다. 락토바실러스 플란타럼은 장 점막 개선, 당뇨병, 고혈압, 비만, 항감염, 정신질환 등에 유익한 기능을 가지고 있다.
제2형 당뇨병의 발병률은 해마다 높아져 중국은 세계 선두에 자리한다. 제2형 당뇨병의 병인과 발병기전은 매우 복잡하며, 현재 말초조직의 인슐린 저항성과 인슐린 분비 장애는 주로 유전적, 환경적 요인에 의해 발생하며, 그 결과 체내에서 인슐린이 상대적 또는 절대적으로 결핍하여 포도당의 흡수 및 이용이 감소하여 고혈당증을 유발하고 당뇨병으로 이어지는 것으로 알려져 있다.
현재 프로바이오틱스의 혈당 수준 조절에 대한 연구는 완벽하고 체계적이지 않다.
본 발명은 선행기술의 과제를 감안하여 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HOM3201 균주, 이를 함유하는 생균 제제, 제조 방법 및 용도를 제공한다.
상기 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음과 같은 기술적 해결수단을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 제공하고, 상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 기탁 번호는 CGMCC No.22700이다.
바람직하게, 상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기와 같은 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 포함하는 생균 제제를 제공한다.
바람직하게, 상기 생균 제제는 최대 4.0~8.0×1011 CFU/g의 생균을 포함한다.
바람직하게, 상기 생균 제제는 보조제를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기와 같은 생균 제제를 포함하는 식품 또는 건강기능식품을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 혈당 강하 보조용 약물의 제조에서 상기와 같은 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 용도를 제공한다.
상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 인슐린 저항성 당 대사 장애/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 수준을 낮추고, 포도당에 대한 유기체의 내성을 증가시키며, 인슐린 저항성 지수를 감소시킨다.
바람직하게, 상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 당뇨병의 치료에 사용된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 제1항에 따른 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 최적화된 액체 배지에서 확대 배양하는 단계; 균체를 수집하는 단계; 및 보호제를 첨가하여 재현탁하고, 진공 동결 건조하고 분쇄하여 활성균제를 얻는 단계를 포함하는 상기와 같은 생균 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 다음과 같은 이점이 있다.
(1) 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201은 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 수준을 현저히 감소시키고, 포도당에 대한 유기체의 내성을 증가시키며, 인슐린 저항성 지수를 감소시킬 수 있다.
(2) 본 발명의 락토바실러스 플란타럼은 우수한 체외 프로바이오틱 기능을 가진다. 해당 균주는 인공 위장액의 내성, 항균성, 항산화 활성 등에서 우수한 성능을 가진다.
(3) 본 발명의 활성균제는 생산 공정 매개변수가 간단하고, 주기가 짧으며, 생균수가 많고, 안정성이 좋으며, 장기간에 걸쳐 효능을 발휘한다.
도 1은 UPGMA 방법에 기반하여 구축된 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 RAPD 집락 분석도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 DPP-4 및 α-글루코시다아제에 대한 억제율을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주가 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 포도당 내성에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 과정 흐름도를 나타낸다.
도 5는 서열번호 1의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 6은 서열번호 2의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 7은 서열번호 3의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 8은 서열번호 4의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 9는 서열번호 5의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 10은 서열번호 6의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 11은 서열번호 7의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
도 12는 서열번호 8의 서열에 대한 설명을 나타낸다.
미생물 기탁 설명
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 2021년 6월 11일 중국 미생물 균종 보존 관리 위원회 일반 미생물 센터(CGMCC)에 기탁되었고, 기탁 주소는, 베이징시 차오양구 베이천서로 1원 3호 중국과학원 미생물연구소이며, 기탁 번호는 CGMCC No.22700이다.
본 발명은 균주, 특성 및 응용을 공개하며, 당업자는 본문의 내용에 따라 공정 매개변수를 적당히 변경하여 구현할 수 있다. 특히 언급할 점은, 모든 유사한 교체와 수정은 당업자에게 있어서 자명한 것으로, 모두 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 본 발명의 방법 및 응용은 이미 바람직한 실시예를 통해 설명하였으나, 관련자라면 본 발명의 내용, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본문에 따른 방법과 응용을 수정하거나 또는 적당히 변경 및 조합하여 본 발명의 기술을 구현 및 응용할 수 있음을 분명히 알 것이다.
디펩티딜 펩티다아제-4 억제제(즉, DPP-4 억제제)는 시타글립틴(sitagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin)과 같은 제2형 당뇨병을 치료하는 새로운 유형의 약물이다. DPP-4 억제제는 DPP-4의 활성을 억제하여 인크레틴[글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 및 포도당 의존성 인슐린 분비 촉진 폴리펩티드(GIP)]의 분비를 자극할 수 있다. GLP-1 및 GIP는 글루칸곤의 방출을 억제하고, 인슐린 분비를 증가시키며, 위 배출을 감소시키고, 혈당 수준을 낮출 수 있다.
α-글루코시다아제 억제제는 제2형 당뇨병에 사용되는 경구 혈당 강하제로, 주로 아카보스(acarbose), 보글리보스(voglibose)를 사용한다. α-글루코시다아제 억제제의 혈당 강하 메커니즘은 장 점막의 α-글루코시다아제를 억제하여 전분이 포도당으로 분해되는 속도를 늦추고, 소장의 포도당 흡수를 감소 및 지연시켜 혈당을 낮추는 것으로, 식후 고혈당에 대한 효과가 비교적 뚜렷하다. α-글루코시다아제 억제제는 인슐린의 분비를 자극하지 않으며, 이러한 약물을 단독으로 사용할 경우 일반적으로 저혈당을 일으키지 않으므로, 혈당의 변동을 줄이는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201은 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 수준을 현저히 감소시키고, 포도당에 대한 유기체의 내성을 증가시키며, 인슐린 저항성 지수를 감소시킬 수 있다. 혈당 강하 메커니즘은, 락토바실러스 플란타럼 HOM3201의 성장 및 대사로 DPP-4 억제제 및 α-글루코시다아제 억제제를 생성하는 것이다. DPP-4 억제제는 DPP-4를 억제하여, 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)을 생성하도록 유기체를 자극하고, 인슐린 분비를 촉진하며; α-글루코시다아제 억제제는 α-글루코시다아제를 억제하여 전분이 포도당으로 전환되는 속도를 늦추어 혈당을 낮추는 목적을 달성한다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제, 채택된 기술적 해결수단 및 이점을 보다 명확하게 하기 위하여, 이하 도면 및 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 상세히 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 모두 통상적인 방법임을 유의해야 한다.
본 발명에 사용된 시약 및 소재는 달리 명시되지 않는 한 모두 통상적인 방법으로 조제되거나 상업적 경로로부터 입수된다.
본 발명에 사용되는 파오차이는 다음과 같다.
본 발명에 사용된 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 분리하기 위한 파오차이 샘플은 쓰촨성 청두 가정에서 직접 만든 파오차이이다. 제조 방법은 다음과 같다. 채소(청무, 흰무, 당근, 양배추, 동부, 풋고추 등)를 깨끗이 씻어 잘게 썰어 물기를 제거하고; 파오차이 항아리를 깨끗이 씻어 물기를 제거한 후 높은 도수의 백주를 조금 부어 소독하여 보관하며; 기름기 없는 냄비에 깨끗한 물을 붓고 계피, 월계수잎, 화초(Zanthoxylum bungeanum), 팔각, 얼음설탕, 생강을 넣고 끓이다가 완전히 식힌 후 파오차이 항아리에 붓고, 산고추즙, 고량주, 채소를 붓는다. 뚜껑을 덮은 후, 수조에 깨끗한 물을 부어 항아리를 밀봉한다. 서늘하고 통풍이 잘되는 곳에서 10일간 발효시켜, 본 발명에 사용되는 파오차이를 얻는다.
본 발명에 사용되는 락토바실러스 플란타럼 상업용 균주는 원하는 균주를 함유한 상업용 제품에서 분리되었으며, 구체적인 분리 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 1: 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 분리 및 동정
(1) 락토바실러스 플란타럼 균주 선별 배지 조성
개량된 MRS 고체 배지:
MRS 배지(OXOID사의 CM1163)에 0.05 g의 브로모크레졸 그린(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.), 1L의 이중증류수를 첨가하여 충분히 고르게 교반하였다. pH를 5.5로 조정하고, 121℃에서 20분 동안 멸균하여 준비해두었다.
(2) 락토바실러스 플란타럼 균주의 분리 및 선별
a. HOM 락토바실러스 플란타럼 균주의 분리 및 선별
1 g의 파오차이를 취하여, 9 mL의 0.9% 생리식염수로 파오차이즙을 제조하였다. 1 mL의 파오차이즙을 취하여, 10 배 희석법으로 희석도가 10-3~10-5이 되도록 샘플을 희석하고, 희석된 파오차이즙을 상기 개량된 MRS 평판에 도포하여 35℃에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 표면이 촉촉하고 매끄러우며, 가장자리가 깔끔하고, 유황색 또는 유백색 균락과 주변이 황색으로 변한 단일 균락을 선별하여, 획선 배양(streak culture) 및 정제하였다. 그람 염색과 현미경 검사를 동시에 진행하여 균락의 형태를 관찰하였다. 단일 균락을 MRS 액체 배지로 옮겨 순수 배양을 실시하고, 글리세린으로 보존하여, 총 5개의 락토바실러스 플란타럼을 분리하고, 각 균주를 각각 HOM3201, HOM3202, HOM3203, HOM3204, HOM3205로 명명하였다.
b. 락토바실러스 플란타럼 상업용 균주의 분리 및 선별
본 발명에 사용되는 락토바실러스 플란타럼 상업용 균주는 상업용 프로바이오틱스 제품에서 분리된 것으로, 균주 및 제품 정보로는 락토바실러스 플란타럼 Lp-115(Yineng 300에서 분리), 락토바실러스 플란타럼 LP-ONLLY(ONLLY 어린이 프로바이오틱스 분말에서 분리), 락토바실러스 플란타럼 P-8(Yishiyou에서 분리), 락토바실러스 플란타럼 CCFM8661(Yishenghemei에서 분리) 및 락토바실러스 플란타럼 ST-III(Guangchangyou 발효유에서 분리)이다.
락토바실러스 플란타럼 상업용 균주의 분리 방법: 락토바실러스 플란타럼이 함유된 상업용 균주 분말 또는 발효유 1 g을 취하여, 9 mL의 0.9% 생리식염수로 재현탁하였다. 1 mL의 샘플을 취하여, 10 배 희석법으로 샘플을 희석하고, 2~3개의 적절한 기울기 희석액을 선택하여 개량된 MRS 평판에 도포하여 35℃에서 72시간 동안 배양하였다. 표면이 촉촉하고 매끄러우며, 가장자리가 깔끔하고, 유황색 또는 유백색 균락과 주변이 황색으로 변한 단일 균락을 선별하여, 획선 배양 및 정제하였다. 그람 염색, 현미경 검사를 동시에 진행하여 균락의 형태를 관찰하였다. 단일 균락을 MRS 액체 배지로 옮겨 순수 배양을 실시하고, 글리세린으로 보존하였다.
(3) HOM 락토바실러스 플란타럼 균주의 동정
각 균주를 MRS 액체 배지에 접종하고, 35℃에서 48시간 동안 배양한 후, 각각의 균액에 대해 세균의 총 DNA를 추출하여 16S rDNA 증폭을 실시하고, 범용 프라이머 27F, 1492R을 이용하여 PCR 증폭 및 아가로스겔 전기영동을 실시한 후, 겔을 절단하여 회수하고, 시퀀싱(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.)하였다. 다음으로, BLAST 툴을 이용하여 NCBI 데이터베이스에서 비교한 결과, 위의 5개의 균주 HOM3201, HOM3202, HOM3203, HOM3204, HOM3205는 모두 락토바실러스 플란타럼인 것으로 동정되었다. 그 중 HOM3201의 16S rDNA는 서열번호 1로 표시된 바와 같다(도 5).
측정된 HOM3201의 16S rDNA의 서열은 다음과 같다.
CATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCAGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTA
(4) 락토바실러스 플란타럼 균주의 분자생물학적 특성 분석
무작위 증폭 다형성 DNA 마커(RAPD) 방법을 이용하여 획득한 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 락토바실러스 플란타럼 HOM3202, HOM3203, HOM3204 및 HOM3205 균주, 및 상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 Lp-115, LP-ONLLY, P-8, CCFM8661 및 ST-III 균주와 유전자형 비교 연구를 실시하여, 획득한 균주의 특이성을 결정하였다.
아래 표 1에 나타낸 프라이머 OPA-02, OPA-18, OPL-07, OPL-16 및 OPM-05를 선택하여 균주의 게놈 DNA를 무작위로 증폭하였다. 증폭 조건은 다음과 같다. 먼저 템플릿과 프라이머를 95℃에서 5분 동안 유지한 다음, 온도를 56℃로 낮추고, 반응 혼합물을 첨가하여, 94℃에서 1분 동안 변성, 30℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 2분 동안 확장하는 방식으로 45 사이클까지 증폭하였다. 서열번호 2 내지 8에 대하여 각각 도 6 내지 도 13에 설명이 기재된다.
프라이머 서열 서열번호
OPA-02 5'-TGCCGAGCTG-3' 2
OPA-18 5'-AGGTGACCGT-3' 3
OPL-07 5'-AGGCGGGAAC-3' 4
OPL-16 5'-AGGTTGCAGG-3' 5
OPM-05 5'-GGGAACGTGT-3' 6
27F 5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 7
1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 8
10 μL의 PCR 증폭 산물을 취하여 2% 아가로스겔 전기영동으로 검출한 후, 겔 이미저에서 이미지화하였다. 바이오뉴메릭 버전 6.6(Bionumerics version 6.6) 소프트웨어를 이용하여, UPGMA 방법을 기반으로 RAPD 맵을 집락 분석하였다. 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다.
일반적으로, 계통수에서 유사도가 90% 이상인 균주는 동일한 균주일 가능성이 있는 것으로 알려져있다. 본 실험의 계통수 결과 HOM3201 균주는 다른 락토바실러스 플란타럼과 같은 분지에 있지 않고, 유사도가 60% 미만으로 유의한 차이를 보였다. 따라서, HOM3202, HOM3203, HOM3204 및 HOM3205 균주와 상업용 균주 Lp-115, LP-ONLLY, P-8, CCFM8661 및 ST-III 균주에 비해, HOM3201 균주는 유전자형 특이성과 고유성을 가진다.
실시예 2: 위장 통과 능력 시험
(1) 균주의 분리 및 활성화
본 실험에서는 3개의 상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 299V(Jarrow 프로바이오틱스 제품에서 분리하였으며, 분리 방법은 실시예 1의 b. 락토바실러스 플란타럼 상업용 균주의 분리 방법과 동일), 실시예 1의 상업용 프로바이오틱스 제품에서 분리된 균주 락토바실러스 플란타럼 Lp-115 및 락토바실러스 플란타럼 ST-III을 양성 대조군으로 선택하였다. 각 균주를 각각 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 2회 활성화하여 준비해두었다.
(2) 인공 위액의 조제
16.4 mL의 묽은 염산과 10 g의 펩신을 취하고, 약 800 mL의 물을 첨가하여 고르게 흔들어준 후, pH를 3.0으로 조절하고, 일정 용량 1 L까지 물을 첨가한 후, 0.22 μm의 미세공 여과막으로 여과하여 준비해두었다.
(3) 인공 장액의 조제
6.8 g의 인산이수소칼륨을 취하고 500 mL의 물을 첨가하여 용해시키고, 0.1 mol/L의 수산화나트륨 용액으로 pH를 6.8로 조절한 후, 별도로 10 g의 판크레아틴을 취하고 물을 첨가하여 용해시킨 다음, 두 용액을 혼합하고, 1000 mL까지 물을 첨가하여 희석한 후, 0.22 μm의 무균 여과막으로 무균 환경에서 여과하여 준비해두었다.
(4) 균주의 모의 인공 위장액에서의 생존 능력 평가
각 균주의 균액을 1 mL씩 취하여 원심 분리 후, 균체를 수집하여 10 mL의 인공 위액에 넣고, 고르게 혼합한 직후 생균수를 계산하여 T0으로 기록하고, 37℃의 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한 후 생균수를 계산하여 T1로 기록하였다. 샘플을 원심 분리하고 10 mL의 인공 장액을 첨가하여 고르게 혼합한 후, 37℃의 인큐베이터에서 3시간 동안 배양하여 생균 계수를 실시하여 T2로 기록하였으며, 그 생존율은 아래 공식으로 계산하였다.
위액에서 3시간 생존율(%)=
장액에서 3시간 생존율(%)=
여기서, T0은 미처리 0시간 전 시험 균주의 생균수 CFU/mL이고; T1은 인공 위액으로 3시간 처리한 후의 시험 균주의 생균수이며; T2는 인공 위액으로 3시간 처리하고, 인공 장액으로 3시간 처리한 후의 시험 균주의 생균수이다.
표 2. 락토바실러스 플란타럼의 모의 인공 위장액에서의 생존율(±SD)
균주 명칭 위액에서 3시간
생존율(%)		 P값 장액에서 3시간
생존율(%)		 P값
HOM3201 118.87±1.09% - 122.59±0.38% -
299V 105.19±0.41%** 0.004 93.74±4.01%* 0.010
Lp-115 91.21±0.54%** 0.001 99.16±1.19%** 0.001
ST-III 94.05±0.43%** 0.001 91.27±0.20%** 0.000
*: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.05)
**: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.01)
표 2를 통해, 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 3시간의 모의 인공 위액 처리를 거친 후, 생존율이 118.87%에 달할 수 있고, 균주를 계속하여 3시간의 모의 인공 장액으로 처리한 후에도, 그 생존율이 여전히 122.59% 이상에 달할 수 있는 것을 볼 수 있으며, 이는 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주가 위장에서 비교적 높은 생존율을 지닌다는 것을 설명한다.
시판되는 락토바실러스 플란타럼 299V, LP-115, ST-III 균주와 비교하여, 락토바실러스 플란타럼 HOM3201의 위액 내성은 시판되는 락토바실러스 플란타럼 299V, LP-115, ST-III 균주보다 높으며, 유의하거나 매우 유의한 차이를 보였다.
실시예 3: 일반 병원균 억제 능력 시험
(1) 병원균 활성화
본 시험에서는 5종의 병원균을 선택하였다. 대장균(E. coli) ATCC8739, 쥐장티푸스균(Salmonella typhimurium) ATCC14028, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) ATCC6538, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) ATCC9027, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) ATCC19111. 이들 병원성 균주는 ATCC(아메리칸 타입 컬처 컬렉션, American type culture collection)에서 구입하였다.
병원성 균주를 각각 영양 한천 배지에 접종하고, 37℃에서, 200 rpm에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 지시균을 신선한 배지에서 OD=0.1로 조정하여 준비해두었다.
(2) 유산균 균주 활성화
본 실험에서는 상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 299V(분리 방법은 실시예 1 및 2와 동일함), Lp-115(분리 방법은 실시예 1과 동일함), ST-III 균주(분리 방법은 실시예 1과 동일함) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG 균주를 대조 균주로 선택하였으며, 그 중 GG 균주는 컬쳐렐(Culturelle) 균 분말 제품에서 분리되었으며, 분리 방법은 실시예 1과 동일하였다.
각 균주를 각각 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정치 배양하고, 2회 활성화 후 균주 발효액을 획득하였다. 11000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고, 상청액을 취하여 균 억제 시험을 실시하였으며, MRS 액체 배지를 음성 대조군으로 하였다. 참고: 유산균은 락토바실러스와 비피더스균을 포함하는 대규모 집단을 총칭하는 용어이다.
(3) 평판 제조
멸균된 영양 한천 배지를 배양 접시에 담고, 100 μL의 지시균액을 배지에 첨가하여 고르게 혼합한 후, 정치 상태로 응고시켰다.
(4) 균 억제 실험
무균 집게로 옥스포드 컵을 평판 위에 가볍게 올려놓고, 웰 사이에 일정한 거리를 유지하였다. 웰에 각각 150 μL의 발효 상청액을 첨가한 후, 4℃의 냉장고에서 12시간 동안 확산시키고, 37℃의 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하여, 억제대(inhibition zone)의 직경을 관찰하고 측정하였다.
표 3. 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 병원균에 대한 억제 효과
균주 명칭 균 억제 효과 등급
대장균 티푸스균 황색
포도상구균		 녹농균 리스테리아 모노사이토제네스
HOM3201 ++ + ++ ++ ++
299V ++ ++ + ++ ++
Lp-115 ++ ++ ++ ++ +
ST-III ++ ++ ++ ++ ++
GG ++ + + ++ +
배지 대조 - - - - -
참고: “-” 균 억제 활성 없음, ＜11 mm; “+” 11 mm≤ 억제대 ＜16 mm; “++” 16 mm≤ 억제대 ＜23 mm;“+++” ≥23 mm
표 3을 통해 락토바실러스 플란타럼 HOM3201가 5종의 병원균에 대해 모두 억제 작용이 있다는 것을 알 수 있다. 상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 299V, Lp-115, ST-III 균주 및 락토바실러스 람노서스 GG 균주와 비교하여 균 억제 능력은 비슷하다.
실시예 4: 항생제 감수성 시험
약물 감수성 시험은 미국 임상검사표준위원회(NCCLS)가 추천하는 K-B 한천법에 따라 실시하였으며, 방법은 다음과 같다.
(1) 상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 299V, Lp-115, ST-III 균주(실시예 3과 동일함)를 대조 균주로 선택하였다. 균주를 각각 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하며, 3세대 동안 연속적으로 활성화하였다.
(2) 멸균 배양접시에 1 mL의 균액(1.5×108 CFU/mL), 15 mL의 MRS 고체 배지를 취하여 균일하게 혼합하고, 평판이 응고된 후 표준 항생제 약물 감수성 종이를 붙이고, 37℃에서 24~48시간 동안 배양한 후 억제대 직경을 측정하고 기록하였다. CLSI 판정 표준에 따라 판독한 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.
표 4. 유산균 균주의 9종 항생제 감수성에 대한 측정 결과
항생제 명칭 CLSI 표준 HOM3201 299V Lp-115 ST-III
R I S
반코마이신 / / 15 R R R R
젠타마이신 12 13-14 15 R R R R
클로람페니콜 12 13-17 18 S S S S
스트렙토마이신 11 12-14 15 R R R R
테트라사이클린 14 15-18 19 S I R S
카나마이신 13 14-17 18 R R R R
클린다마이신 15 16-17 18 R R R R
암피실린 28 29 S R R S
에리트로마이신 13 14-22 23 S S S S
S(susceptible)는 감수성을 나타내고; I(intermediate)는 중간을 나타내며; R(resistance)은 약물 내성을 나타낸다.
표 4를 통해, HOM3201 균주는 반코마이신, 젠타마이신, 스트렙토마이신, 카나마이신, 클린다마이신에 대해 내약품성을 보이고, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 암피실린 및 에리트로마이신에는 민감하다는 것을 알 수 있다. 상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 299V, Lp-115, ST-III 균주와 비교하여, HOM3201은 비정상적인 내약품성이 발견되지 않았다.
실시예 5: 항산화 활성 검출 시험
(1) 락토바실러스 플란타럼 균주 활성화
상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 Lp-115, ST-III 균주(분리 방법은 실시예 1과 동일함)를 양성 대조군으로 선택하였다. 각 균주를 MRS 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정치 배양하며, 3세대 동안 활성화하고, 원심 분리 후 균주 농도를 3×1010 CFU/mL로 조정하여 준비해두었다.
(2) 항산화 활성 측정
지표는 총 항산화 능력 측정(T-AOC), 하이드록실 자유래디컬 제거 측정(ㆍOH), DPPH 자유래디컬 제거 측정을 포함한다. 앞의 2개의 지표는 Nanjing Jiancheng Company로부터 구매한 키트를 이용하여, 조작 설명서에 따라 측정하였다. DPPH 자유래디컬 제거 시험은 비색법을 이용하였으며, 그 원리는 자유래디컬 제거제가 하나의 전자를 제공하여 DPPH 자유래디컬의 비공유 전자쌍과 쌍을 이룸으로써, 스스로 보라색에서 황색으로 변하고, 517 nm 파장에서의 흡광도가 작아지는 것으로, 그 변화 정도는 자유래디컬의 제거 정도와 선형 관계를 이루며, 즉, 자유래디컬 제거제의 제거 능력이 강할수록, 흡광도가 작아진다. 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
표 5. 락토바실러스 플란타럼 균주 체외 항산화 활성 측정(±SD)
균주 명칭 T-AOC(U/mL) ·OH 제거율(%) DPPH 제거율(%)
HOM3201 8.88 ±0.35 69.34% ±3.86% 87.72% ±0.79%
Lp-115 3.15 ±0.09** 64.87% ±0.31% 77.18% ±3.17%*
ST-III 13.88 ±0.09** 68.09% ±3.93% 83.04% ±3.39%
*: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.05)
**: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.01)
표 5를 통해, 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주가 총 항산화 능력, 하이드록실 자유래디컬 제거, DPPH 자유래디컬 제거 측면에서의 성능이 특출나다는 것을 알 수 있다. T-AOC 측면에서, Lp-115 균주와 비교하여, HOM3201 균주는 성능이 우수하고, 매우 유의한 차이가 있으며; 하이드록실 자유래디컬 제거 측면에서, 세 그룹 사이에는 큰 차이가 없으며; DPPH 자유래디컬 제거 측면에서, Lp-115 균주와 비교하여, HOM3201 균주는 제거율이 비교적 높고, 유의한 차이가 있으며; ST-III 균주와 비교하여, 큰 차이가 없다.
실시예 6: 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주 활성균 분말의 제조 공정
(1) 균종의 배양
락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여, 2세대 동안 활성화하였다. 발효 배지(표 6에 나타낸 바와 같음)에 접종하고, 37℃에서 배양하였으며, 생균수는 2×1010 CFU/mL 이상에 달할 수 있다.
표 6. 발효 배지 조성
배지 성분 함량(g/L)
포도당 40
효모 추출물 40
아세트산나트륨 삼수화물 10
황산마그네슘 0.2
인산수소이칼륨 2
시트르산삼암모늄 4
트윈-80 1
(2) 냉동 동결 건조 보호제의 제조
무균수와 보호제 원료를 혼합하여 100 g/L의 탈지 분유, 50 g/L의 트레할로스, 3 g/L의 비타민 C, 5 g/L의 L-글루탐산나트륨을 함유한 보호제를 제조하였다.
(3) 동결 건조
락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주 발효 균액을 원심 분리하고 균 슬러지(sludge)를 수집하여, 0.9%의 무균 생리식염수로 균 슬러지를 세척한 다음, 균 슬러지를 상기 보호제와 혼합하여, 균액의 농도가 1010 CFU/mL 이상이 되도록 하고, 동결건조기 내에서 동결 건조시킨 후, 정밀 분쇄기로 균 덩어리를 분쇄 처리하여 상기 동결 건조 균 분말을 획득하였으며, 동결 건조 균 분말 생균수는 6.0×1011 CFU/g이다.
실시예 7: 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 체외 혈당 강하 효능 및 메커니즘 탐색
(1) 개량된 버전의 MRS 액체 배지 구성
MRS 배지(OXOID)에 완제품 배지를 기준으로 0.05%의 L-시스테인 염산염을 첨가하고 균일하게 교반한 후, 121℃에서 20 분 동안 멸균하여 준비해두었다.
(2) 균종 활성화 및 샘플 처리
상업용 균주 락토바실러스 플란타럼 299V, Lp-115, ST-III(분리 방법은 실시예 1과 동일함) 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) ADR1 균주를 양성 대조군으로 선택하였으며, ADR-1 균주는 탕메이러(Tangmeile) 제품에서 분리되었으며, 분리 방법은 실시예 1과 동일하다.
각 균주를 각각 1%의 접종량으로 신선한 개량된 버전의 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정치 혐기성 배양하여, 3세대 동안 활성화하였다. 균액을 8000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하고, 인산완충용액(PBS)으로 3회 세척하였다. 생균수를 4×1010 CFU/mL로 조절하고, 8시간 동안 혐기성 배양한 후, 8000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하고, 상청액을 취하여 준비해두었다.
(3) DPP-4 억제성 및 α-글루코시다아제 억제성 선별
DPP-4 억제제 선별 키트(Abnova # KA1311) 및 α-글루코시다아제 억제제 선별 키트(Biovision # K938)를 사용하여 혈당 강하 기능을 위한 체외 선별을 실시하였다. 유산균 샘플의 상기 두 종류의 효소에 대한 억제율 계산하였다(결과는 도 2에 나타낸 바와 같음).
표 7. 각 균주의 DPP-4에 대한 억제율 및 α-글루코시다아제에 대한 억제율(±SD)
균주 DPP-4 억제율(%) P값 α-클루코시다제 억제율(%) P값
HOM3201 21.03% ± 1.62% - 16.57%±2.77% -
ADR-1 9.24% ± 1.28%* 0.015 22.54%±3.50% 0.199
299V 8.90% ± 0.92%* 0.012 15.24%±0.71% 0.580
Lp-115 15.97% ± 3.59% 0.211 15.88%±0.61% 0.766
ST-III 15.53% ± 2.14% 0.101 11.50%±0.84% 0.132
*: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.05)
표 7을 통해, HOM3201 균주는 DPP-4 및 α-글루코시다아제에 대해 비교적 높은 억제율을 가진다는 것을 알 수 있다. DPP-4 억제 측정에서, HOM3201 균주군은 다른 군보다 높았고, HOM3201군은 ADR-1, 299V 균주군과 비교하여 유의한 차이(P<0.05)를 보였다. α-글루코시다아제 억제 측정에서, HOM3201 균주군은 ADR-1 군보다 낮았으나, 다른 군보다 높았다. 임상 문헌 연구에 따르면, 락토바실러스 루테리 ADR-1 균주는 혈당을 낮추는 효능이 있다. 요약하면, HOM3201 균주는 더 높은 수준의 DPP-4 억제제 및 α-글루코시다아제 억제제를 생성하여 혈당 수치를 낮추는 목적을 달성할 수 있다(도 2).
실시예 8: NCI-H716 세포가 GLP-1을 분비하도록 자극하는 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주
(1) NCI-H716 세포의 배양
본 실험에서는 NCI-H716 세포(중국과학원 세포은행에서 구입)를 선택하였으며, NCI-H716 세포는 10%의 소태아혈청(Hyclone), 1%의 이중항체(페니실린 및 스트렙토마이신, Hyclone)를 함유한 RPMI-1640(Gibco) 배지에서 성장하고, 세포는 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 현탁 성장하였다.
(2) 유산균 균주의 배양
3종의 상업용 균주(락토바실러스 루테리 ADR-1, 락토바실러스 람노서스 GG 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CECT8145)를 양성 대조군으로 선택하였다. 비피도박테리움 락티스 CECT8145 균주는 ADM사에서 기증한 균 분말에서 분리되었다.
비피도박테리움 락티스 CECT8145 분리 방법: 1 g의 균 분말을 취하여 9 mL의 0.9% 생리식염수로 재현탁하였다. 1 mL의 샘플을 취하여, 10 배 희석법으로 샘플을 희석하고, 2~3개의 적절한 기울기 희석액을 선택하여 TOS(Merck, 1.00043.0500) 평판에 도포하여 37℃에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 표면이 촉촉하고 매끄러우며, 가장자리가 깔끔하고, 유백색의 단일 균락을 선별하여, 획선 배양 및 정제하였다. 그람 염색, 현미경 검사를 동시에 진행하여 균락의 형태를 관찰하였다. 단일 균락을 MRS+0.5% 시스테인 염산염(Sigma, 1161509) 액체 배지로 옮겨 순수 배양을 실시하고, 글리세린으로 보존하였다.
락토바실러스 플란타럼 HOM3201, 락토바실러스 루테리 ADR-1, 락토바실러스 람노서스 GG를 각각 MRS 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정치 배양하여, 3세대 동안 활성화하였으며; 비피도박테리움 락티스 CECT8145를 MRS+0.5% 시스테인 염산염 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 정치 혐기성 배양하여, 3세대 동안 활성화하였으며; 각 균액을 8000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고, Krebs 버퍼(Sigma)로 3회 세척하였다. 생균수를 1×1010 CFU/mL로 조정하여 준비해두었다.
(3) GLP-1 내분비 실험
NCI-H716 세포를 1.5×106 개/웰의 밀도로 마트리젤(Matrigel)이 코팅된 24웰 플레이트(Corning)에 접종하고, 내분비 분화 배지에 첨가하여, 37℃에서, 5% CO2의 인큐베이터에서 2일 동안 배양하여, 내분비 분화 실험을 실시하였다. 내분비 분화 배지는 10%의 소태아혈청, 1%의 이중항체를 함유하는 고당의 DMEM(Gibco) 배지이다.
2일 후, DMEM 배지는 Krebs-Ringer 버퍼로 대체하였고, 버퍼에는 각각 1×1010 CFU/mL의 프로바이오틱스 균주가 함유되며, 2시간 동안 배양 후, 8000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액에 50 μg/mL의 페닐메틸설포닐 플루오라이드(Roche) 및 10 μg/mL의 시타글립틴(Sigma)을 첨가한 다음, ELISA 키트(Raybiotech)를 사용하여 GLP-1의 농도를 검출하였다.
표 8. 각 균주가 NCI-H716 세포를 자극하여 GLP-1을 분비한 산출량(±SD)
균주 GLP-1(pg/mL) P값
락토바실러스 플란타럼 HOM3201 1890.21 ±158.38 -
락토바실러스 루테리 ADR-1 36.02±4.43** 0.004
락토바실러스 람노서스 GG 662.07±74.91* 0.010
비피도박테리움 락티스 CECT8145 939.28±28.16* 0.014
*: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(P<0.05)
**: HOM3201 군과 비교하여 유의한 차이가 있다(P<0.01)
3종의 상업용 균주(락토바실러스 루테리 ADR-1, 락토바실러스 람노서스 GG 및 비피도박테리움 락티스 CECT8145)는 모두 혈당을 낮추는 관련 연구를 설명하는 문헌을 가지고 있다.
표 8을 통해, HOM3201 균주는 NCI-H716 세포를 자극하여 높은 함량의 GLP-1을 분비할 수 있으며, 농도는 1890.21±158.38 pg/mL에 도달한다는 것을 알 수 있다. 락토바실러스 루테리 ADR-1과 비교하여, HOM3201 균주는 매우 유의한 차이(p<0.01)를 보였으며; 락토바실러스 람노서스 GG 및 비피도박테리움 락티스 CECT8145와 비교하여, HOM3201 균주는 유의한 차이(p<0.05)를 보였다. 결과에 따르면, 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 혈당을 낮추는 효능이 있으며, 혈당 강하 메커니즘은 장내 L 세포를 자극하여 높은 함량의 GLP-1을 생성하는 것일 수 있다.
실시예 9: 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주가 알록산에 의해 유도된 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 혈당에 미치는 영향
(1) Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd.[허가 번호: SCXK-(경)2019-0008]에서 번식된 140 g~160 g의 건강한 SPF 등급 SD 수컷 랫트 46마리를 선택하였고, 실험 동물은 북경연합대학교 예술과학원 건강식품기능검출센터 SPF 등급 동물실에서 사육하였으며, 실험 동물 사용 허가 번호는 SYXK(경)2017-0038이다. 모두 두 그룹으로 나누어 실험을 실시하였다. 실험 첫 번째 그룹은 10마리의 랫트를 대상으로 정상 랫트의 공복 혈당에 미치는 영향에 대한 실험; 실험 두 번째 그룹은 36마리의 랫트를 대상으로 알록산 유도 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 실험; 내당능 실험; 혈청 트리글리세리드, 총 콜레스테롤 실험; 혈청 인슐린 실험을 실시하였다. 그 중 고열량 사료의 조성: 52.6%의 기본 사료, 15%의 자당, 15%의 난황 분말, 10%의 라드, 5%의 카제인, 1.2%의 콜레스테롤, 0.2%의 소디움 콜레이트, 0.6%의 중탄산칼슘, 0.4%의 석분.
(2) 정상 랫트의 공복 혈당에 미치는 영향에 대한 실험: 일반 사료에 적응시켜 3일 동안 사육하고, 4시간 금식 후, 채혈하고, 10 분 동안 정치한 후, 3000 rpm/min에서 10 분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하며, 생화학 분석기를 이용하여 포도당 투여 전(즉, 0h) 혈당 수치, 2.5 g/kg의 BW 포도당을 투여한 후 0.5h, 2h 혈당 수치를 측정하여 해당 그룹의 동물 기본값으로 하였다. 정상 대조군(0 CFU/마리)과 HOM3201군 (5x1010 CFU/kg BW)을 설정하고; 각 군에는 5마리의 랫트가 있으며, 시험 종료 후, 각 군의 랫트는 4시간 동안 금식시키고, 내안각정맥총에서 채혈하며, 생화학 분석기를 이용하여 공복 혈당 수치를 검출하는 동시에, 초기 및 종료 시 랫트의 체중을 측정하였다.
표 9. 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주가 정상 랫트 체중에 미치는 영향(±SD)
군 랫트수
(마리)		 시험 전 시험 후
체중(g) P 값 체중(g) P 값
대조군 5 237.9±21.0 - 442.5±22.6 -
HOM3201 균주군 5 240.3±8.4 0.817 459.4±39.4 0.431
표 9를 통해 정상 랫트의 실험 전후 체중을 두 군 간에 비교한 결과 유의한 차이가 없음(P>0.05)을 알 수 있다.
표 10. 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주가 정상 랫트의 공복 혈당에 미치는 영향(±SD)
군 랫트수 시험 전 시험 후
(마리) 혈당 수치(mmol/L) P 값 혈당 수치(mmol/L) P 값
대조군 5 7.4±0.7 - 7.4±0.3 -
HOM3201 균주군 5 7.7±0.6 0.574 7.5±0.5 0.764
표 10을 통해, 두 군 간의 실험 전후 혈당 수치는 유의한 차이가 없다(P>0.05)는 것을 알 수 있다.
(3) 알록산에 의해 유도된 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 실험: 블랭크 대조군, 모델군 및 HOM3201 균주군을 설정하고, 각 군에는 12마리의 랫트가 있으며, HOM3201 균주군의 위내 투여량은 5×1010 CFU/kg BW로 하였다. 피시험물은 위내 투여법을 사용하여 0.5 mL/마리를 투여하고, 블랭크 대조군, 모델 대조군에는 동일한 부피의 생리식염수를 1일 1회 위내 투여하였다. 각 군에 기본 사료를 1주일 동안 먹인 후, 모델 대조군과 HOM3201 균주군은 고열량 사료로 교체하였고, 각 군에 3주 동안 계속하여 먹인 후, 모델 대조군과 HOM3201 균주군을 24시간 동안 금식시키고, 105 mg/kg BW의 알록산을 복강내 주사하며, 주사량은 1 mL/100 g 체중으로 하였다. 주사 후 고열량 사료를 계속하여 5 일 동안 먹였다. 시험 종류 후, 각 군의 랫트는 4시간 동안 금식시키고, 채혈하여 공복 혈당, 내당능, 혈청 인슐린, 총 콜레스테롤, 트리글리세리드 수치를 측정하였다.
표 11. 랫트 체중 측정(±SD)
군 랫트수 시험 전 시험 후
체중(g) P값 체중(g) P값
블랭크 대조군 12 236.4±15.2 - 460.4±45.6 -
모델 대조군 12 241.1±15.2 0.402 465.6±42.5 0.750
표 11을 통해, 모델 대조군은 블랭크 대조군과 비교하여 실험 전후 랫트의 체중이 현저한 차이가 없다는 것을 알 수 있다.
표 12. 당지질 대사 장애 모델 랫트의 혈당 및 내당능(±SD)

군
랫트
수		 혈당 수치(mmol/L)
0h P값 0.5h P값 2h P값
블랭크 대조군 12 7.4±0.6 - 8.8±1.0 - 7.0±1.2 -
모델 대조군 12 8.4±0.5** 0.000 10.2±1.5** 0.005 7.7±0.9 0.089
**: 블랭크 대조군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.01)
표 13. 당지질 대사 장애 모델 랫트의 혈중 지질 및 인슐린 저항성 지수(±SD)
군 랫트수 총 콜레스테롤
(mmol/L) 		P값
 트리글리세리드(mmol/L) P값 인슐린 저항 지수 P값
블랭크 대조군 12 2.0±0.2 - 1.6±0.6 - 2.78±0.47 -
모델 대조군 12 2.4±0.5* 0.032 1.7±0.5 0.634 3.08±0.28* 0.048
*: 블랭크 대조군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.05)
표 12 및 표 13을 통해, 모델 대조군은 블랭크 대조군과 비교하여, 포도당 투여 후 0시간, 0.5시간 혈당 수치에는 매우 유의한 차이(P<0.01)를 보였으며, 모델 대조군은 0.5시간 혈당 수치가 ≥10 mmol/L로, 모델 당 대사 장애가 확립되었다는 것을 알 수 있다. 모델 대조군은 블랭크 대조군과 비교하여, 혈청 총 콜레스테롤 상승에 유의한 차이(P<0.05)를 보였고, 지질 대사 장애 모델이 확립된 것으로 판단되며; 모델 대조군은 블랭크 대조군과 비교하여, 인슐린 저항성 지수가 현저히 감소되어(P<0.05), 인슐린 저항성 당/지질 대사 장애 모델이 성공적이라고 종합적으로 판단하였다.
표 14. HOM3201 균주가 모델 랫트 체중에 미치는 영향(±SD)
군 랫트수
(마리)		 시험 전 시험 후
체중(g) P 값 체중(g) P 값
모델 대조군 12 241.1±15.2 - 465.6±42.5 -
HOM3201 균주군 12 237.7±15.9 0.552 458.6±31.5 0.616
표 15. HOM3201 균주가 모델 랫트의 공복 혈당에 미치는 영향(±SD)
군 랫트수 시험 전 시험 후
(마리) 혈당 수치 P 값 혈당 수치 P 값
모델 대조군 12 7.1±0.7 - 8.3±0.4 -
HOM3201 균주군 12 7.1±0.6 0.980 7.9±0.4* 0.012
*: 모델 대조군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.05)
표 16. HOM3201 균주가 모델 랫트 내당능에 미치는 영향(±SD)
군 랫트
수		 포도당 투여 후 혈당 수치
0h P값 0.5h P값 2h P값
모델 대조군 12 8.3±0.4 - 10.0±1.1 - 7.5±0.5 -
HOM3201 균주군 12 7.9±0.4* 0.012 9.3±0.4 0.073 7.6±0.6 0.616
*: 모델 대조군과 비교하여 유의한 차이가 있다(p<0.05)
표 15 및 표 16을 통해, 0시간에 두 그룹 간의 혈당 수치가 유의한 차이가 있고(p<0.05), 0.5시간에 HOM3201군의 혈당이 감소하는 추세를 보였으나, 유의한 차이는 없다(p＞0.05)는 것을 알 수 있다. 2시간에, 두 그룹 간에는 현저한 차이가 없다. 이는 HOM3201 프로바이오틱스가 모델 랫트의 공복 혈당을 유의하게 감소시키고, 0.5시간에 식후 혈당 수치를 감소시키며, 혈당 내성을 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다(도 3).
표 17. HOM3201 균주가 모델 랫트의 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드에 미치는 영향(±SD)
군 랫트수 콜레스테롤
(mmol/L)		 P값
 트리글리세리드
(mmol/L)		 P값
모델 대조군 12 2.4±0.5 - 1.7±0.5 -
HOM3201 균주군 12 2.4±0.5 0.981 1.6±0.6 0.447
표 17을 통해, 모델 대조군과 비교하여 HOM3201 균주군의 혈청 콜레스테롤과 트리글리세리드에는 유의한 차이가 없다(P>0.05)는 것을 알 수 있다.
표 18. HOM3201이 모델 랫트의 혈청 인슐린 저항성 지수에 미치는 영향(±SD)
군 랫트수 인슐린 저항 지수 P값
모델 대조군 12 3.05±0.18 -
HOM3201군 12 2.94±0.29 0.253
표 18통해, 모델 대조군과 비교하여, HOM3201 균주군의 혈청 인슐린 저항성 지수는 감소하였으나, 유의한 차이는 없다(P>0.05)는 것을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 분리, 선별, 제제의 제조, 체외 및 동물 실험에서 혈당 강하 효과의 과정 흐름도를 나타낸다.
이상은 본 발명의 바람직한 실시형태일 뿐이며, 본 발명의 원리를 벗어나지 않으면서 당업자는 일부 개선 및 수정을 할 수 있으며, 이러한 개선 및 수정은 본 발명의 보호 범위로 간주되어야 함에 유의해야 한다.
본 발명의 실시형태는 상술한 바와 같이 개시되었으나, 명세서 및 실시형태에 기재된 운용에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 적합한 다양한 분야에 적용될 수 있고, 당업자에 의해 별도의 수정을 용이하게 실현할 수 있으므로, 청구항 및 동등 범위에 의해 한정된 일반적인 개념을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명은 특정 세부사항 및 여기서 제시되고 기술된 세부사항에 한정되지 않는다.
China General Microbiological Culture Collection Center CGMCC22700 20210611

Claims (10)

  1. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) HOM3201 균주로서,
    상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 기탁 번호는 CGMCC No.22700인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주.
  3. 제1항에 따른 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 포함하는 생균 제제.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 생균 제제는 최대 4.0~8.0×1011 CFU/g의 생균을 포함하는 것을 특징으로 하는 생균 제제.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생균 제제.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 생균 제제를 포함하는 식품 또는 건강기능식품.
  7. 혈당 강하 보조용 약물의 제조에서 제1항에 따른 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주의 용도.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 인슐린 저항성 당 대사 장애/지질 대사 장애 모델 랫트의 공복 혈당 수준을 낮추고, 포도당에 대한 유기체의 내성을 증가시키며, 인슐린 저항성 지수를 감소시키는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주는 당뇨병의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 생균 제제의 제조 방법으로서,
    제1항에 따른 락토바실러스 플란타럼 HOM3201 균주를 최적화된 액체 배지에서 확대 배양하는 단계;
    균체를 수집하는 단계; 및
    보호제를 첨가하여 재현탁하고, 진공 동결 건조하고 분쇄하여 활성균제를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
KR1020230055044A 2022-04-29 2023-04-26 락토바실러스 플란타럼 hom3201 균주 및 이의 생균 제제, 제조 방법 및 용도 KR20230154400A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210472568.8A CN114752529B (zh) 2022-04-29 2022-04-29 植物乳杆菌hom3201菌株及其活菌制剂、制备方法和用途
CN202210472568.8 2022-04-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230154400A true KR20230154400A (ko) 2023-11-08

Family

ID=82333809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020230055044A KR20230154400A (ko) 2022-04-29 2023-04-26 락토바실러스 플란타럼 hom3201 균주 및 이의 생균 제제, 제조 방법 및 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230154400A (ko)
CN (1) CN114752529B (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350547B (zh) * 2021-12-17 2023-05-16 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种乳双歧杆菌菌株b-622及其在制备治疗糖尿病药物中的应用
CN116200310B (zh) * 2023-03-17 2024-01-30 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种调节肠道激素glp-1水平的益生菌剂及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107502575B (zh) * 2017-09-20 2020-12-22 中国农业科学院农产品加工研究所 一株具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的植物乳杆菌
CN107475160B (zh) * 2017-09-20 2020-10-23 中国农业科学院农产品加工研究所 具有双重降糖靶点的植物乳杆菌及其应用
CN109810912B (zh) * 2017-11-21 2023-05-23 深圳华大基因农业控股有限公司 一株植物乳杆菌lh-511及其应用
CN108085285B (zh) * 2018-01-25 2019-02-01 吉林省命之元生物科技有限公司 一株植物乳杆菌dm-50株及其应用
CN110964659A (zh) * 2019-08-02 2020-04-07 四川大学 降血糖功效的植物乳杆菌及其筛选方法和应用药剂及食品
CN113061543B (zh) * 2020-01-02 2023-04-21 北京科丽科技有限公司 一种植物乳杆菌及其用途
CN114276953A (zh) * 2021-07-21 2022-04-05 重庆誉研生物科技有限公司 一株能抑制肠道细胞dpp-4活性的植物乳杆菌ye4及其缓解糖尿病的应用
CN114317353B (zh) * 2021-12-30 2023-09-15 浙江大学 一种植物乳杆菌zjufyj7及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114752529A (zh) 2022-07-15
CN114752529B (zh) 2023-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105132318B (zh) 植物乳杆菌Grx16及其应用
CN108102959B (zh) 人源性降胆固醇植物乳杆菌zy08及其应用
CN108728382B (zh) 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用
RU2758109C2 (ru) Бактерия lactobacillus rhamnosus для лечения, например, бактериального вагиноза
KR20230154400A (ko) 락토바실러스 플란타럼 hom3201 균주 및 이의 생균 제제, 제조 방법 및 용도
CN112143680B (zh) 具有抗氧化功效副干酪乳杆菌zjuids05及其应用
CN111925961B (zh) 一株植物乳杆菌Lp2及其应用
CN111849810B (zh) 拮抗幽门螺旋杆菌的乳酸菌zjuids03及其应用
CN114634901B (zh) 一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌lc16及其培养方法与应用
CN114292766B (zh) 一种具有降糖能力的格氏乳杆菌及其应用
CN110157645B (zh) 一种唾液乳杆菌y4及其应用
CN110564638A (zh) 一株具有益生特性的罗伊氏乳杆菌及其用途
KR102001994B1 (ko) 면역 활성, 항바이러스 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 페디오코커스 펜토사세우스 srcm102736 균주 및 이의 용도
KR20210088408A (ko) 락토바실러스 플란타럼 및 그의 용도
CN116004456B (zh) 一株抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌a21325及其应用
CN113462613A (zh) 降血糖植物乳杆菌zjuids04及其应用
CN117327608A (zh) 鼠李糖乳杆菌菌株及其用途
CN115927045B (zh) 具有降胆固醇、缓解由高脂血症引起肝损伤功能的唾液乳杆菌069及其应用
CN114642686B (zh) 一种复合益生菌及其延缓衰老和抗氧化的作用
JP6033290B2 (ja) チャノキ葉から分離した新規なラクトバチルス・プランタラム
KR102001992B1 (ko) 면역 활성, 항바이러스 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 페디오코커스 애시디락티시 srcm102607 균주 및 이의 용도
CN114806953B (zh) 一种具有改善1型糖尿病特性的格氏乳杆菌
CN114410531B (zh) 降低血浆tmao及缓解、预防动脉粥样硬化的长双歧杆菌ccfm1216及其应用
WO2019174002A1 (zh) 戊糖片球菌ccfm1012、其发酵食品及其在制备拮抗空肠弯曲杆菌感染药物中的应用
CN113430153B (zh) 降血压的罗伊氏乳杆菌zjuids09及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal