CN110283234B - 一种源于牦牛血的抗氧化肽及其制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有强抗氧化活性的牦牛血抗氧化肽，其序列为TLPDTEKQIKKQ，其还原力达到3.24mg·mL^‑1、脂质过氧化抑制能力达到2.43mg·mL^‑1、·OH清除力达到0.74mg·mL^‑1、ABTS⁺·清除力达到1.58mg·mL^‑1、DPPH·清除力达到1.59mg·mL^‑1、总抗氧化力达到4.27mg·mL^‑1，具有极高的使用前景，可用于制备相应的抗氧化制剂并用于相关抗氧化的应用领域上。

Description

一种源于牦牛血的抗氧化肽及其制剂和应用

技术领域

本发明属于涉及抗氧化肽技术领域，具体涉及一种源于牦牛血的抗氧化肽及其制剂和应用。

背景技术

牦牛是散布在海拔 3000 米以上的一种特殊的半原始半野生的珍稀物种，由于特殊生态环境和极强的自然选择，牦牛显示出对低氧环境极好的适应性，能适应一般家畜不能适应的高海拔、低气压、高缺氧等恶劣的生态环境。中国是牦牛的发源地，与我国毗邻的蒙古、中亚地区以及印度、不丹、锡金、阿富汗、巴基斯坦等国家或地区均有少量分布，欧美等国也引入牦牛饲养，但数据未见其报道。根据国家肉牛牦牛产业技术体系研发中心提供的数据，目前我国牦牛存栏增至约 2000 万头，占全世界总量的 95% 左右，主要集中在青海、四川、甘肃、西藏、新疆和云南等六省区的高海拔区域。根据红原综合实验站（四川省草原科学研究院）、牦牛种质资源评价研究岗（西南民族大学）、甘孜综合实验站（甘孜州畜牧科学研究所）于 2017 年 5 月 4 日 — 5 月 22 日开展的四川牦牛产业实地调研结果显示，四川省牧区包括甘孜、阿坝、凉山 3 个州的 48 个县（市）的牦牛数量统计数据为 400余万头，估计实际数量约 550 万头，数量仅次于青海和西藏，位居全国第三；主要分布于甘孜州（约 211 万头）和阿坝州（约 192 万头），少量分布于凉山州（约 8 万头），雅安地区有零星分布。

牦牛主要生活在海拔 2500～5000 m 的高海拔地区和青藏高原地区，为适应严寒、低氧、强紫外线辐射、饲草资源缺少的恶劣环境，经过长时间的自然选择，牦牛在生理生化指标、解剖结构和基因功能等方面都已获得基本的低氧适应性。

早期对牦牛低氧适应性研究主要集中在牦牛各组织器官的变化，冯秋菊等报道牦牛的气管短而粗，断面呈半月形，气管软骨环两端间的距离大，软骨环两端间的肌肉长而发达，这些组织结构特点适应高频率呼吸。魏青等利用常规组织学方法系统地对高原牦牛和平原黄牛气管组织学结构进行观察，结果表明，高原牦牛的杯状细胞显著多于平原黄牛，气管黏膜下层以浆液腺为主，气管中软骨基质均匀丰富。这些组织结构特点有助于牦牛加湿进入气道内的空气，黏附进入气道内异物，软骨弹性的增加有利于气管收缩。陆天才等报道牦牛的胸腔、心肺较普通牛发育良好，心肺指数较高，气管解剖特征也能适应高频速呼吸，其红细胞和血红蛋白含量亦高于黄牛。张勤文等对成年牦牛肺脏进行解剖学研究，结果发现，牦牛单位面积肺泡数多且肺泡隔厚度随海拔的增加而增多，肺泡隔内毛细血管丰富并呈半透明薄膜状结构，在肺泡隔中占很大的比例，以上组织结构特点有助于牦牛提高低氧环境下气体交换的能力。蒋寒丹等运用免疫组织化学方法对成年牦牛肺脏中 CTGF 和FGF-2 的准确分布位置和表达量进行了研究，结果表明，CTGF 和 FGF-2 共同促进了成年牦牛肺脏对高原适应性结构的形成和维持。对牦牛心脏解剖显示，牦牛右心室肉柱侧壁与室间相连处较明显，左心室肉柱较少且位于隔壁下部，心脏主动脉半月瓣比较发达，在心脏主动脉口的纤维环处出现心骨。张勤文等对不同发育阶段大通牦牛骨骼肌组织学结构进行了研究，主要表现为肌纤维直径逐渐增粗，表面积降低，胶原纤维含量先升高后降低、微血管密度先降低再升高、线粒体平均体积先降低再升高、面数密度先升高再降低，体密度逐渐增加的特点。另外，车发梅等对不同海拔地区牦牛血红蛋白、肌红蛋白含量进行了检测，结果表明，在高原低氧环境中心肌、骨骼肌中 Mb 和血液中 Hb 含量与牦牛适应低氧环境密切相关。Moore等证明高原土著动物肌肉中 Mb 含量比低海拔同种人和动物高。陈成忠等提出在低氧环境下为给机体细胞提供足够的氧气，牦牛主要是通过提高血液中红细胞数目和血红蛋白含量从而增加血红蛋白与氧的结合能力来实现的。

近年来对牦牛低氧适应性的研究主要集中在牦牛基因组学。胡佩莹等研究了高原低氧环境下不同发育期大通牦牛心肌组织发育学特点，结果发现大通牦牛心肌细胞线粒体数目、体积以及心肌组织 SDH、COX、HIF-1α mRNA 的表达量、心肌组织 VEGF、MVD 蛋白百分比含量均随年龄增长呈稳定上升趋势。心肌组织 HIF-1α 表达量增加，线粒体标志性酶COX、SDH 氧化磷酸化作用调控加强使组织细胞快速复氧增加，从而有助于心肌组织的供氧供能。HIF-1α 在细胞核内快速积累，进而诱导机体内 VEGF、MVD 因子表达可调节氧分压防止低氧对细胞造成损伤。古松等对牦牛肌红蛋白的 cDNA 序列进行了测定并对其氧化特性进行了研究，结果表明，牦牛适应高原的低氧环境不是通过改变其肌红蛋白氨基酸序列从而引起蛋白质结构的变化来实现的，提高肌红蛋白在体内的含量以及减缓肌红蛋白和脂类的氧化速率则可能是牦牛对高原低氧适应的原因之一。吴晓云等分析了牦牛和高原地区黄牛 EPAS1 和 VEGF-A 基因的 mRNA 在不同组织中的相对表达量，结果表明，黄牛在进入高原后，其适应低氧环境的生理调节主要发生在肺、肝和脾中，肺部表达量不同，说明低氧适应可能与基因表达量有关且低氧适应调节主要在肺和脾。EPAS1 基因中检测到 3 个特异性的 SNP，群体中的SNP 位点都是高度连锁的状态，某一基因型表现显著的海拔差异性，且EPAS1 基因对 VEGF-A 基因也有调控作用。另外，牦牛VEGF-A 基因中检测到 2 个 SNP，PCR-RFLP 分型认为在 SNP g.15853G ＞ A位点上 G ＞ A 可更好地适应高原低氧，中性检测证实 2 个位点受牦牛所处地理环境的选择作用。胡泉军对人、黄牛和牦牛的基因组数据进行了全基因组比对，对 8923 个高质量的同源基因进行自然选择分析，识别了 3 个（Adam17、Arg2、Mmp3）与低氧应答相关的正选择基因，这些基因可能与牦牛在高原地区牧草资源稀缺的环境下维持高效的能量代谢以及低氧环境生存密切相关。Karen等创建了 1 个涵盖了 300 多个低氧上调表达的表达序列标记和基因文库，且这些低氧调节相关基因已通过微阵列分析法、实时 PCR 法和蛋白印迹法得到验证。刘世明等对青海不同海拔牦牛血液中低氧相关因子（HIF-2α、ACE、ACE2、EPO）含量进行了测定，结果显示，高海拔牦牛血液中低氧因子含量相对较高，且随着海拔的升高，ACE、HIF-2α 含量有逐渐降低趋势，EPO 含量基本没有变化。王德朋等对青海家牦牛 HIF-1α 基因组织的特异性表达进行了研究。结果表明，HIF-1α 基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、睾丸组织中均有表达，其中以睾丸和脾中HIF-1α 基因表达量最高，肌肉的表达量最低。钟金城等对牦牛几个功能基因的结构及其系统进化进行了研究，结果发现，牦牛品种间及与三江黄牛种间在 EPO 氨基酸序列上更为保守，但也存在差异；对不同地区牦牛 EPO 基因多态性分析发现其遗传多样性比较丰富，基因型与牦牛所处海拔有明显关系。张全伟根据基因芯片筛选结果将血红素加氧酶 1（HO1）作为牦牛高原适应性的候选之一对其进行克隆研究，结果显示牦牛肺组织 HO1 基因表达量最高，且肺组织 HO1 蛋白表达具有明显的优势，结果揭示 HO1 的功能可能与呼吸系统有密切的关系。王则夫对牦牛和藏羚羊高海拔适应机制的趋同进化进行了研究，生理生化水平的研究发现它们都具有血细胞含量增加、心肺体积增大等特征；牦牛与藏羚羊共有的加速进化的 GO 分类只有 118 个，但是其中很多都与高海拔环境适应相关，其中 SOCS4基因在牦牛与藏羚羊间发生了显著的趋同进化，研究发现 SOCS4 基因可能是导致牦牛与藏羚羊血氧系统趋同进化的原因之一，对于牦牛与藏羚羊在高海拔环境中的生存具有重要意义。邱强应用第二代高通量测序技术完成了牦牛基因组序列图谱的绘制工作，通过与低海拔黄牛的基因组序列比较，发现牦牛的 ω (Ka/Ks) 显著高于黄牛，且牦牛中参与线粒体氧化磷酸化和低氧应答途径的基因发生了更多的适应性进化。

关于血液蛋白来源的外源性抗氧化肽的研究主要集中在牦牛血、猪血、鹿血、鸭血。唐雯倩利用胰蛋白酶酶解猪血制备抗氧化肽，再经凝胶层析得到抗氧化性最好的峰Ⅳ，7.5mg/mL 的猪血抗氧化肽 Ⅳ 的还原力 1.36、总抗氧化能力（ABTS） 2.45 mM。翟学超等研究了 4 种不同分子质量段的鹿血抗氧化肽的活性，发现分子质量 <3 kDa 肽段的DPPH 自由基清除能力、亚铁还原能力最强。马利华等采用复合酶（木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的比例为 2:1）酶解鸭血制备抗氧化肽，鸭血抗氧化肽的 SN-TCA 指数为 49.13%，DPPH· 清除率为80.75%。布冠好等采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶及风味蛋白酶酶解鹅血血红蛋白制备抗氧化活性肽，制备的活性肽对 DPPH· 自由基的清除率为89.6%。

目前，所得的牦牛血抗氧化肽为多种肽的混合物，对于牦牛血中何种多肽具有优秀的抗氧化能力，目前还不得而知。因此，寻找其中具有优秀抗氧化能力，特别是所得肽的总抗氧化力和还原力是否可以分别大于4 mg•mL^-1和3mg•mL^-1是一项值得研究的课题。

发明内容

针对现有技术的不足和需求，本发明的目的之一在于提供具有一种源于牦牛血的抗氧化肽，以IC ₅₀ 值计，其总抗氧化力大于4 mg•mL^-1，脂质过氧化抑制能力大于2mg•mL^-1，还原力大于3mg•mL^-1，所述牦牛血抗氧化肽的序列为：

TLPDTEKQIKKQ。

在本发明的发明人团队的前期研究中，虽然已发现采用枯草芽孢杆菌（SICC1.197）联合碱性蛋白酶可制备出具有体外抗氧化活性的牦牛血抗氧化肽，且当利用Sephadex G-25 凝胶层析法对分子量 < 5 kDa 的组分进一步分离时，所得的一种组分的对 ·OH 的清除能力最高，IC ₅₀ 值可达 0.72 mg/mL。不过对于牦牛血中是否存在如本发明所述的高抗氧化性肽及其肽段信息，在本发明之前尚未得知。

在本发明的研究过程中，本发明采用 LC-MS/MS的方法检测牦牛血抗氧化肽肽段的组成及其序列，当选择分子量 < 5 kDa 的牦牛血抗氧化肽进行检测时，得到1159 条肽段。我们对所得肽段进行体外抗氧化性的检测，发现序列为KFWGKYLYEIARRHPYFYAPE的肽具有高抗氧化性，以IC ₅₀ 值计，其还原力达到3.24mg•mL^-1、脂质过氧化抑制能力达到2.43mg•mL^-1、·OH清除力达到0.74mg•mL^-1、ABTS^＋·清除力达到1.58mg•mL^-1、DPPH·清除力达到1.59mg•mL^-1、总抗氧化力达到4.27mg•mL^-1。

基于本发明所得肽的抗氧化性优异，显而易见，本发明的肽可用于制备相应的制剂。因此，本发明的另外一个目的在于提供含有上述牦牛血抗氧化肽的制剂。

本发明的另外一个目的在于提供利用修饰材料对商所述牦牛血抗氧化肽进行修饰后所得的修饰多肽，所述修饰材料包括纳米材料、荧光材料或者酶。

本发明还有一个目的在于提供上述牦牛血抗氧化肽在抗氧化方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明得到了一种具有强抗氧化活性的牦牛血抗氧化肽，以IC ₅₀ 值计，其还原力达到3.24mg•mL^-1、脂质过氧化抑制能力达到2.43mg•mL^-1、·OH清除力达到0.74mg•mL^-1、ABTS^＋·清除力达到1.58mg•mL^-1、DPPH·清除力达到1.59mg•mL^-1、总抗氧化力达到4.27mg•mL^-1。具有极高的使用前景，可用于制备相应的抗氧化制剂并用于相关抗氧化的应用领域上。

附图说明

图1为本发明中牦牛血抗氧化肽质谱基峰色谱图；

图2为本发明中牦牛血抗氧化肽总离子流色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1、材料与试剂

牦牛血：牦牛来自四川红原牧场，由四川省大渡河食品有限公司屠宰；蛋白酶 K：德国 MERCK 公司；碱性蛋白酶（酶活力为 85.61 U/mg）：上海 Kayon 公司；枯草芽孢杆菌SICC1.197：四川省微生物资源平台菌种保藏中心；大豆肽、鱼胶原肽：中食都庆（山东）生物技术有限公司提供，其质量指标见表 2-1；其他化学试剂均为国产分析纯。

2、仪器与设备

超滤管（< 5 kDa）：德国Sartorius公司；超滤管（< 1 kDa）：美国 Pall公司；H2050R 台式高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司；QYC-2102C 恒温振荡培养箱：上海福玛实验设备有限公司；UV Power 紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；各规格移液枪：德国 Brand 公司；LGJ-50F 冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；A300 自动氨基酸分析仪：德国曼默博尔公司；Mission 血红蛋白分析仪：艾康生物技术（杭州）有限公司；ELEOS System 凝胶色谱仪：美国 WYATT 公司；NanoAcuity 超高压纳升级液相色谱：美国 Waters公司；Q Exative质谱仪：美国 Thermo Scientific 公司。

3、实验方法及步骤

3.1 培养基的配制与菌液制备

将枯草芽孢杆菌于活化培养基活化后，接种于种子培养基，35℃、135 r/min 恒温振荡培养 12 h，得到实验用菌液（1×10⁹ /mL），培养基配制参数如表1。

表1培养基的配置

培养基成分	葡萄糖	蛋白胨	牛肉膏	氯化钠	琼脂	pH
							活化培养基（g•L<sup>-1</sup>）	10	10	10	5	20	7.0
种子培养基（g•L<sup>-1</sup>）	10	10	10	5	0	7.0

3.2 牦牛血抗氧化肽的制备

工艺流程如下：

75 g 牦牛血液溶解在 1 L 蒸馏水→高压灭菌（121 ℃，15 min）→冷却至 35℃，接种菌液（参照 2.2.1.1 制备），接种量 2.5%（v/v）→35℃、135 r/min、72 h 恒温震荡培养→发酵结束后经高温灭菌（121℃，15 min）→冷却至 60℃，加入碱性蛋白酶酶解（酶底比190 U/g，pH 9.5，60℃，3 h）→酶解结束后沸水水浴灭酶活10 min→离心（4℃，6000 r/min，15 min）→取上清液用 0.45 μm 滤膜抽滤去除菌体残渣→取上清液离心（5 kDa 超滤管，4 ℃，4000 r/min，10 min）→上清液即是分子量 < 5 kDa 的牦牛血抗氧化肽。

4、 牦牛血抗氧化肽肽段组成及其序列测定

4.1 牦牛血抗氧化肽的脱盐

吸取100 μL 样品溶液，添加100 μL 0.1% TFA 水溶液。使用 200 µL 0.1% TFA，80% 乙腈活化除盐柱。使用 400 µL 0.1% TFA 水溶液平衡除盐柱。将样品加入除盐柱内，使样品缓慢流过除盐柱，多肽被除盐柱捕集，盐等其它非疏水性小分子流出舍弃。再添加200 µL 0.1% TFA 水溶液清洗除盐柱，洗去残留盐类。添加 300 µL 0.1% TFA，80% 乙腈溶液，使液体缓慢流过除盐柱，将多肽洗脱下来，使用新 EP 管收集洗脱溶液，洗脱液冷冻干燥。

4.2 牦牛血抗氧化肽 LC-MS/MS 分析

采用 NanoAcuity 超高压纳升级液相色谱系统进行分离。液相 A 液为 0.1%

甲酸-水溶液，B 液为 0.1% 甲酸-乙腈溶液。样品以 200 µL A 相溶解，由自动进样器吸取 2 µL 样品后，以 10 µL/min 流速传送到捕集柱上捕集 2 min。捕集柱上的样品在分析柱上进行色谱分离，流速为 300 µL/min，B 液相梯度如表 2。

表2 Nano LC 液相梯度

Q Exative 质谱仪离子源喷雾电压为 2.0 kV，加热毛细管设定为 300℃，采

用数据依赖模式自动在 MS 和 MS/MS 间切换采集。全扫描 MS 使用 Orbitrap进行一级扫描，扫描范围为 m/z 350～1600，分辨率设定为 70,000 (m/z 200 处)。离子最大引入时间为 50 ms，自动增益控制（Automatic gain control, AGC）设定为

5 x 105，随后使用高能碰撞解离（Higher energy C-trap dissociation, HCD）对符合

串级（MS/MS）碎裂条件的强度前 10 名母离子进行碎裂并用 orbitrap 进行扫描，

扫描分辨率设定为 17,500。扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围

固定为 m/z=100 处，最高到 2000。进行 MS/MS 的最低离子强度值设定为 50,000。MS/MS 时离子最大引入时间为 100 ms，AGC 控制设定为 1.0 x 105，母离子选择窗口设定为 2 Da。对于 2、3、4 电荷数的离子进行 MS/MS 采集，动态排除设定为每个母离子在10 s内进行 1 次 MS/MS，之后排除 30 s，30%的碰撞能量。

4.3 Mascot 搜库定性及非标记定量

原始文件导入 Proteome Discovery 软件（version 1.4.0.288, thermo FisherScientific）进行数据分析，mascot（version 2.3.2 , Matrix Science）进行搜索，搜索结束后，Proteome Discovery 软件根据 mascot 搜索结果进行数据整合卡值。数据库为universal protein 数据库（下载于 2019 年 2 月 2 日），点击 Taxonomy 进入 Bos（oxen, cattle），共 53517 条序列，其中收录已人工注释并验证过的序列 6077 条，未验证注释的序列 47440 条，使用 percolator 算法控制肽段数据的假阳性率 (FDR，falsediscovery rate) ≤ 1%，主要参数见表 3。

表3 数据库检索参数

4.4牦牛血抗氧化肽体外抗氧化活性的测定

·OH 清除率参照 TIAN F（TIAN F, LI B, JI B P, et al. Antioxidant andantimicro-bial activities of consecutive extracts from Galla chinensis:Thepolarity affects the bioactivities[J]. Food Chemis-try,2009,113( 1) : 173-179）等的方法、抑制脂质过氧化能力参照 CHEN NF等（CHEN NAIFU. Study on theextraction of flavonoid compound in pteridium aquilinum and its antioxidantproperty[J].Food and Fermentation Industries,2003,

29(11):63-67）方法、还原力参照刘昭明等（刘昭明,黄翠姬,孟陆丽,等.核桃蛋白酶解物的抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业,2009,35(1):58-61.）的方法、ABTS＋· 清除率参照潘瑶等（潘瑶,郑时莲,邹兴平,等.葡萄、芒果、草莓乙醇提取物抗氧化活性组分分析及其抗氧化相互作用[J]. 食品科学,2017,04:133-140.）的方法、DPPH· 清除率参照朱夕波等（朱夕波.鲨鱼皮和猪皮胶原蛋白及其抗氧化活性酶解物的特性研究[D].上海海洋大学,2008.）的方法、总抗氧化力参照 YANG M等（YANG M, SHEN Q, LI L Q, et al.Phytochemical pro-files, antioxidant activities of functional herb Abrus can-toniensis and Abrus mollis[J].Food Chemistry, 2015, 177: 304-312.）的方法。

半抑制浓度( IC50 ) 值的测定参考本研究前期实验的方法。将样品稀释成不同浓度(实验点 ≥ 5)，分别测定其 ·OH 清除率、还原力、ABTS＋· 清除率、DPPH· 清除率、抑制脂质过氧化能力、总抗氧化力。以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制成圆滑曲线，根据曲线计算 IC50 值。

5结果与分析

5.1 牦牛血抗氧化肽肽段组成及其序列分析

采用 LC-MS/MS的方法检测牦牛血抗氧化肽肽段的组成及其序列，本检测方法的扫描范围为 350 Da～5000 Da，为了更全面的了解牦牛血抗氧化肽的肽段组成及序列，故本实验选择分子量 < 5 kDa 的牦牛血抗氧化肽进行检测。质谱基峰色谱图见图1，总离子流色谱图见图2。

根据质谱基峰色谱图以及总离子流色谱图的结果进行 Mascot 搜库分析，结果见表 4，搜库定性及非标记定量到 1159 条肽段。

表4 搜库分析结果

类别	数目
		全部串级谱图数	26955
匹配串级谱图数	3889
		肽段数	1159
蛋白总数	261
		蛋白组总数	65

我们随机选择了其中180条肽段进行上述抗氧化性项目的检测，其中，总抗氧化性介于2.0~3.0mg•mL^-1的有173，大于4.0mg•mL^-1的5条，脂质过氧化抑制能力大于3.0mg•mL^-1的有3条。表5所示的是其中7条总抗氧化性大于3.0mg•mL^-1的肽段及1条DPPH·清除力相对较好的肽段的抗氧化肽肽段的体外抗氧化活性 IC50 值。

表5 8 条牦牛血抗氧化肽肽段的体外抗氧化活性 IC ₅₀ 值

序列表

<110> 四川旅游学院

<120> 一种源于牦牛血的抗氧化肽及其制剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln

1 5 10

Claims (3)

1.一种源于牦牛血的抗氧化肽， 其特征在于，以 IC50 值计， 其总抗氧化力大于 4mg•mL^-1，脂质过氧化抑制能力大于 2mg•mL^-1，还原力大于 3mg•mL^-1， 所述牦牛血抗氧化肽的序列为： TLPDTEKQIKKQ。

2.含有权利要求1所述牦牛血抗氧化肽的制剂。

3.权利要求1所述一种源于牦牛血的抗氧化肽在制备抗氧化方面药物的应用。

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