CN114276953A - 一株能抑制肠道细胞dpp-4活性的植物乳杆菌ye4及其缓解糖尿病的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株能抑制肠道细胞DPP‑4活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YE4，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2021373。还公开了一种活性成分包含YE4的菌剂，以及YE4和所述菌剂在制备抑制DPP‑4的试剂中的应用、在制备用于预防和/或治疗糖尿病产品中的应用、在制备食品、食品添加剂、保健品或药品中的应用。YE4的CFE的DPP‑4抑制率达到24.33％，同时YE4‑CFE能显著抑制Caco‑2细胞中DPP‑4基因的mRNA表达。YE4可用于制备抑制肠道细胞DPP‑4活性及缓解和治疗糖尿病的保健食品和药品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株能抑制肠道细胞DPP-4活性的植物乳杆菌 YE4及其缓解糖尿病的应用。
背景技术
Ⅱ型糖尿病作为一种由代谢综合征发展而来的疾病，已经成为十分重要的全球健康问 题，据国际糖尿病联盟第九版发布的数据显示我国已经成为糖尿病患者人数最多的国家， 并且这一现象预计将持续到2045年。Ⅱ型糖尿病伴随着很多并发症，对患者的生命健康 带来了很大的困扰。
二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)是一种在肠上皮细胞管腔表面大量表达 的丝氨酸蛋白酶，它可在餐后阶段切割和灭活GLP-1和GIP导致他们的促胰岛素活性丧 失，这些激素有助于对体内餐后血糖浓度的生理控制。所以DPP-4抑制剂已经被证明是 治疗Ⅱ型糖尿病的关键靶点。但合成的DPP-4抑制剂具有一些不良作用，例如轻度感染 和头痛，因此近年来从天然来源中筛选DPP-4抑制剂备受关注。
由于乳酸菌大多来源于可食性物质，具有天然性和安全性的特点，因此乳酸菌已快速 发展为改善糖尿病的研究热点。目前益生菌在降低血糖、缓解胰岛素抵抗，促进血浆中胰 岛素水平，胰岛素分泌和胰岛素信号传导途径中的作用已被多次研究。近年来，有学者通 过使用纯化的猪源或人重组DPP-4筛选具有DPP-4抑制活性的乳酸菌。目前已证明DPP-4 在肠细胞，包括结直肠癌Caco-2细胞的腔表面大量表达，也有研究使用Caco-2细胞分析 具有DPP-4抑制活性的肽类物质。相比之下，Caco-2细胞检测DPP-4活性比化学方法测试更有优势，可以在更接近肠道的环境中检测DPP-4并考虑可能的代谢影响。因此，将 具有抑制Caco-2细胞中DPP-4活性的乳酸菌开发为功能性制剂具有广阔的前景，值得深 入研究。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种能抑制肠道细胞DPP-4活性的植物乳杆菌 YE4及其应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一株能抑制肠道细胞DPP-4活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YE4，在中 国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2021373，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期为2021年4月14日，分类名为植 物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
本发明还提供了一种菌剂，其活性成分包含上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4。
上述菌剂，其活性成分包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YE4的细胞内容物。
优选地，所述细胞内容物为冷冻干燥粉剂。
本发明还提供了上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YE4，或上述任意所述 的菌剂，在制备抑制DPP-4的试剂中的应用。
优选地，所述DPP-4为肠道细胞DPP-4。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YE4，或上述的菌剂， 在制备用于预防和/或治疗糖尿病产品中的应用。
本发明还提供了所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YE4作为功能性益生菌 在制备食品、食品添加剂、保健品或药品中的应用。
本发明还保护一种产品，其活性成分为上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) YE4，或前面所述的任意一种菌剂，所述产品的用途为如下任意一种：
(1)作为DPP-4抑制剂；
(2)预防和/或缓解Ⅱ型糖尿病；
(3)作为功能性益生菌应用到食品、食品添加剂、保健品或药品中。
本发明使用Caco-2细胞测定乳酸菌对DPP-4的抑制活性显示：保藏于实验室菌种库 中可用于食品的12株乳酸菌中，乳酸菌的细胞内容物(Cell-free extracts,CFE)对Caco-2 细胞的DPP-4均表现出抑制作用(抑制率为3.09％至24.33％)，乳酸菌无细胞上清液 (cell-free excretory supernatants,CFS)对DPP-4抑制活性整体偏低(抑制率为0至5.68％)。 植物乳杆菌YE4的CFE(YE4-CFE)具有最高的DPP-4抑制率，达到24.33％，同时YE4-CFE 能显著抑制Caco-2细胞中DPP-4基因的mRNA表达。植物乳杆菌YE4-CFE使得Caco-2中有2296个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)显著上调，1718个DEGs 显著下调；这些DEGs与GO富集分析中质膜的组成部分、阳离子通道活性、肌肉收缩、生物粘附、细胞黏附等相关，与KEGG数据库中脂质代谢、碳水化合物代谢、内分泌系 统、内分泌和代谢疾病等相关。与对照组相比，YE4-CFE引起TNF通路中基因CFLAR 的mRNA表达显著下调，基因ATF4、CREB3L3、NFκBIA、JUNB、Tnfaip3的mRNA表 达显著上调，也引起MAPK通路中基因IRAK1、FLNA、MYC的mRNA表达显著下调， 基因DDIT3、HSPA1A、ATF4、HSPA1B、STMN1、DUSP1、NR4A1的mRNA表达显著 上调。YE4-CFE中相对分子质量小于3KDa的组分对DPP-4抑制活性最强，抑制率为 20.70％，其中相对占比高于1％的有19种化合物，主要为腺嘌呤(10.573％)、乙酰胆碱 (7.479％)、L-苯丙氨酸(7.177％)、鸟嘌呤(6.418％)、2-羟基肉桂酸(5.975％)、 酪氨酸(5.683％)。综上，植物乳杆菌YE4-CFE具有显著的DPP-4抑制活性，活性成分 主要为腺嘌呤、乙酰胆碱、L-苯丙氨酸、鸟嘌呤、2-羟基肉桂酸、酪氨酸等19种小于3KDa 的化合物，YE4-CFE对DPP-4的抑制作用与其调节TNF、MAPK通路的基因表达有关。 因此，植物乳杆菌YE4可用于制备抑制肠道细胞DPP-4活性及缓解Ⅱ型糖尿病的保健食 品和药品。
附图说明
图1为分离菌株菌落形态(图A)及革兰氏染结果(图B)；
图2为植物乳杆菌YE4的API 50CH反应结果；
图3为乳酸菌对Caco-2细胞中DPP-4的抑制活性影响；
图4为植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞中DPP-4基因表达的影响；
图5为不同分子质量组分的YE4-CFE对Caco-2细胞DPP-4的抑制活性影响；
图6为基因表达量小提琴图；
图7为样本PCA分析图；
图8为差异表达基因的火山图；
图9为GO富集分析条形图，其中，(A)细胞成分，(B)生物过程，(C)分子功能；
图10为KEGG富集分析气泡图；
图11为植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞TNF通路热图(图A)及TNF通路相关基 因表达(图B)的影响；
图12为植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞MAPK通路热图(图A)及MAPK通路相 关基因表达(图B)的影响；
以上各图中，同种实验条件下标有相同小写英文字母(a、b、c)的组之间不存在显著差 异(p>0.05)；同种实验条件下标有不同小写英文字母(a、b、c)的组之间存在显著差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；如无特殊说明，所用生物、 化学试剂均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。
实施例1、抑制Caco-2细胞DPP-4活性的乳酸菌筛选及活性成分分析
1实验材料
根据卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》，本发明选择12株乳酸菌进行后续实验。该菌种库的菌株是从红原、青海、新疆等高原地区的泡菜、曲拉和酸奶分离得到。
人结直肠腺癌细胞系Caco-2，来源于美国典型菌株保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)。
2实验方法
2.1乳酸菌的形态学鉴定
按照革兰氏染色试剂盒的说明书对乳酸菌进行染色，然后调节双目显微镜于100倍油 镜下观察其形态。
2.2 PCR扩增16S rDNA序列
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA。采用25μL反应体系进行PCR 扩增，反应结束后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。合格样品送华大基因科技有限公司测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析。
2.3乳酸菌API 50CH试剂盒的生化鉴定
分离菌株在37℃培养18h，于3000r/min、15min的条件下离心收集菌体，用无菌 生理盐水洗涤菌体后重悬为菌悬液。参考梅里埃(法国)API 50CH试剂盒说明书进行操 作。
2.4乳酸菌CFS的制备
将乳酸菌以2％接种量活化2次后在37℃的条件下培养18h，随后低温4000g，离心10min收集菌体并洗涤2次，再将菌液的菌落总数调为1×108CFU/mL。在37℃的条件下 培养12h，随后低温4000g，离心10min，此时所得上清液即为CFS(cell-free excretorysupernatants，无细胞上清液)，为了避免低pH值对结果的影响，CFS在过滤前用5M氢 氧化钠中和至pH为7.4，冷冻干燥后-80℃保存。
2.5乳酸菌CFE的制备
将乳酸菌以2％接种量活化2次后在37℃的条件下培养18h，随后低温4000g，离心10min收集菌体并洗涤2次，再将菌液的菌落总数调为1×108CFU/mL。然后在冰浴环境 下使用超声波细胞粉碎机进行超声破碎，条件为：30％的功率以工作3s，停5s的脉冲破 碎15min。超声后的溶液于低温12000g的条件下离心10min，取上清液冷冻干燥，得到 乳酸菌CFE(Cell-free extracts，细胞内容物)粉剂，-80℃保存。
2.6乳酸菌CFS及CFE对DPP-4的抑制活性影响
Caco-2细胞以7×105个/mL的密度接种培养至第4天后测定DPP-4活性。实验当天，将细胞用100μL PBS润洗后按照表1与表2分别加入经过0.22μm滤头过滤的乳酸菌CFS 或CFE共孵育12h(不含抗生素但含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养 基作为CFS、CFE和MRS(乳酸细菌培养基)的配制溶液，配制后浓度为10mg/mL)， 随后去除处理，100μLPBS润洗后加入100μL 4mM的Gly-Pro-PNA·HCl(甘氨酰脯氨 酸对硝基苯胺)，37℃孵育60min，最后将反应完的样品置于酶标仪中测定405nm处的 吸光值(Absorbance value,Abs)，DPP-4抑制率按照下式计算。
表1 乳酸菌CFS对Caco-2细胞DPP-4抑制活性的测定体系
表2 乳酸菌CFE对Caco-2细胞DPP-4抑制活性的测定体系
2.7 qRT-PCR法测定Caco-2细胞中DPP-4基因的表达
将Caco-2细胞以7×105个/mL的密度接种于6孔板上，待细胞长至第4天时，将细胞用100μL PBS润洗后加入10mg/mL植物乳杆菌YE4-CFE共孵育12h(不含抗生素但 含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基作为配制溶液)。孵育完成后， 轻轻吸出上清液，PBS润洗后弃去PBS。随后使用TRIzol试剂法提取Caco-2细胞中的总 RNA并进行纯度与浓度检测。按照cDNA合成试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(品牌：MBI)说明书将总RNA反转录成cDNA，随后使用20μL PCR体系 进行序列扩增，PCR程序为：95℃预变性10min；之后在95℃，15s；60℃，1min；72℃， 30s条件下循环40次。实验采用2-△△Ct法计算目的基因的相对含量。引物序列见表3，PpiA 为DPP-4基因的管家基因。
表3 引物序列
2.8超滤技术分析乳酸菌的CFE活性组分
取适量样品加入到超滤管中，先使用30kDa的超滤管将样品分为>30kDa与<30kDa，随后使用10kDa超滤管将<30kDa的物质组分分为10-30kDa与<10kDa，类似地依次使 用5kDa与3kDa超滤管进行逐步分离，最后得到<3kDa、3-5kDa、5-10kDa、10kDa-30 kDa与>30kDa的组分分别参照2.3进行DPP-4抑制活性的测定。
2.9 UHPLC-MS/MS分析乳酸菌的活性成分
(1)样本前处理
取100mg经超滤管分离后小于3kDa的YE4-CFE冻干粉，置于EP管中，加入500 μL的80％甲醇水溶液后涡旋震荡，冰浴静置5min，15000g、4℃离心15min；取一定量 的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为53％；15000g、4℃离心15min，收集上清，进行后 续分析。
(2)检测条件
使用Vanquish UHPLC系统和Orbitrap Q ExactiveTMHF-X质谱仪进行 UHPLC-MS/MS分析。液相条件下使用HypesilGoldcolumn(C18)色谱柱对样本进行检测， 正离子模式下，流动相A为0.1％甲酸，流动相B为甲醇；负离子模式下，流动相A为5 mM醋酸铵，pH 9.0，流动相B为甲醇。洗脱程序：0-1.5min，2％B；1.5-12min，2％-100％B； 12-14min，100％B；14-14.1min，100％-2％B；14.1-17min，2％B。柱温：40℃，流动相 流速：0.2mL/min，进样量：2μL。质谱仪以正/负极性模式运行，质谱扫描范围选择m/z： 100-1500；ESI源的设置为：电喷雾电压：3.2kV；鞘气流速：40Arb；辅助气流速：10Arb； 毛细管温度：320℃；MS/MS二级扫描方式为数据依赖性扫描DDA。
(3)数据分析
将下机数据文件导入CD搜库软件中，进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后对不同样品根据保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm进行峰对齐，使鉴定更准确， 随后根据设置的质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度100000、 加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离 子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后 得到数据的鉴定和定量结果。
2.10数据统计与分析
根据Minitab 17统计软件中Tukey检验的单因素方差分析检验数据在P<0.05的水平 上是否具有显著差异。所有试验至少进行3次重复，结果以平均值±标准差表示。
3结果与分析
3.1菌株的菌落形态和细胞形态
菌株纯化后在MRS培养基中形成单菌落，菌落形态几乎一致，大多数呈圆形，白色，表面光滑湿润。革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态，判定为革兰氏阳性菌 (G+)。其中，编号为YE4的菌株的菌落形态和革兰氏染色结果见图1。
3.2菌株16S rDNA序列PCR扩增结果
16S rDNA同源性分析结果显示，编号为YE4的菌株与Gene Bank数据库中已知植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的同源性达100％。植物乳杆菌YE4的16S rDNA基 因扩增产物的双向序列如SEQ ID No.5所示。
3.3菌株生化特性鉴定结果
乳酸菌菌种水平的表型鉴定主要根据碳水化合物发酵试验。API 50CH试剂盒则是通 过目的菌株对49种碳水化合物的反应情况进行鉴定。由图2和表4可知，菌株YE4可利 用其中的22种碳水化合物。然后经API 50CH lab plus系统的鉴定，发现YE4的ID值为99.9％，T值为0.91，达到了鉴定标准(ID值≥99.0％且T值≥0.5)，鉴定结果为植物乳杆菌。
表4 乳酸菌YE4对49种碳水化合物发酵试验结果
3.4乳酸菌对Caco-2细胞中DPP-4的抑制活性影响
将保藏于本实验室的12株乳酸菌进行CFS和CFE制备，接着测定其对Caco-2细胞的DPP-4抑制作用。由图3得出，乳酸菌CFS对Caco-2细胞的DPP-4抑制活性整体偏低， 抑制率范围从0至5.68％。然而，所有乳酸菌的CFE对DPP-4均有抑制活性，抑制活性 为3.09％至24.33％，植物乳杆菌YE4的CFE具有最高的DPP-4抑制活性，达到24.33％， 这说明植物乳杆菌YE4是一株具有DPP-4抑制活性的潜力菌株，制备于YE4菌株的CFE 简写为YE4-CFE。
3.5植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞中DPP-4基因表达的影响
为了探究YE4-CFE是否会通过影响DPP-4的表达从而影响DPP-4的活性，本实验通过qRT-PCR对DPP-4的mRNA表达做了分析。由图4发现，YE4-CFE与Caco-2细胞作 用后，可使DPP-4的mRNA表达出现明显的下降(P<0.05)。这说明YE4-CFE抑制Caco-2 细胞DPP-4的活性可能与抑制DPP-4的mRNA表达有关。
3.6超滤分析植物乳杆菌YE4-CFE中不同分子质量组分对DPP-4的影响
超滤管利用不同的截留值可将样品分为不同分子量大小的组分，从而将目标物质与其 他分子量的杂质分开。从图5分析发现，分子质量越大的组分对Caco-2细胞的DPP-4抑制率越低，当YE4-CFE的分子质量在<3KDa时对DPP-4的抑制率最高，抑制率为20.70％， 其次为3-5KDa的组分，分子质量大于5KDa的组分抑制活性较弱。因此，推测YE4-CFE 对Caco-2细胞中DPP-4具有抑制活性的主要为<3KDa的小分子类物质。
3.7植物乳杆菌YE4-CFE中小分子类物质的UHPLC-MS/MS分析
使用UHPLC-MS/MS鉴定YE4-CFE中小于3KDa的物质，鉴定结果显示其中相对占 比高于1％的19种化合物，由表5得出，物质中相对占比较高的为腺嘌呤(10.573％)、 乙酰胆碱(7.479％)、L-苯丙氨酸(7.177％)、鸟嘌呤(6.418％)、2-羟基肉桂酸(5.975％)、 酪氨酸(5.683％)。19种化合物的物质类别为咪唑并嘧啶、羧酸及其衍生物、肉桂酸及 其衍生物、嘌呤核苷、脂肪酰基、二嗪、有机氮化合物、吲哚及其衍生物及其他类。这说 明植物乳杆菌YE4-CFE抑制Caco-2细胞中DPP-4活性的主要成分为腺嘌呤、乙酰胆碱、 L-苯丙氨酸、鸟嘌呤、2-羟基肉桂酸、酪氨酸等19种小于3KDa的小分子类物质。
表5 YE4-CFE中小分子类物质的鉴定结果
实施例2、植物乳杆菌YE4-CFE抑制DPP-4活性的机制
1实验材料
实验菌株为植物乳杆菌YE4(Lactobacillus plantarum YE4)。
将菌株YE4于2021年4月送中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏， 地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期为2021年4月14日， 保藏编号为CCTCC NO:M 2021373，分类名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
人结直肠腺癌细胞系Caco-2，来源于美国典型菌株保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)。
2实验方法
2.1样品与细胞预处理
将Caco-2细胞以7×105个/mL的密度接种于6孔板上，待细胞长至第4天时，将细胞用100μL PBS润洗后加入10mg/mL的植物乳杆菌YE4-CFE共孵育12h(不含抗生素 但含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基作为配制溶液，不含YE4-CFE 的溶液作为对照组)。孵育完成后，轻轻吸出上清液，使用PBS润洗后弃去PBS并加入 1mL的TRIzol试剂，反复吹打使TRIzol与细胞充分接触并消化。将溶液转移到RINase-free 冻存管中进行液氮速冻(>0.5h)，然后进行RNA-sequence(RNA-seq)测序工作。
2.2 RNA-seq试验流程
TRIzol试剂提取总RNA后使用常规试剂盒去除rRNA，通过带有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后用超声波把mRNA打断。以片段化的mRNA为模版， 随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH 降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下,以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯 化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200 bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得 文库。
2.3 RNA-seq分析流程
为了保证数据质量，在信息分析前对原始数据进行数据过滤，以减少无效数据所来带 的分析干扰。首先将下机的raw reads进行质控，过滤低质量数据得到高质量cleanreads。 然后分析碱基的组成及质量分布，利用HISAT2软件，开展基于参考基因组的比对分析， StringTie v1.3.1定量分析基因丰度，采用DESeq2软件对两组间的RNA差异表达进行分 析等。最后进行样本关系分析、GO功能注释分析和KO富集分析。
2.4 qRT-PCR法
将Caco-2细胞以7×105个/mL的密度接种于6孔板上，待细胞长至第4天时，将细胞用100μL PBS润洗后加入10mg/mL植物乳杆菌YE4-CFE共孵育12h(不含抗生素但 含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基作为配制溶液)。孵育完成后， 轻轻吸出上清液，PBS润洗后弃去PBS。随后使用TRIzol试剂法提取Caco-2细胞中的总 RNA并进行纯度与浓度检测。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书将总 RNA反转录成cDNA，随后使用20μL PCR体系进行序列扩增，PCR程序为：95℃预变 性10min；之后在95℃，15s；60℃，1min；72℃，30s条件下循环40次。实验采用2-△△Ct法计算目的基因的相对含量。引物序列见表6，GAPDH为管家基因。
表6 引物序列
2.5数据统计与分析
根据Minitab 17统计软件中Tukey检验的单因素方差分析检验数据在P<0.05的水平 上是否具有显著差异。所有试验至少进行3次重复，结果以平均值±标准差表示。
3结果与分析
3.1植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞基因表达丰度的影响
FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)值可用于反映基 因表达水平，基于各基因FPKM值制作的小提琴图一般用于基因的丰度表达可视化，可 以展示任意位置的数据密度。如图6，纵坐标log10(FPKM)代表基因表达量，该数值越高， 代表基因表达量越高，横坐标为样本名称，横轴方向长度代表在某纵坐标位置分布数据的 多少。由该图可以发现CTL组和CFE组的组内基因表达分布相似，而CTL组与CFE组之间基因表达分布明显不同，说明植物乳杆菌YE4-CFE与Caco-2细胞作用后改变了细胞 的基因表达丰度。
3.2植物乳杆菌YE4-CFE影响Caco-2细胞的PCA分析
PCA分析是一种统计方法，它将成千上万的相关变量(基因表达)转换成一组线性不相关的变量值，常用于考察样本之间分布情况的一种多元统计分析方法，样品相似性越高则分布更近。如图7，PC1与PC2提供了99.2％的贡献率，CFE组与CTL组分布在不 同区域，这说明植物乳杆菌YE4-CFE处理前后样品之间差异较大。
3.3植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞中差异表达基因的影响
火山图用于显示差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的总体情况，可 直观地反应整个DEGs的分布，同时从DEGs的倍数和显著性水平两个方面进行了解释， 图中越靠近两端的基因，差异程度越大。图8发现植物乳杆菌YE4-CFE处理可使Caco-2细胞中的2296个基因显著上调，1718个基因显著下调，另有16272个基因没有发生改变， 上调的基因占DEGs数目比例较高，达到57.20％。这更直观地说明了植物乳杆菌YE4-CFE 与Caco-2细胞作用后改变了细胞的基因表达分布。
3.4植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞的功能预测分析
GO是一个国际标准化的基因功能分类系统，可以对任何生物中的基因及其产物特性 进行限定和描述。GO富集分析首先将所有的DEGs映射到GO数据库的每个条目上，以 全基因组为背景，通过超几何分布计算DEGs显著富集的条目。将DEGs的GO富集分析 结果按生物过程(biological process,BP)、细胞成分(cell components,CC)和分子功能(molecular functions,MF)进行分类。检测到的差异基因或蛋白质可以通过对应GO编号的ID或序列注释来识别，从而对应到GO term(其代表功能类别和细胞定位)，GO功 能注释分析可以降低样本的复杂性。为了解YE4-CFE对Caco-2细胞基因功能的影响，使 用了此种方法进行分析。通过结果可以看出，CTL组与CFE组的DEGs在细胞成分部分 最显著的前5种功能差异为：质膜的组成部分、质膜的固有成分、质膜部分、细胞外基质 和核小体图9A；在生物过程差异部分最显著的前5种功能差异为：肌肉收缩、生物粘附、 细胞粘附、系统开发及肌肉系统过程图9B；在分子功能部分最显著的前5种功能差异为 图9C：阳离子通道活性、离子通道活性、底物特异性通道活性、通道活动和被动跨膜转 运蛋白活性。这说明YE4-CFE可能通过肌肉收缩、生物黏附、细胞黏附等方式影响质膜 的组成部分、阳离子通道活性等进而影响Caco-2细胞的基因表达。
3.5植物乳杆菌YE4-CFE对Caco-2细胞的通路预测分析
在生物学中，不同的基因协调并行使各自的生物学功能，通路分析是基因生物学功能 的体现，KEGG则是一个有关通路的主要数据库，此库提供了生物体内氨基酸、碳水化合物等所有相关的代谢途径。KEGG信号通路分析的最大特点之一是它不仅整合了基因 组、化学和系统功能的信息，而且通过强大的图形功能直观地展示了物种内部的分子间相 互作用和反应网络。由图10可以发现，其中富集最明显的有酒精中毒、移植物抗宿主病、 单纯疱疹感染、TNF信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、病毒蛋白与细胞 因子和细胞因子受体的相互作用、Th1和Th2细胞分化、弓形虫病、1型糖尿病等通路， 通路中DEGs富集最多的有单纯疱疹感染、神经活性配体-受体相互作用、细胞因子与细 胞因子受体的相互作用、MAPK信号通路等。这说明植物乳杆菌YE4-CFE最有可能通过 上述通路影响Caco-2细胞中DPP-4的活性。
3.6植物乳杆菌YE4-CFE影响TNF通路的验证分析
TNF是一种促炎症细胞因子，由内脏脂肪组织分泌，是代谢综合征的共同特征。有研究发现，TNF水平升高与胰岛素抵抗和2型糖尿病相关；TNF-α的非特异性阻滞剂己酮 可可碱可以降低链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠中GALT细胞的DPP-4转录活性。观察图 11A发现，与CTL组相比，RNA-seq法预测TNF信号通路中基因CFLAR显著下调，基 因ATF4、CREB3L3、NFκBIA、JUNB、Tnfaip3显著上调(P<0.05)。使用qRT-PCR检 测相同基因的mRNA表达，发现与这些基因具有相同的上下调趋势图11B。与CTL组相 比，基因NFκBIA上调可达7.32倍，其次是CREB3L3、ATF4、Tnfaip3、JUNB基因分别 上调了6.15倍、2.46倍、2.43倍、1.98倍，而基因CFLAR下调0.53倍。
3.7植物乳杆菌YE4-CFE影响MAPK通路的验证分析
MAPK信号通路是一种非常重要的炎症信号通路，全身性慢性炎症如不治疗，可导致2型糖尿病等疾病。有研究表明可溶性DPP-4可以上调MAPK通路，也发现来源于长 寿花的HCD既能抑制MAPK通路中的ERK磷酸化，也能抑制可溶性DPP-4的活性。 RNA-seq法预测MAPK信号通路中IRAK1、FLNA、MYC基因显著下调，DDIT3、HSPA1A、 ATF4、HSPA1B、STMN1、DUSP1、NR4A1基因显著上调图12A。使用qRT-PCR检测 相同基因的mRNA表达，发现这些基因与RNA-seq结果也具有相同的上下调趋势图12B。 其中，基因HSPA1B上调倍数最高，达到7.44倍，其次是DUSP1、HSPA1A、ATF4、DDIT3、 NR4A1、STMN1基因分别上调4.93倍、4.30倍、2.46倍、1.57倍、1.37倍与1.30倍， 而基因IRAK1、MYC、FLNA分别下调0.29倍、0.73倍与0.80倍。
总之，这些结果表明，植物乳杆菌YE4-CFE具有显著的DPP-4抑制活性，活性成分主要为腺嘌呤、乙酰胆碱、L-苯丙氨酸、鸟嘌呤、2-羟基肉桂酸、酪氨酸等19种小于3KDa 的化合物。YE4-CFE对DPP-4的抑制作用与其调节TNF、MAPK通路的基因表达有关。
序列表
<110> 重庆誉研生物科技有限公司
<120> 一株能抑制肠道细胞DPP-4活性的植物乳杆菌YE4及其缓解糖尿病的应用
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggagtcctg ggtttcagtt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctccaacct cacgtggac 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctgactgt ggacaactcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcagcgaga gcacaaagat 20
<210> 5
<211> 1411
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌YE4 16S rDNA(Artificial Sequence)
<400> 5
gttaccccac cgactttggg tgttacaaac tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 60
gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat 120
gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaatggct ttaagagatt agcttactct 180
cgcgagttcg caactcgttg taccatccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg 240
ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag 300
agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 360
caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag 420
ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta 480
gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540
tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag 600
ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat cgtttacggt atggactacc agggtatcta 660
atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct 720
tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg ctacacatgg agttccactg 780
tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct 840
ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg 900
cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa 960
ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca gatatgttct tctttaacaa cagagtttta 1020
cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc gttgctccat cagactttcg tccattgtgg 1080
aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc 1140
gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta 1200
gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg atagccgaag ccatctttca aactcggacc 1260
atgcggtcca agttgttatg cggtattagc atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct 1320
gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg 1380
caagcaccaa tcaataccag agttcgttcg a 1411
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcccaagca cccggataca gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacctgcaac agcatcacct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acagtgtcaa tcggaggtca c 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aagcgcacac agatgacgta 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
actggaacgt ttgcgagaga 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atcaatgcag attggaggcc c 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agctggagca ggtgtgtaac 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cagcaatctt ggaaaggccc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctggagcagg tgtgtaaccc 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcagcaaag tccttgagtc c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagagcccca ttacgacctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccagaggaac tcgggtgaag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcctttct ccttcgggac 20
<210> 31
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagtcagcca agccagagaa 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tacactaaca tcccacgctc tg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttctctgctg ctcctccgta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttcctggtgt aagctttggt atgg 24
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<211> 20
<212> DNA
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actctggatg gaccaacagg 20
<210> 36
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggctgcttt taactctggt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggcaggttt ttctagacgg 20
Claims (9)
1.一株能抑制肠道细胞DPP-4活性的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4，在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2021373。
2.一种菌剂，其活性成分包含权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于：其活性成分包含植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4的细胞内容物。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于：所述细胞内容物为冷冻干燥粉剂。
5.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4，或权利要求2至4任一项所述的菌剂，在制备抑制DPP-4的试剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述DPP-4为肠道细胞DPP-4。
7.如权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4，或权利要求2或3所述的菌剂，在制备用于预防和/或治疗糖尿病产品中的应用。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4作为功能性益生菌在制备食品、食品添加剂、保健品或药品中的应用。
9.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YE4，或权利要求2至4任一项所述的菌剂，所述产品的用途为如下任意一种：
(1)作为DPP-4抑制剂；
(2)预防和/或治疗糖尿病；
(3)作为功能性益生菌应用到食品、食品添加剂、保健品或药品中。
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Cited By (1)
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