TWI816159B - 用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其包括衍生化步驟、裝載步驟及檢測步驟。衍生化步驟包括以2-硝基苯肼（2-NPH）處理生物樣品中之短鏈脂肪酸，以使短鏈脂肪酸衍生化而生成檢測物。裝載步驟包括將檢測物裝載於紙片載體上。檢測步驟包括以即時直接分析游離質譜法（DART-MS）對裝載於紙片載體上的檢測物進行分析，以獲得檢測結果。本發明能夠在極短時間內完成生物樣品分析，且達到與傳統層析方式相當的定量結果。
Description
本發明是有關於用於檢測生物樣品中短鏈脂肪酸的方法，更具體而言，本發明是有關利用紙片作為載體而檢測生物樣品中短鏈脂肪酸的方法。
在近幾十年來，腸道內微生物群(gut microbiota)對人體健康的影響已成為受矚目且被廣泛研究的議題。腸道為生物群可塑造宿主的代謝途徑，即，其具有產生對於人體健康具有益效果之各種代謝物的能力。
在各種代謝物中，短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)為做受到廣泛討論的代謝物之一。短鏈脂肪酸為以六個碳為主的脂族碳酸，可自腸胃道代謝膳食性纖維產生並在血液循環中流通，因此其不僅影響腸道生理環境，更塑造宿主的能源代謝途徑。SCFAs的功能與多種疾病，諸如發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease，IBD)、神經精神異常疾病(neuropsychiatric disorders)及腎臟疾病(kidney disease)的研究、預防及治療有關。
除此之外，內生(endogenous)SFCAs的等級能夠用以了解對於飲食攝取、腸道內微生物群的組成與宿主代謝途徑之間的關聯。因此，SCFAs已被認為是疾病的潛在診斷生物標記，舉例而言，丙酮酸及丁酸在糞便中的濃度已被
證實能夠有效診斷腸躁症候群(irritable bowel syndrome，IBS)，而糞便中之SCFAs亦能用以對大腸直腸癌(colorectal cancer，CRC)及腺瘤性瘜肉(adenomatous polyposis，AP)進行診斷。另外，血漿中SCFA的濃度已被作為慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)病患之心血管疾病的預測性標記。有鑑於SCFAs在臨床診斷上所扮演之重要角色，有需要提供高效、穩定及高感測性之SCFAs定量分析方法。
在現有技術中，生物樣品中之SCFAs的定量通常是通過基於分離原理之技術而進行，舉例而言利用氣相層析(gas chromatography，GC)、液相層析(liquid chromatography，LC)配合質譜分析(mass spectrometry，MS)，如GS-MS及LC-MS進行。這些分析方法能獲得對生物樣品中SCFAs可靠的定量結果，然而，由於採用上述技術進行分析，對於單一樣品即需要耗費數分鐘至數十分鐘的分析時間，使得定量分析無法為即時且有效率的。除此之外，對於SCFAs而言，其等具有小分子量、高極性及高揮發性的特性，因此，對其等進行定量分析時必須先通過衍生化(derivatization)改變其化學性質以利於使用傳統的高效能液相層析儀進行分析。然而，如此一來，此定性分析方法所耗費之時間較長，舉例而言，單一樣本需要例如約45分鐘完成分析。據此，傳統分析方法有耗時且因而增加人員經費等資源耗費，而造成成本過高的缺點。對於即時分析方法，現有技術中揭露使用大氣壓力質譜法(ambient ionization mass spectrometry)對生物分子進行定量。然而，由於SCFAs之分子特性，直接對其進行分析在現階段仍具有相當困難度。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，能夠在極短時間內完成單一樣品的定量分析。
本發明之一實施例提供一種用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其包括：一衍生化步驟，其包括以2-硝基苯肼(2-NPH)處理該生物樣品中之該短鏈脂肪酸，以使該短鏈脂肪酸衍生化而生成一檢測物；一裝載步驟，其包括將該檢測物裝載於一紙片載體上；以及一檢測步驟，其包括以即時直接分析游離質譜法(DART-MS)對裝載於該紙片載體上的該檢測物進行分析，以獲得一檢測結果。
在本發明的一個較佳實施例中，該生物樣品是選自於由生物之血清、血漿、組織、排泄物、代謝物之發酵物及其等之衍生物所組成之群組的至少一者。
在本發明的一個較佳實施例中，在該衍生化步驟前，還進一步包括一前處理步驟，其包括以一試劑對該生物樣品進行萃取，以獲得包括該短鏈脂肪酸之一混合物。
在本發明的一個較佳實施例中，該衍生化步驟包括使2-硝基苯肼與該短鏈脂肪酸進行醯胺化反應以生成該檢測物。
在本發明的一個較佳實施例中，該紙片載體為濾紙。
在本發明的一個較佳實施例中，該檢測步驟中之檢測時間為介於0.1至2分鐘。
在本發明的一個較佳實施例中，該短鏈脂肪酸包括選自於由乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸、乳酸、戊酸及3-羥基丁酸所組成之群組的至少一者。
在本發明的一個較佳實施例中，該裝載步驟還進一步包括將介於0.5微升至1微升之該檢測物裝載於該紙片載體上。
在本發明的一個較佳實施例中，該檢測結果為一定量檢測結果。
本發明之另一實施例提供一種用於診斷慢性腎臟病的方法，其包括：一採樣步驟，其包括自一生物體取得包括至少一短鏈脂肪酸的一生物樣品；一衍生化步驟，其包括以2-硝基苯肼(2-NPH)處理該生物樣品中之該短鏈脂肪酸，以使該短鏈脂肪酸衍生化而生成一檢測物；一裝載步驟，其包括將該檢測物裝載於一紙片載體上；一檢測步驟，其包括對以即時直接分析游離質譜法(DART-MS)對裝載於該紙片載體上的該檢測物進行分析，以獲得一檢測結果；以及一分析步驟，其包括對該檢測結果進行分析以獲得一診斷結果。
本發明的主要技術手段在於，本發明實施例所提供的檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，是通過對傳統上難以直接進行分析之生物樣品中之短鏈脂肪酸進行衍生化處理，再配合紙片作為取樣基材以常壓游離質譜法中之即時直接分析游離質譜法進行偵測，如此一來，本發明能夠在極短時間內完成樣品分析，且達到與傳統層析方式相當的定量結果。
圖1a為本發明所提供之方法的其中一步驟的示意圖。
圖1b為本發明所提供之方法的一流程示意圖。
圖2為本發明之生物樣品中不同脂肪酸的離子層析圖。
圖3為本發明之生物樣品中不同脂肪酸的高解析度pDART-MS質譜圖。
圖4為六種常見脂肪酸的校正曲線(Calibration curves)。
圖5為本發明一實例中患病小鼠及控制組小鼠之間的糞便中SCFAs濃度之示意圖。
圖6為具透析依賴性之慢性腎臟病(dialysis-dependent ESKD)患者之血清中SCFAs濃度之示意圖。
圖7a為用於本發明一實例中之菌株的生長曲線。
圖7b至7d為經過代謝設計(metabolically engineered)之藍綠藻聚球藻菌菌株(cyanobacteria Synechococcus elongatus strains)所生產之發酵SCPAs的濃度變化示意圖。
以下通過特定的具體實施例來說明本發明所揭露有關「用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法」的實施方式，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可由本說明書所揭示的內容瞭解本發明的優點與功效。本發明可通過其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明的精神下進行各種修飾與變更。以下的實施方式將進一步詳細說明本發明的相關技術內容，但所揭示的內容並非用以限制本發明的技術範疇。
如前所述，本發明旨在提供用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法。於本發明的實施例中，所稱「生物樣品」是選自於由生物之血清、血漿、組織、排泄物、代謝物之發酵物及其等之衍生物所組成之群組的至少一者。更具體而言，生物樣品可以是，例如，自生物體如老鼠(如具有不可預測慢性輕度應力(unpredictable chronic mild stress，UCMS)之老鼠)收集的糞便樣品、自人類
患者(如慢性腎臟病患者)收集的血清，或是由細菌菌株(如經過代謝設計之藍綠藻聚球藻菌PCC 7942菌株)所生產之發酵物等。在本發明中，生物樣品的種類並不加以限制。
請參閱圖1a及1b。圖1a為本發明所提供之方法的其中一步驟的示意圖，而圖1b為本發明所提供之方法的流程示意圖。請先參閱圖1b，本發明實施例所提供的用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法包括衍生化步驟、裝載步驟及檢測步驟。如圖1b所示，衍生化步驟包括以2-硝基苯肼(2-nitrobenzhydrazide，2-NPH)處理生物樣品中之短鏈脂肪酸，以使該短鏈脂肪酸衍生化而生成檢測物。
在本發明中，生物樣品中之短鏈脂肪酸包括選自於由乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸、乳酸、戊酸及3-羥基丁酸所組成之群組的至少一者。然而，短鏈脂肪酸的具體種類在本發明中並不加以限制。
在本發明的實施例中，衍生化步驟包括使2-硝基苯肼與短鏈脂肪酸進行醯胺化(amidation)反應以生成該檢測物。事實上，通過2-硝基苯肼對短鏈脂肪酸進行衍生化可以增強後續由DART進行離子化的效果。生物樣品中所包含的各種不同短鏈脂肪酸與2-NPH發生反應時，短鏈脂肪酸進行醯胺化，形成之反應產物即為SCFA-NPH衍生物而可由後續之分析儀器進行檢測。
詳細而言，由於脂肪酸具有高極性之特性，其在層析分析中不容易被滯留且帶電荷效果不佳，其必須經過衍生化才能獲得較佳的分析效果及所欲的低偵測極限。因此，受限於檢測儀器的限制，本發明之發明人等發現以2-NPH對短鏈脂肪酸進行衍生化後，相較於未進行衍生化之樣品，能夠獲得例如高達100倍之檢測訊號。
具體而言，生物樣品可在經過萃取處理，或是未經過萃取處理之下添加例如內部標準品(internal standard，IS)溶液(包含D4-醋酸、D6-丙酸及D3-丁酸)、過量之2-NPH、吡啶及1-乙基-3(3-(二甲基胺)丙基)碳二亞胺(1-EDC)。接著，所形成之混合溶液(呈黃色)可在60℃下於950rpm下搖晃20分鐘以加速反應。該反應可藉由添加氫氧化鉀抑制而終止，若反應完全，該溶液將轉變為紫色。隨後搖晃及加熱程序可再進行15分鐘以確保反應完全。在冷卻後，可添加磷酸至該產物並以乙醚萃取。此時，包含SCFA衍生物之上層有機層可使用真空濃縮器被收集及乾燥。乾燥之黃色樣品可被再次懸浮於甲醇中，且在用以進行分析前於-80℃下貯存。
請參閱圖1a。在本發明的一些實施例中，在該衍生化步驟前，還可進一步包括前處理步驟，其包括以試劑對生物樣品進行萃取，以獲得包括短鏈脂肪酸之混合物。具體而言，在一些情形中，生物樣品中的短鏈脂肪酸無法直接進行衍生化步驟，而必須先進行前處理。在本發明的實施例中，用以進行前處理步驟的試劑可由所屬技術領域具有通常知識者依據生物樣品之種類與特性進行選擇。在較佳的實施例中，該試劑可為有機溶劑。
舉例而言，對於老鼠糞便之前處理，可於4℃之冷房中以每100毫升糞便添加1毫升之70%甲醇(水/甲醇=30/70,v/v)進行處理。接著，以旋渦混合器(Vortex Genie-2)均質化30分鐘，再於12,5000rpm下離心5分鐘。包含SCFAs的上澄液被收集並在進行衍生化步驟前儲存於-80℃的環境中。在另一個實施例中，當生物樣品為細菌菌株的發酵物時，亦可在衍生化步驟前進行前處理步驟。舉例而言，對於細菌發酵培養基(bacterial fermentation medium)，在進行衍生
化步驟之前，聚球藻菌(S.elongatus)的培養基(200μL)可藉由添加20μL的鹽酸(0.1M)被酸化。
請再次參閱圖1b。在衍生化步驟後，裝載步驟包括將檢測物裝載(loaded)於紙片載體上。具體而言，經過衍生化步驟所獲得的SCFA衍生物，即檢測物，被裝載至用於進行定性及定量分析之儀器的載體。隨後，在檢測步驟中，以即時直接分析游離質譜法(DART-MS)對裝載於紙片載體上的檢測物進行分析，以獲得檢測結果。
詳細而言，在本發明中，利用紙片作為載體的即時直接分析游離質譜法稱為pDART-MS(paper-loaded DART-MS)，可使用與VAPUR介面(IonSense Inc.，索格斯，美國)耦合之DART SVP離子源進行離子化。一自動化傳輸模組可被用以承載、排列例如10個紙片載體以利進行分析。在本發明的一個較佳實施例中，前述紙片載體為例如濾紙，而濾紙可被裁剪成例如三角形等形狀。經過衍生化步驟之檢測物可被裝載於三角形形狀之濾紙的尖端，裝載量可為例如介於0.5微升及1微升之間，較佳為約0.75微升。經裝載的濾紙可通過固定件，例如雙面膠固定於自動化傳輸模組上。
值得注意的是，採用紙片作為載體是利用其具有初步過濾之效果，使其吸附樣品中極性較高的物質，如大部分的鹽類。由於DART離子源對非極性物質有較好的游離效果，通過紙片事先吸附樣品中極性較高的物質能提升後續使用DART離子源進行檢測的效果。舉例而言，現有技術中使用玻璃棒作為載體，由於玻璃棒僅是沾附樣品而不提供任何過濾效果，檢測所獲得之訊號強度明顯較本發明中採用紙片載體為差。
接著，在檢測步驟中，耦合至DART離子源的質譜儀被用以獲取檢測物在負游離模式(negative ionization mode)下之MS光譜。在本發明中，檢測步驟中之檢測時間為例如介於0.1至2分鐘，較佳地為介於0.1至0.5分鐘。事實上，耦合至DART離子源的質譜儀不限於一組，舉例而言，可以同時使用兩組或兩組以上之商用質譜儀以對不同種類之生物樣品所得之檢測物進行分析。在本發明的實施例中，可利用其中一組質譜儀以對人類血清及細菌發酵物中之SCFAs進行檢測，並利用另一組質譜儀對老鼠糞便中之SCFAs進行檢測。舉例而言，可以採用Orbitrap EliteHybrid離子阱-軌道阱質譜儀(Thermo Scientific，德國)對人類血清及細菌發酵物進行檢測，並配合串聯式質譜法(tandem mass spectrometry，MS/MS)以獲得經衍生化之SCFAs的高解析度標記。同時，可採用SYNAPT G2-S高解析度質譜儀(Waters MS Technologies，曼徹斯特，英國)用以進行老鼠糞便中之SCFAs的定量。
除此之外，本發明還提供一種用於診斷慢性腎臟病的方法，其包括採樣步驟、衍生化步驟、裝載步驟、檢測步驟及分析步驟。具體而言，此方法為利用前述之檢測方法進行臨床診斷及分析的方法。
慢性腎臟病為全球廣泛流行之疾病之一。特別是，ESKD患者需要依賴透析治療(血液透析或腹膜透析)以延緩病情。目前，已知CKD與腸道內微生物群失調有關，且因此造成生產SCFA之腸道細菌的減少。再者，SCFAs已被認為是改善腎損傷有益的代謝物。然而，在CKD發展期間，SCFAs所扮演的生理角色仍然是有待研究的。據此，本發明提供採用前述pDART-MS平台用於診斷慢性腎臟病的方法，能夠對疾病的診斷及研究提供有益的技術功效。此方法的具體實例如以下實例3所述。
本發明所提供之用於診斷慢性腎臟病的方法中，採樣步驟包括自生物體取得包括至少一短鏈脂肪酸的生物樣品；衍生化步驟包括以2-硝基苯肼處理生物樣品中之短鏈脂肪酸，以使短鏈脂肪酸衍生化而生成檢測物；裝載步驟包括將檢測物裝載於紙片載體上；檢測步驟包括對以即時直接分析游離質譜法(DART-MS)對裝載於紙片載體上的檢測物進行分析，以獲得檢測結果；而分析步驟包括對檢測結果進行分析以獲得診斷結果。
有關衍生化步驟、裝載步驟及檢測步驟的詳細內容，皆如同先前針對用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法所述，在此不再次敘述。對於採樣步驟，其執行之具體技術手段可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者依據其專業知識加以選擇。針對分析步驟，在本發明的實施例中，進行分析的方式包括例如採用短鏈脂肪酸之標準品以及繪製並利用校正曲線等方式(如以下實例1所述之方式)，且具體分析流程可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者依據其專業知識加以選擇。
接下來，請參閱圖2至圖4。圖2為本發明之生物樣品中不同脂肪酸的離子層析圖，圖3為本發明之生物樣品中不同脂肪酸的高解析度pDART-MS質譜圖，而圖4為六種常見脂肪酸的校正曲線。在以下圖式中，AA代表乙酸，PA代表丙酸，BA代表丁酸，LA代表乳酸，VA代表戊酸，3-HBA代表3-羥基丁酸。
在實例1中，製備包含九種常見SCFAs之混合物，此九種SCFAs為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乳酸、3-羥基丁酸及三種以同位素標示之標準品。如前所述，此SCFAs混合物被裝載至三個三角形紙片上並以pDART-MS進行檢測。
各樣品均在半分鐘內完成檢測，並如圖2所示，產生三個連續、有重複性的訊號。除此之外，pDART-MS質譜圖顯示於圖3，其中最主要的訊號代表SCFA-NPH衍生物(檢測物)之去質子化離子([M-H]-)，其等具有無法觀測之碎片。圖3的結果顯示生物樣品中各種不同的SCFAs都能夠通過pDART-MS平台同時進行定量檢測。
接下來，請參閱圖4，為了評估pDART-MS平台之定量的效果，本發明之發明人等依據各SCFA及其標準品之SCFA濃度，根據離子層析(extracted ion chromatograms，EIC)面積比建立校準曲線。在圖4中，誤差條代表藉由重複三次測量(technical triplicates)而得的偏差值。
由圖4的結果可知，本發明所提供的方法能夠對於多種SCFAs，在廣泛的濃度線性範圍內進行定量檢測。上述濃度線性範圍具有良好的線性(linearity)並顯示在μM等級的偵測極限(limit of detection，LOD)及定量極限(limit of quantification，LOQ)。如此一來，已被證實的是，由本發明所提供之方法進行的定量檢測能夠可靠地對各種生物來源之SCFAs進行檢測。
在實例2中，將通過本發明所提供之方法對受到壓力之老鼠(stressed rats)之糞便中的SCFAs進行定量。請參閱圖5，圖5為本發明一實例中患病小鼠及控制組小鼠之間的糞便中SCFAs濃度之示意圖。圖5中之總SCFA代表AA、PA及BA之總和。顯著差異性(statistical significance)藉由未配對司徒頓t測試(unpaired Student’s t-test)(*P值<0.05)而評估。誤差條代表標準差。
首先，在實例2中，本發明之發明人等使用pDART-MS平台對21個老鼠糞便樣本中SCFAs進行定量。控制組及誘發USMS(unpredictable chronic mild stress)組的老鼠數量分別為10及11隻。接著，如前所述般對老鼠糞便進行前處理步驟及衍生化步驟，並如前述般對檢測物進行裝載步驟及檢測步驟。如圖5所示，三種SCFAs，包括乙酸、丙酸及丁酸被偵測到(定性)及定量，其中乙酸具有高濃度(大約每克糞便2毫克)，而丙酸及丁酸具有相對低的濃度。此實驗結果與已公開文獻(Kelly,J.R.；Borre,Y.；O’Brien,C.；Patterson,E.；El Aidy,S.；Deane,J.；Kennedy,P.J.；Beers,S.；Scott,K.；Moloney,G.；Hoban,A.E.；Scott,L.；Fitzgerald,P.；Ross,P.；Stanton,C.；Clarke,G.；Cryan,J.F.；Dinan,T.G.J.Psychiatr.Res.2016,82,109-118.)之情形吻合。
對兩組老鼠之實驗結果進行比較，本發明之發明人等發現控制組中之丁酸濃度為0.82±0.41mg/g，而誘發UCMS組中之丁酸濃度為1.29±0.60mg/g；控制組中之SCFAs總含量為2.88±0.76，而誘發UCMS組中為3.80±1.13mg/g，即在誘發UCMS組中有些微上升。然而，對於醋酸及丙酸的濃度在兩個組別之間無明顯差異。
為了確認本發明所提供之方法的穩定性、可靠性及效果，本發明之發明人等在同日採用傳統的HPLC方法對同一批樣本進行SCFAs的定量，並獲得了高度一致性的結果。因此，已確認的是本發明所提供之方法為能夠對糞便中之SCFAs進行定量之穩健方法。
更重要的是，與傳統分析方法，如LC-MS相比，本發明所提供之通過pDART-MS平台進行之檢測方法由於具有極短的檢測時間而更具優勢。詳細而言，對於實例2中之21個老鼠糞便樣品，pDART-MS及HPLC方法中對於前處
理步驟及衍生化步驟皆耗時約4小時，然而，在使用儀器進行檢測的檢測步驟中，pDART-MS可節省例如數十個小時的時間。
於實例3中，使用本發明所提供之pDART-MS檢測方法定量透析依賴性CKD病患之血清中SCFAs。請參閱圖6，圖6為具透析依賴性之慢性腎臟病(ESKD)患者之血清中SCFAs濃度之示意圖。對於透析依賴性CKD病患及健康控制組之四個血清中之SCFAs，包括乙酸、丁酸、戊酸及乳酸被量測。具體而言，由實驗結果顯示，血清中之SCFAs主要為乳酸(約2000μM)，而其他SCFAs之等級為自40至400μM。此結果與現有技術相似。
再者，於實例3中，與健康控制組相比，透析依賴性CKD病患之血清中的醋酸等級高出兩倍，而血清中丁酸、戊酸(包括直鏈級分支型異構物)、乳酸及總SCFA的等級被顯著降低。相對地，經實驗證實，在第5階段(stage 5)非透析依賴型CKD病患及健康個體之間，血清中之SCFAs等級並無太大差異。
如前所述，在CKD發展期間，SCFAs所扮演的生理角色仍然是有待研究的。Wang et al.(Wang,S.；Lv,D.；Jiang,S.；Jiang,J.；Liang,M.；Hou,F.；Chen,Y.Clin.Sci.2019,133,1857-1870.)已針對處於不同階段之CKD病患與健康個體之血清中SCFA等級進行比較，並指出血清中SCFAs可作為評估腎功能的生物標記。在此文獻中，研究人員證實相較於健康個體，在所有階段之CKD病患之血清中丁酸濃度的降低，而在第1-4階段CKD病患之血清中乙酸濃度些微降低，而第5階段之病患之血清中乙酸濃度並未降低。與此相似的是，基於本發明實例3之結果，本發明之發明人等發現對於透析依賴性CKD病患，血清中之丁酸、
丁二酸及乳酸濃度皆降低，此經推測是由於血液透析會將血清中之SCFAs移除的緣故。
相對地，與以上文獻中相反的是，在實例3中，透析依賴性CKD病患血清中之醋酸等級是升高的。乙酸已知為腸道微生物發酵的最終產物之一，然而，其循環等級(circulating level)是與葉酸依賴性乙醯輔酶A水解(folate-dependent acetyl-CoA hydrolysis)相關，此水解反應中，乙醯輔酶A在葉酸的存在下被芳胺N-乙醯轉移酶(arylamine N-acetyltransferases，NATs)水解以釋出乙酸。因此，推測此NAT依賴性途徑可能導致透析依賴性CKD病患之血清中醋酸的增加，由於在葉酸的定期補給為此疾病之控制的建議手段。據此，本發明所提供之方法能夠用以評估CKD病患血清中作為生物標記之SCFAs的濃度變化。
在實例4中，係針對由微生物細胞工廠直接自發酵培養基所生產之SCFAs進行檢測。事實上，通過經設計(engineered)之微生物進行的生化生產已被認為是下一世代之綠化學生產(green chemical production)。在實例4中，光能自營性(photoautotrophic)藍綠藻聚球藻菌(cyanobacteria Synechococcus elongatus)PCC 7942菌株，包括ML1、KU21及LAN3的培養基被測試。重要的是，這些聚球藻菌菌株已被經代謝設計用以經由光合成有效地生產特定SCFAs。詳細而言，ML1、KU21及LAN3能夠在陽光下利用二氧化碳分別生產丁酸、3-羥丁酸及丁二酸。在此，這些菌株被培養，隔日收集其等之培養基並以本發明所提供之pDART-MS平台對其中之SCFA生產進行定量檢測。
請參閱圖7a至7d。圖7a為用於本發明一實例中之菌株，包括野生種(wild-type，WT)及三種被經代謝設計之菌株的生長曲線，而圖7b至7d為經過代謝設計之藍綠藻聚球藻菌菌株所生產之發酵SCPAs的濃度變化示意圖。在實例4中，能夠在早至培養後(postinoculation)的第二天偵測到SCFA的生產。再者，隨著細菌生長，累積之SCFAs之量被定量，並顯示與先前研究結果有絕佳一致性。因此，實例4佐證了本發明所提供之方法具有能夠併入化學工程工業領域之分析架構內的潛力。
綜上所述，本發明的主要技術手段在於，本發明實施例所提供的檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，是通過對傳統上難以直接進行分析之生物樣品中之短鏈脂肪酸進行衍生化處哩，再配合紙片作為取樣基材以常壓游離質譜法中之即時直接分析游離質譜法進行偵測，如此一來，本發明能夠在極短時間內完成樣品分析，且達到與傳統層析方式相當的定量結果。
詳細而言，本發明之發明人等所提出之方法是在常壓條件下利用pDART-MS對生物樣品中之短鏈脂肪酸進行定量檢測。此方法能夠同時對多種短鏈脂肪酸進行定量檢測，且檢測時間耗時極短(少於1分鐘)。因此，針對較大的生物樣品分析需求，相較於現有技術以分離技術為主的方法，本發明所提供的方法具有更大的效益。
再者，此方法涉及採用具成本效益之化學試劑對生物樣品中之短鏈脂肪酸進行溫和(mild)衍生化的步驟，且在衍生化步驟後，可以直接利用商用的設備進行檢測。據此，本發明所提供的方法可以輕易地適用於各種制度化的質譜實驗室中。
另外，基於現今對於腸道微生物代謝物，特別是短鏈脂肪酸的研究興趣之增加，本發明的發明人等咸信此新穎之檢測方法具有加速腸道微生物群之研究進展的潛力，並藉此對微生物學及生物學之研究領域有所助益。
雖然本發明之實施例係以上述較為詳細的方式揭示，所屬技術領域具有通常知識者可以了解本發明之各種修飾得以在不背離界定於所附之申請專利範圍中之本發明的範圍之下進行。因此，本發明之實例的進一步修飾將不會偏離本發明之技術範圍。
Claims (9)
- 一種用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其包括：一衍生化步驟，其包括以2-硝基苯肼(2-NPH)處理該生物樣品中之該短鏈脂肪酸，以使該短鏈脂肪酸衍生化而生成一檢測物；一裝載步驟，其包括將該檢測物裝載於一紙片載體上，其中，該紙片載體為濾紙；以及一檢測步驟，其包括以即時直接分析游離質譜法(DART-MS)對裝載於該紙片載體上的該檢測物進行分析，以獲得一檢測結果。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，該生物樣品是選自於由生物之血清、血漿、組織、排泄物、代謝物之發酵物及其等之衍生物所組成之群組的至少一者。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，在該衍生化步驟前，還進一步包括一前處理步驟，其包括以一試劑對該生物樣品進行萃取，以獲得包括該短鏈脂肪酸之一混合物。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，該衍生化步驟包括使2-硝基苯肼與該短鏈脂肪酸進行醯胺化反應以生成該檢測物。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，該檢測步驟中之檢測時間為介於0.1至2分鐘。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，該短鏈脂肪酸包括選自於由乙酸、丙酸、丁酸、丁二酸、乳酸、戊酸及3-羥基丁酸所組成之群組的至少一者。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，該裝載步驟還進一步包括將介於0.5微升至1微升之該檢測物裝載於該紙片載體上。
- 如請求項1所述之用於檢測生物樣品中之短鏈脂肪酸的方法，其中，該檢測結果為一定量檢測結果。
- 一種用於診斷慢性腎臟病的方法，其包括：一採樣步驟，其包括自一生物體取得包括至少一短鏈脂肪酸的一生物樣品；一衍生化步驟，其包括以2-硝基苯肼(2-NPH)在活體外處理該生物樣品中之該短鏈脂肪酸，以使該短鏈脂肪酸衍生化而生成一檢測物；一裝載步驟，其包括將該檢測物裝載於一紙片載體上；一檢測步驟，其包括對以即時直接分析游離質譜法(DART-MS)對裝載於該紙片載體上的該檢測物進行分析，以獲得一檢測結果；以及一分析步驟，其包括對該檢測結果進行分析以獲得一診斷結果。
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| 期刊 Esgalhado et al., "Short-chain fatty acids: a link between prebiotics and microbiota in chronic kidney disease", Future Microbiology, 12(15), 2017. |
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