CN104693272A

CN104693272A - 牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽及其应用和组合物

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Publication number: CN104693272A
Application number: CN201510077780.4A
Authority: CN
Inventors: 任发政; 田劢; 赵亮; 郭慧媛; 张昊
Original assignee: Individual
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN104693272B

Abstract

本发明提供了牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽及其应用和组合物，所述抗氧化三肽的氨基酸序列为GTW、CQC、LFC和QKW。所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽在体外表现出很高的抗氧化活性，其铁离子还原抗氧化能力均大于0.10 mol Fe³⁺/mol肽，最高达0.68 mol Fe³⁺/mol肽，在本发明测定条件下活性高于谷胱甘肽活性（0.27 mol Fe³⁺/mol肽）的两倍；由于本发明提供的三肽为小分子肽，能够经过吸收直接进入血液循环，从而起到抗氧化活性的作用，能够应用于抗氧化活性的功能食品、保健品或药物中。

Description

牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽及其应用和组合物

技术领域

本发明涉及功能乳品技术领域，尤其涉及牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽及其应用和组合物。

背景技术

随着年龄的增长，机体正常的氧化还原平衡被破坏，产生越来越多的活性氧（ROS），脂类、蛋白质和DNA就会发生氧化反应导致机体的损伤进而加速衰老、引起如糖尿病、关节炎、动脉粥样硬化等多种疾病的发生。近年来，这些疾病的发病率呈现出不断上升的趋势。研究发现，通过膳食供应来提高机体的抗氧化能力是降低机体氧化应激水平的一种现实可行的方法，可以消除一些衰老所带来的负面影响。相较于合成的抗氧化剂，如BHT、BHA、没食子酸丙酯等，抗氧化肽安全性高，毒副作用小，有些还具有多重生物活性，增强其生理功能，更进一步降低疾病发生、发展的危险。抗氧化肽是一类具有抗氧化活性的多肽物质，通常2-20个氨基酸。这些多肽的氨基酸序列和长度各不相同，但是具有类似的活性，大多通过减缓或者终止氧化过程中的链式反应来发挥作用。

近年来，抗氧化肽越来越受到关注，目前已从乳蛋白、大豆蛋白和海洋生物等不同来源的食源性蛋白质水解分离得到具有良好抗氧化活性的肽段。其中，一些从乳清蛋白水解得到的肽段在体外实验中活性可以达到甚至超过了合成抗氧化剂BHT、BHA，是良好的抗氧化肽的来源（刘志东,郭本恒,王荫榆,蒋士龙,李云飞. 乳源抗氧化肽的研究进展[J].食品科学,2009,30(01):282-286.）。

乳清蛋白是乳沉淀酪蛋白后分离出来的蛋白质，它具有很高的生物利用价值，富含多种必需氨基酸，是国际上公认优质的人体蛋白质补充剂之一。乳清蛋白主要存在于乳清中，是利用牦牛乳生产曲拉及干酪素过程中的副产物。如果可以将其有效利用，既可以解决乳清对环境的污染又能够使其中营养物质得到充分的利用。利用我国特有的牦牛乳蛋白资源，研究及开发具有抗氧化生物活性肽，对拓展乳功能性食品及新药开发领域，增进乳的开发与利用价值，有一定的理论指导意义，对人类健康事业的发展具有较大的促进作用。

发明内容

本发明的目的是提供具有抗氧化活性的三肽及其多肽衍生物，该三肽具有较高的抗氧化活性并能应用于抗氧化功能食品、保健品及药品中。

本发明的发明人对牦牛乳乳清蛋白活性肽进行了长期系统性研究，发现源自乳源蛋白的某些未报道具有抗氧化活性的三肽有与谷胱甘肽相近的抗氧化活性，由此完成了本发明。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的具有抗氧化活性的三肽氨基酸序列为GTW、CQC、LFC、或QKW。

优选地，本发明提供的三肽氨基酸序列为GTW或CQC。

进一步的，所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的多肽衍生物，所述多肽衍生物为所述抗氧化三肽的氨基酸被氨基化、或环化、或L-型氨基酸变为D-型氨基酸。

一种牦牛乳乳清蛋白抗氧化肽组合物，所述抗氧化肽组合物为抗氧化三肽GTW、CQC、LFC和QKW中两种或几种的混合物。

所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制备方法，从天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分离纯化，或人工合成方法得到。

进一步的，所述从天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分离纯化的方法包括以下步骤：

牦牛乳经过脱脂、酸凝沉淀得到上清，将上清液用1M NaOH调节pH值5.2，加热温度达80-90℃，得到沉淀即为乳清蛋白。

步骤1：将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳。

步骤2：将所得脱脂乳在35-50℃范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，6000 rpm离心20 min后，得到上清液。

步骤3：将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加1M NaOH调节pH值5.2，再加热至80-90 ℃，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉。

步骤4：将上述步骤所得乳清蛋白冻干粉溶于0.05mol/L NaOH溶液中制成质量浓度为5 %的乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶进行水解反应，酶与乳清蛋白的比为1800 U/g，用恒温水浴箱及1 M NaOH溶液分别调整酶解温度为45 ℃和pH值为7.0，水解3h。

步骤5：将步骤4所得酶解液调节其pH值至4.2，4200 rpm条件下离心20 min，取上清液调节pH值至7.0。

步骤6：对步骤5所述酶解产物进行二级超滤。采用超滤杯设备，板式膜组件，先后采用分子截留量分别为10KDa、6KDa亲水性聚醚砜膜，进行二级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7.0，操作压力0.15 MPa，温度45℃。初步得到具有抗氧化活性的滤液。

步骤7：将步骤6所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品经SephadexG-25凝胶层析柱分离，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，并分别冷冻干燥保存。

步骤8：将步骤7所述各组分配置成0.5 mg/mL的多肽溶液，测定ACE抑制活性值，最高为77.47±1.12 %。将所得抑制活性高的组分采用半制备反相液相色谱柱进一步分离。多次重复操作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥。

步骤9：将步骤8中得到的各组分配置相同浓度的溶液测定其ACE抑制率。将ACE抑制率均大于70 %的组分进行液质分析，然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到以上三条多肽序列。

进一步的，所述牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的人工合成方法包括以下步骤：

（1）Fmoc固相合成过程

采用Fmoc固相合成法的原理、步骤和操作条件，依次合成GTW、CQC、LFC、或QKW；

（2）三肽的纯化

采用半制备型反相高效液相色潽在以下条件下纯化步骤（1）中合成的三肽；用岛津（LC-10A）液相色谱仪，采用BECKMAN C18制备柱，流动相A：0.1%三氟乙酸（TFA）/超纯水；流动相B：0.1%TFA/乙腈；梯度程序：5%-50%B 30min，流速5mL/min，上样量3mL，采用230nm波长检出流出峰并收集，真空冷冻干燥得到纯品，即为所述牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽。

本发明还提供了一种组合物，该组合物含有至少一种本发明所述的三肽作为活性成分。

本发明还提供了本发明所述的三肽在制备用于抗氧化活性的功能食品、保健品或药物中的应用。优选地，所述药物、保健品或功能食品用于缓解氧化应激。

本发明相比现有技术的有益效果是：

1、本发明提供的三肽在体外表现出很高的抗氧化活性，其铁离子还原抗氧化能力均大于0.10 mol Fe³⁺/mol肽，最高达0.68 mol Fe³⁺/mol肽，在本发明测定条件下活性高于谷胱甘肽活性（0.27 mol Fe³⁺/mol肽）的两倍；

2、由于本发明提供的三肽为小分子肽，能够经过吸收直接进入血液循环，从而起到抗氧化活性的作用，能够应用于抗氧化活性的功能食品、保健品或药物中。

具体实施方式

本发明提供的具有抗氧化活性的三肽的氨基酸序列为GTW、CQC、LFC、或QKW。进一步的，所述多肽衍生物为所述抗氧化三肽的氨基酸被氨基化、或环化、或L-型氨基酸变为D-型氨基酸。

下表1给出了上述氨基酸序列中的氨基酸简写符号所代表的氨基酸的名称。

表1

本发明提供的三肽的氨基酸序列优选为GTW或CQC。这两条三肽的抗氧化活性高于谷胱甘肽。

本发明提供的三肽的制备方法包括但不限于：通过对乳清蛋白进行水解，从水解产物中分离出所述多肽；或者，采用化学合成法。化学合成法在小分子多肽的合成方面具有独特的优势，可以在短时间内快速合成高纯度的单一序列，因此优选采用化学合成法。

化学合成法可以为tBoc固相合成法或Fmoc固相合成法，优选Fmoc固相合成法。本发明可以利用Merrifield B.Solid phase synthesis[J]. Science，1986，232（4748）：341~347.中描述的Fmoc固相合成法的原理、步骤和操作条件。

以下通过实施例来更详细地描述本发明。

实施例中所用到的材料和仪器：

2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ)，谷胱甘肽(glutathione, GSH)购自美国Sigma公司；试验用带保护基的氨基酸药品（纯度＞99%）、缩合试剂HOBT和DIC购自吉尔生化（上海）有限公司；乙腈（色谱纯）和甲醇（色谱纯）购自Fisher Scientific公司；其他试剂无特殊说明均为国产分析纯。

岛津CBM-20Alite液相色谱仪，Agilent 1100series LC/MSD Trap 液相色谱-质谱联用仪；TGL-16C台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

实施例1

本实施例提供的具有抗氧化活性的三肽的氨基酸序列为GTW、CQC、LFC、或QKW。该实施例用于说明本发明的三肽的制备过程。

（1）Fmoc固相合成过程

参照Merrifield B.Solid phase synthesis[J]. Science，1986，232（4748）：341~347.中描述的Fmoc固相合成法的原理、步骤和操作条件，依次合成GTW、CQC、LFC、或QKW。

（2）三肽的纯化

采用半制备型反相高效液相色潽在以下条件下纯化步骤（1）中合成的三肽。用岛津（LC-10A）液相色谱仪，采用BECKMAN C18制备柱，流动相A：0.1%三氟乙酸（TFA）/超纯水；流动相B：0.1%TFA/乙腈。梯度程序：5%-50%B 30min，流速5mL/min，上样量3mL，采用230nm波长检出流出峰并收集，真空冷冻干燥得到纯品。

（3）三肽的鉴定

采用Agilent 1100series LC/MSD Trap液相色谱-质谱联用仪对纯化后的三肽进行鉴定，确认步骤（2）得到的纯品为目标产物。

对比例1

该对比例用于制备源自牦牛乳β-乳球蛋白的其他一些三肽。

按照与实施例1相同的方法制备源自牦牛乳β-乳球蛋白的其他一些三肽CLL、EEL、FCM、KCL、LLF、LLL、MKC。

实施例2

该实施例用于测定实施例1制得的三肽的抗氧化活性。

参照Benzie and Strain建立的抗氧化活性测定方法（Benzie IFF and Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ''antioxidant power'': The FRAP assay. Analytical Biochemistry, 1996, 239 (1):70~76.）。FRAP法测样品的抗氧化活性具体步骤：a.称取1.55 g三水合乙酸钠，8 ml冰醋酸，加超纯水定容至500 ml；b.量取100 ml超纯水，330 μl浓盐酸，摇匀后称取0.3124gTPTZ，再次摇匀；c.称取0.1621 g FeCl₃，加入30 ml超纯水，摇匀。以上3种溶液按10：1：1比例混合配制成FRAP工作液。测定时，在96孔板的每个空中加入10ul样品（100mmol/ml）和100ul现配现用的FRAP工作液，加入样后置于37℃恒温培养箱10 min后，将酶标仪设定波长为570 nm测吸光值并保存。每个样品设定3个平行，同时做空白对照和硫酸亚铁标准曲线。结果以被还原的铁离子的浓度表示。测定结果如表2所示。

对比例2

该对比例用于测定对比例1制得的三肽的抗氧化活性。

按照与实施例2相同的方法进行测定，结果如表2所示。

表2

从表2所示的结果可以看出，本发明提供的三肽的抗氧化活性很高，在测定条件下，有两条高于谷胱甘肽，另外两条与谷胱甘肽活性相近。

实施例3

本实施例为实施例所述抗氧化三肽的组合物，所述组合物包括GTW、LFC、和QKW。所述各三肽的重量份数比为：

GTW 1~5

LFC 30~40

QKW 30~50；

其重量份数比优选为：

GTW 3

LFC 35

QKW 45。

参照实施例2中所述的抗氧化活性测定方法，测定所述抗氧化三肽组合物的抗氧化活性。

表3

三肽组合物	抗氧化活性（mmol Fe³⁺/mol）
		GTW+LFC+QKW	307.80±12.17

Claims

1.一种牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽，其特征在于，所述抗氧化三肽的氨基酸序列为GTW、CQC、LFC和QKW。

2.一种如权利要求1所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物为所述抗氧化三肽的氨基酸被氨基化、或环化、或L-型氨基酸变为D-型氨基酸。

3.一种牦牛乳乳清蛋白抗氧化肽组合物，其特征在于，所述抗氧化肽组合物为抗氧化三肽GTW、CQC、LFC和QKW中两种或几种的混合物。

4.一种如权利要求1所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制备方法，其特征在于，从天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分离纯化，或人工合成方法得到。

5.根据权利要求4所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制备方法，其特征在于，所述从天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分离纯化的方法包括以下步骤：

步骤1：将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳；

步骤2：将所得脱脂乳在35-50℃范围内保温，边搅拌边滴加HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4.6，使酪蛋白进行沉淀，6000 rpm离心20 min后，得到上清液；

步骤3：将步骤2中得到的上清液搅拌，边搅拌边滴加NaOH溶液调节pH值5.2，再加热至80-90 ℃，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷冻干燥后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉；

步骤4：将上述步骤所得乳清蛋白冻干粉溶于NaOH溶液中制成乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶进行水解反应，酶与乳清蛋白的比为1800 U/g，用恒温水浴箱及NaOH溶液分别调整酶解温度为45 ℃和pH值为7.0，水解2~4h，得到酶解液；

步骤5：将步骤4所得酶解液调节其pH值至4.2，4200 rpm条件下离心20 min，取上清液调节pH值至7.0，得到酶解产物；

步骤6：对步骤5所述酶解产物进行二级超滤；初步得到具有抗氧化活性的滤液；

步骤7：将步骤6所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品经层析柱分离，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，并分别冷冻干燥保存；

步骤8：将步骤7所述各组分配置成0.5 mg/mL的多肽溶液，测定ACE抑制活性值，最高为77.47±1.12 %；

将所得抑制活性高的组分采用半制备反相液相色谱柱进一步分离；

多次重复操作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥；

步骤9：将步骤8中得到的各组分配置相同浓度的溶液测定其ACE抑制率；

将ACE抑制率均大于70 %的组分进行液质分析，然后利用串联质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到以上三条多肽序列。

6.根据权利要求5所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制备方法，其特征在于，所述从天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分离纯化的方法中步骤6中所述二次超滤的条件为：

采用超滤杯设备，板式膜组件，先后采用分子截留量分别为10KDa、6KDa亲水性聚醚砜膜，进行二级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5%，溶液pH 7.0，操作压力0.15 MPa，温度45℃。

7.根据权利要求5所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制备方法，其特征在于，所述从天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分离纯化的方法中步骤7中所述层析柱为SephadexG-25凝胶层析柱。

8.根据权利要求4所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制备方法，其特征在于，所述人工合成方法包括以下步骤：

（1）Fmoc固相合成过程

（2）三肽的纯化

9.一种如权利要求1所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的应用，其特征在于，所述抗氧化三肽可应用于抗氧化功能食品、保健品及药品中。