CN105586379B - 一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解以及特定的纯化工艺，获得胶原蛋白活性肽。该胶原蛋白活性肽具有抑制癌细胞增殖的作用，如卵巢癌细胞，包括SKOV3、OVCAR3、436和SRO82，前列腺癌细胞，包括PC3、LnCAPC1、LnCAPC2。

Description

一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白和多肽制备领域，更具体地，涉及胶原蛋白肽的领域。
背景技术
癌症是人们死亡的主要原因之一。在身体组织中，细胞分化属于生理过程，在正常的生理环境下，细胞的增殖和死亡保持一定的平衡。外界环境如射线、空气污染等会导致人体DNA发生突变，从而打破人体正常的调控过程导致癌症的产生。无论在细胞层面还是基因层面，癌症产生的过程中细胞承受不可控的分化，形成恶性肿瘤并扩散至身体其他部位。美国癌症学会预计：2015年，美国将新增21,290例卵巢癌病例，约14,180名妇女死于卵巢癌。卵巢癌在女性死亡率中位列第五，超过其他的女性生殖系统疾病。女人一生中患卵巢癌的风险是1/75，死于卵巢癌的概率是1/100(统计数据中不包含低恶性的卵巢肿瘤)。
食品来源的生物活性肽代表一类能促进人类健康的资源，由于这些活性肽可以在胃肠消化过程中被吸收，并产生活性，进而为预防或治疗慢性疾病提供新的应用。近年来，多肽已经被公认为具有生物活性，比如调节免疫，抗微生物，抗高血压，抗血栓形成，抗癌，抗氧化和降低胆固醇活性，这些活性多肽来源于牛奶，麦子，大豆，鸡蛋，鱼蛋白等植物和动物，通过酶水解法或发酵法制备。
Takashi等研究发现猪皮明胶能够抑制K-562，HCT15和AGS细胞的增殖(TakashiKojima et al.,2003,CANCER BIOTHERAPY&RADIOPHARMACEUTICALS,18(2):147-155)。G.A.Castro等考察了乳清分离蛋白和胶原水解物对黑素瘤癌细胞B16F10的生长抑制作用和对细胞周期的影响，结果表明乳清分离蛋白和胶原水解物对于B16F10细胞具有明显的生长抑制作用，半数抑制浓度IC50在0.19～156.9mg/mL之间，牛胶原水解物对于B16F10细胞作用的半数抑制浓度IC50低于1mg/mL(G.A.Castroet al.，2009，Journal of DermatologicalScience，56：51-57)。经过高温灭菌的黄鲫鱼经胃酶水解的产物对人前列腺癌细胞DU145具有抑制增殖作用，IC50为13.67mg/mL，对人肺癌细胞1299的半数抑制浓度IC50为25.17mg/mL(Ru Song et al.，2011，Mar.Drugs，1142-1156)。泥鳅经木瓜蛋白酶水解后的产物对肝癌细胞HepG2，乳腺癌细胞MCF-7和直肠癌细胞Caco-2的增殖具有抑制作用，当蛋白浓度达到40mg/mL时，HepG2和MCF7的增殖率仅为对照组(不加多肽组)的7％和4％(Lijun You etal.，2011，Journal of Agricultural and Food Chemistry，59:7948-7953)。
从鯷鱼酱分离出的疏水肽对淋巴瘤细胞U937增殖具有抑制作用，肽的氨基酸组成为丙氨酸和苯丙氨酸，分子量为440.9Da(Young Gon Lee et al.，2004，BioFactors,21：63-67)。金枪鱼酱汁水解物对于人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有抑制作用，经超滤膜分离的分子量大于2500Da的组分对MCF-7的增殖具有更高的抑制率，IC50为1.39mg/mL，采用多种色谱手段对产物进行分离纯化，得到两个抗癌活性肽，并对其测序，肽的序列为KPEGMDPPLSEPEDRRDGAAGPK(2449.292Da)和KLPPLLLAKLLMSGKL LAEPCTGR(2562.405Da)(Chuan-Chuan Hung et al.,2014,Journal of Functional FoodsⅡ，http://dx.doi.org/10.1016/j.jff.2014.08.015)。
Kuo-Chiang Hsu采用商品化蛋白酶水解金枪鱼黑肌肉副产物，鉴定它们对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制增殖活性，该水解肽用凝胶过滤和高效液相色谱HPLC进行纯化，得到两个抗癌肽，其氨基酸序列为Leu-Pro-His-Val-Leu-Thr-Pro-Glu-Ala-Gly-Ala-Thr(分子量为1206Da)和Pro-Thr-Ala-Glu-Gly-Val-Tyr-Met-Val-Thr(1124Da)，两者对MCF-7细胞的抗增殖作用有剂量依赖性，IC50分别为8.1μM和8.8μM，这个结果表明金枪鱼黑肌肉副产品对于抑制癌细胞增殖方面具有潜在的药用价值(Kuo-Chiang Hsu et al.,2011,FoodChemistry,44:1044-1051)。Alemán考察了鱿鱼明胶水解物对人乳腺癌细胞MCF-7和脑癌细胞U87的抗增殖活性，半数抑制浓度IC50分别为0.13和0.10mg/mL(A.Alemán，2011，FoodResearch International，44:1044-1051)。因此蛋白活性肽具有多种活性效果，特别是对肿瘤细胞的抑制活性对于肿瘤药物的研发具有重要的意义，本发明的目的在于提供一种具有抑制癌细胞增殖的胶原蛋白活性肽。
发明内容
本发明第一个要解决的技术问题在于提供一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，其包括如下步骤：
1)将明胶用水配制成浓度为10-25％的明胶溶液；
2)将所述明胶溶液加热至40-75℃，调节pH至5.0-6.5；加入木瓜蛋白酶进行酶解，获得第一酶解反应液；
3)调节所述第一酶解反应液的温度至40-75℃，调节pH至7.0-8.5，加入胰蛋白酶，获得第二酶解反应液；
4)调节第二酶解反应液的pH至5.5-6.5；
5)灭活第二酶解反应液中的蛋白酶；然后冷却第二酶解反应液至40℃以下，得到粗产物溶液；
6)过滤所述粗产物溶液；
7)用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤所述粗产物溶液，获得第一透过液；
8)用截留分子量为300Da的超滤膜浓缩所述第一透过液，获得浓缩液，冷冻干燥；
9)采用阳离子交换柱对步骤8)的干燥产物进行纯化；
10)对步骤9)得到的纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肽溶液。
11)对步骤10)得到的胶原蛋白活性肽溶液进行冷冻干燥，得粉末状胶原蛋白活性肽。
优选地，步骤2)中所述木瓜蛋白酶的酶量为干明胶质量的1‰-2％，酶解反应时间总计为30分钟-4小时。
优选地，步骤3)中胰蛋白酶加入量为干明胶质量的1‰-2％，酶解时间为30分钟-4小时。优选地，胰蛋白酶酶解温度为50-55℃。
明胶主要来源于胶原，而胶原是细胞外纤维蛋白。通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解作用，明胶分子被降解为分子量不同的多肽，即胶原蛋白肽。
所述明胶选自牛骨明胶、猪骨明胶和鱼皮明胶中的一种或多种。
所述灭活蛋白酶的方法为加热灭活，优选地，加热温度为95-100℃，更优选地，在温度为95-100℃保持15分钟灭活蛋白酶。
优选地，采用冷却循环系统冷却第二酶解反应液，更优选地，在30分钟内将第二酶解反应液降至40℃以下，以避免第二酶解反应液中肽段的进一步降解。优选地，用氢氧化钠、碳酸氢钠或者柠檬酸钾调节步骤3)中第一酶解液的pH值，更优选地，用食品级氢氧化钠调节步骤3)中第一酶解液的pH值。
优选地，用柠檬酸、醋酸或者磷酸调节步骤4)中第二酶解反应液的pH值，更优选地，用食品级柠檬酸调节步骤4)中第二酶解反应液的pH值。
用碳酸氢钠、磷酸或者柠檬酸调节步骤2)中明胶溶液的pH值。
优选地，用棉饼过滤器过滤粗产物溶液，以去除溶液中微量肉眼可见杂质。
使用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤所述粗产物溶液，以获得能够穿过滤膜的、分子量小于1500Da的胶原蛋白肽，为了提高胶原蛋白肽的获得率，使粗产物溶液中胶原蛋白肽浓度维持在5±0.5％(该浓度为质量体积浓度)，浓缩后，向粗产物溶液中加入水，优选加入去离子水，使粗产物溶液的胶原蛋白肽浓度控制在5±0.5％。当透过液中分子量小于1500Da的胶原蛋白肽的浓度为0.1％(该浓度为质量体积浓度)以下时，停止过滤。
用截留分子量为300Da的超滤膜浓缩所述第一透过液，获得浓缩液和第二透过液，通过滤除水分子达到浓缩胶原蛋白肽的目的，同时还可进一步除去低于300Da的胶原蛋白肽。最终浓缩液中保留的是分子量低于1500Da，高于300Da的胶原蛋白肽。优选地，当第二透过液中低于分子量低于300Da的胶原蛋白肽浓度低于0.1％时停止浓缩，当浓缩液中蛋白肽浓度大于10％，第二透过液中分子量低于300Da的胶原蛋白肽浓度仍在0.1％以上时，加水稀释浓缩液，直至透过液中分子量低于300Da的胶原蛋白肽的浓度低于0.1％，收集浓缩液。以尽量除去分子量低于300Da的胶原蛋白肽。优选地，采用GE公司的截留分子量为300Da的纳滤膜浓缩。
步骤8)的纯化中收集穿透峰的组分，即收集不与阳离子柱结合的组分。阳离子柱的纯化用于去除能够结合阳离子柱介质的胶原蛋白肽。
通过MTT法测定胶原蛋白活性肽具有抑制抗癌细胞增殖的活性，所述癌细胞包括卵巢癌细胞和前列腺癌细胞，所述卵巢癌细胞包括SKOV3、OVCAR3、436、SRO82，所述前列腺癌细胞包括PC3、LnCAPC1、LnCAPC2。
本发明的有益效果如下：
1)以明胶为底物，采用食品级酶对底物进行酶解反应，原料安全，制备工艺简单，易于操作并实现大规模生产。
2)通过超滤和纳滤的方式有效截留具有抗癌细胞增殖的低分子量肽组分，分子量低于1500Da的组分占90％以上，易于被人体吸收，超滤所用的卷式滤膜易于实现批量化对酶解液进行分离。
3)从细胞层面，该胶原蛋白活性肽具有较强的抑制癌细胞增殖的活性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出牛骨胶原蛋白肽的分子量分布图(Distribution analysis)，其中Molarmass为摩尔质量；cumulative weight fraction为累积重量分数；differential weightfraction为示差重量分数；cumulative molar mass为累积摩尔质量；lineardifferential mass为线性示差质量。
图2示出低分子量胶原蛋白肽的离子交换色谱，其中mAu为吸光值。
图3示出脱盐低分子量胶原蛋白活性肽的凝胶过滤色谱。
图4示出牛骨胶原蛋白活性肽对卵巢癌细胞的抗增殖作用(MTT)，其中Overycancer cell为卵巢癌细胞，relative cell viability为相对细胞生物活性。
图5示出牛骨胶原蛋白活性肽对前列腺癌细胞的抗增殖作用(MTT)，其中relativecell viability为相对细胞生物活性。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：牛骨胶原蛋白活性肽的制备
1)称取2kg牛骨明胶，加蒸馏水溶解，明胶与水的重量比为1:4，获得明胶水溶液；
2)加热所述明胶水溶液至60℃，用浓度为1％的碳酸氢钠水溶液调节明胶溶液的pH至6.0，加入木瓜蛋白酶4g，于60℃下水解3小时，获得第一酶解反应液；
3)然后用食品级氢氧化钠调节酶解液的pH至8.5，加入胰蛋白酶4克，继续在55℃下水解2小时，获得第二酶解反应液；
4)用食品级柠檬酸溶液调节第二酶解液的PH为6.5，得到粗产物溶液；
5)将第二酶解反应液温度加热至95℃，保持15分钟，灭活木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。然后采用冷却循环系统，在30分钟内将酶解液降至40℃；
6)用棉饼过滤器过滤粗产物溶液，去除溶液中微量肉眼可见杂质；
7)用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤步骤6)的粗产物溶液，获得第一透过液；选用型号为1500Da的GE公司的超滤膜，膜工作压力为1.2MPa，工作温度45℃；粗产物溶液浓度控制在5％，过滤开始后粗产物溶液浓度升高，通过向粗产物溶液中加纯水的方式保持粗产物溶液中胶原蛋白肽浓度恒定在5％±0.5，当第一透过液中胶原蛋白肽浓度低于0.1％后，停止过滤，收集全部第一透过液；
8)用GE公司的型号为300Da的纳滤膜浓缩所述第一透过液，膜工作压力为1.2MPa，工作温度为45℃以下，得到浓缩液和第二透过液，当第二透过液中胶原蛋白肽浓度低于0.1％时停止浓缩；冷冻干燥浓缩液；
9)采用阳离子交换柱对步骤8)所得的产物进行纯化。具体步骤是：取30mg胶原蛋白肽粉末溶于1mL起始缓冲液A(50mM醋酸钠溶液，PH＝5)中，注入1mL样品环，用5mLHitrapTMSP HP预装柱(GE公司)进行分离，具体地分离过程为：用起始缓冲液A平衡3个柱体积(15ml)；上样后，用起始缓冲液A柱洗2个柱体积(10mL)；用洗脱缓冲液B(50mM醋酸钠缓冲液+2MNaCl，PH＝5)线性梯度洗脱20个柱体积(100mL)；用起始缓冲液平衡5个柱体积。所有试验过程均在AVANT150上完成，检测波长为220nm，缓冲液流速为1mL/min，收集保留时间为tR＝7.5min位置的穿透峰，色谱图见图2。然后用真空干燥的方式干燥纯化产物；
10)采用凝胶柱层析对步骤9)步所获得的纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肽溶液。具体步骤是：用超纯水平衡一个柱体积，流速为1mL/min，将1mL浓度为25mg/mL的含盐胶原蛋白肽注入样品环，用超纯水洗脱0.8个柱体积，流速为1mL/min。所有实验过程在AVANT 150上完成，检测波长为220nm，收集保留时间tR＝75min位置的峰；
11)冷冻干燥步骤10)得到的胶原蛋白活性肽溶液，得粉末状胶原蛋白活性肽。
表1：牛骨胶原蛋白肽的分子量分布数据
实施例2：抗卵巢癌细胞增殖的生物活性测试实验
1)细胞培养
卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3、436和SRO82用含10％小牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)的RPMI 1640培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
2)MTT比色法测定实施例1总胶原蛋白肽对SKOV3、OVCAR3、436和SRO82细胞增殖的影响
将胶原蛋白活性肽溶解在含10％小牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)的RPMI 1640培养基中，配制成浓度分别为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5和25mg/mL的胶原蛋白活性肽溶液，用于MTT加药实验。
取对数生长期细胞，以每孔2×104个(2×104/well)细胞接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μL，在细胞培养箱中培养24h，检查细胞贴壁状态。细胞贴壁良好的96孔板可以进行下一步加药实验。将孔中培养基全部吸出，向各孔中加入不同浓度的胶原蛋白活性肽溶液，浓度分别为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5和25mg/mL，对照组不加胶原蛋白活性肽，仅加入含10％小牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)的RPMI 1640培养基。每组浓度设4个相同细胞孔，分别处理120小时。培养结束后，向每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液25μL，置于培养箱中继续培养4h，然后向每孔中加入10％SDS-0.1MHCl溶液100μL，于培养箱中过夜，使蓝紫色沉淀充分溶解，用酶标仪测定570nm的吸光度。
胶原蛋白活性肽对卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3、436和SRO82的增殖抑制作用结果见图4，且具有显著的量效关系，IC50分别为3.2mg/mL，3.7mg/mL，3.2mg/mL和3.3mg/mL。
实施例3：抗前列腺癌细胞增殖的生物活性测试实验
1)细胞培养
前列腺癌细胞PC3，LnCAPC1和LnCAPC2用含10％小牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)的RPMI 1640培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
2)MTT比色法测定胶原蛋白肽对前列腺癌细胞PC3，LnCAPC1和LnCAPC2增殖的影响
将胶原蛋白活性肽溶解在含10％小牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)的RPMI 1640培养基中，配制成浓度分别为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5和25mg/mL的胶原蛋白活性肽溶液，用于MTT加药实验。
取对数生长期细胞，以每孔2×104个(2×104/well)细胞接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μL，在细胞培养箱中培养24h，检查细胞贴壁状态。细胞贴壁良好的96孔板可以进行下一步加药实验。将孔中培养基全部吸出，向各孔中加入不同浓度的胶原蛋白活性肽，浓度分别为0.8，1.6，3.2，6.25，12.5和25mg/mL，对照组不加胶原蛋白活性肽溶液，仅加入含10％小牛血清，1％双抗(100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)的RPMI 1640培养基。每组浓度设4个相同细胞孔，分别处理120小时。培养结束后，向每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液25μL，置于培养箱中继续培养4h，然后向每孔中加入10％SDS-0.1MHCl溶液100μL，于培养箱中过夜，使蓝紫色沉淀充分溶解，用酶标仪测定570nm的吸光度。
本发明胶原蛋白肽的生物活性表现在该胶原蛋白活性肽能够抑制前列腺癌细胞PC3，LnCAPC1和LnCAPC2的增殖。采用MTT法测定胶原蛋白肽对前列腺癌细胞PC3，LnCAPC1和LnCAPC2的增殖抑制效应，见图5。结果表明，胶原蛋白活性肽能够显著的抑制前列腺癌细胞PC3，LnCAPC1和LnCAPC2的增殖，且具有显著的量效关系，IC50分别为4.1mg/mL，4.4mg/mL和4.4mg/mL。
实施例4：猪骨胶原蛋白活性肽的制备
1)称取2kg猪骨明胶，加蒸馏水溶解，明胶与水的重量比为1:10，获得明胶水溶液；
2)加热所述明胶水溶液至50℃，用浓度为1％的碳酸氢钠水溶液调节明胶溶液的pH至6.5，加入木瓜蛋白酶40g，于50℃下水解30分钟，获得第一酶解反应液；
3)然后用食品级氢氧化钠调节酶解液的pH至8.0，加入胰蛋白酶40克，继续在60℃下水解30分钟，获得第二酶解反应液，用食品级柠檬酸溶液调节pH为6.0，得到粗产物溶液；
4)将第二酶解反应液温度加热至100℃，保持15分钟，灭活木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。然后采用冷却循环系统，在30分钟内将酶解液降至40℃以下；
5)向所述粗产物溶液中加入去离子水，将粗产物溶液浓度控制为5±0.5％；
6)用棉饼过滤器过滤粗产物溶液，去除溶液中微量肉眼可见杂质；
7)用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤步骤6)的粗产物溶液，获得第一透过液；选用型号为1500Da的GE公司的超滤膜，膜工作压力为1.2MPa，工作温度45℃以下；粗产物溶液浓度控制在5％，过滤开始后粗产物溶液浓度升高，通过向粗产物溶液中加纯水的方式保持粗产物溶液中胶原蛋白肽浓度恒定在5％±0.5，当第一透过液中胶原蛋白肽浓度低于0.1％后，停止过滤，收集全部第一透过液；
8)用GE公司的型号为300Da的纳滤膜浓缩所述第一透过液，膜工作压力为1.2MPa，工作温度为45℃以下，得到浓缩液和第二透过液，当第二透过液中胶原蛋白肽浓度低于0.1％时停止浓缩；冷冻干燥浓缩液；
9)采用阳离子交换柱对步骤8)所得的产物进行纯化。具体步骤是：取30mg胶原蛋白肽粉末溶于1mL起始缓冲液A(50mM醋酸钠溶液，PH＝5)中，注入1mL样品环，用5mLHitrapTMSP HP预装柱(GE公司)进行分离，具体地分离过程为：用起始缓冲液A平衡3个柱体积(15ml)；上样后，用起始缓冲液A柱洗2个柱体积(10mL)；用洗脱缓冲液B(50mM醋酸钠缓冲液+2MNaCl，PH＝5)线性梯度洗脱20个柱体积(100mL)；用起始缓冲液平衡5个柱体积。所有试验过程均在AVANT150上完成，检测波长为220nm，缓冲液流速为1mL/min，收集保留时间为tR＝7.5min位置的穿透峰。然后用真空干燥的方式干燥纯化产物；
10)采用凝胶柱层析对步骤9)步所获得的纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肽溶液。具体步骤是：用超纯水平衡一个柱体积，流速为1mL/min，将1mL浓度为25mg/mL的含盐胶原蛋白肽注入样品环，用超纯水洗脱0.8个柱体积，流速为1mL/min。所有实验过程在AVANT 150上完成，检测波长为220nm，收集保留时间tR＝75min位置的峰；
11)冷冻干燥步骤10)得到的脱盐胶原蛋白活性肽溶液，得粉末状胶原蛋白活性肽。
将所获得的胶原蛋白活性肽按照实施例2和3的方法检测其抑制癌细胞增殖的作用，结果与实施例2和3相似。
实施例5：牛骨胶原蛋白活性肽的制备
1)称取2kg牛骨明胶，加蒸馏水溶解，明胶与水的重量比为1:4，获得明胶水溶液；
2)加热所述明胶水溶液至75℃，用浓度为1％的柠檬酸水溶液调节明胶溶液的pH至5.0，加入木瓜蛋白酶10g，于45℃下水解1.5小时，获得第一酶解反应液；
3)然后用食品级氢氧化钠调节酶解液的pH至8.5，加入胰蛋白酶10克，继续在50℃下水解1.5小时，获得第二酶解反应液，用食品级柠檬酸溶液调节PH为6.5，得到粗产物溶液；
4)将第二酶解反应液温度加热至95℃，保持15分钟，灭活碱性蛋白酶。然后采用冷却循环系统，在30分钟内将酶解液降至40℃以下；
5)向所述粗产物溶液中加入去离子水，将粗产物溶液浓度控制为5％；
6)用棉饼过滤器粗过滤粗产物溶液，去除溶液中微量肉眼可见杂质；
7)用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤步骤6)的粗产物溶液，获得第一透过液；选用型号为1500Da的GE公司的超滤膜，膜工作压力为1.2MPa，工作温度45℃以下；粗产物溶液浓度控制在5％，过滤开始后粗产物溶液浓度升高，通过向粗产物溶液中加纯水的方式保持粗产物溶液中胶原蛋白肽浓度恒定在5％±0.5，当第一透过液中胶原蛋白肽浓度低于0.1％后，停止过滤，收集全部第一透过液；
8)用GE公司的型号为300Da的纳滤膜浓缩所述第一透过液，膜工作压力为1.2MPa，工作温度为45℃以下，得到浓缩液和第二透过液，当第二透过液中胶原蛋白肽浓度低于0.1％时停止浓缩；冷冻干燥浓缩液；
9)采用阳离子交换柱对步骤8)所得的产物进行纯化。具体步骤是：取30mg胶原蛋白肽粉末溶于1mL起始缓冲液A(50mM醋酸钠溶液，PH＝5)中，注入1mL样品环，用5mLHitrapTMSP HP预装柱(GE公司)进行分离，具体地分离过程为：用起始缓冲液A平衡3个柱体积(15ml)；上样后，用起始缓冲液A柱洗2个柱体积(10mL)；用洗脱缓冲液B(50mM醋酸钠缓冲液+2MNaCl，PH＝5)线性梯度洗脱20个柱体积(100mL)；用起始缓冲液平衡5个柱体积。所有试验过程均在AVANT150上完成，检测波长为220nm，缓冲液流速为1mL/min，收集保留时间为tR＝7.5min位置的穿透峰。然后用真空干燥的方式得到含盐胶原蛋白肽产品；
10)采用凝胶柱层析对步骤9)步所纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肽溶液。具体步骤是：用超纯水平衡一个柱体积，流速为1mL/min，将1mL浓度为25mg/mL的含盐胶原蛋白肽注入样品环，用超纯水洗脱0.8个柱体积，流速为1mL/min。所有实验过程在AVANT 150上完成，检测波长为220nm，收集保留时间tR＝75min位置的峰；
11)冷冻干燥步骤10)得到的脱盐胶原蛋白活性肽溶液，得粉末状胶原蛋白活性肽。
将所获得的胶原蛋白活性肽按照实施例2和3的方法检测其抑制癌细胞增殖的作用，结果与实施例2和3相似。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将明胶用水配制成浓度为10-25%的明胶溶液；其中，所述明胶选自牛骨明胶或猪骨明胶；
2）将所述明胶溶液加热至40-75℃，调节pH至5.0-6.5；加入木瓜蛋白酶进行酶解，获得第一酶解反应液，其中，所述木瓜蛋白酶的酶量为干明胶质量的1‰-2%，酶解时间总计为30分钟-4小时；
3）调节所述第一酶解反应液的温度至40-75℃，调节pH至7.0-8.5，加入胰蛋白酶，获得第二酶解反应液，其中，所述胰蛋白酶加入量为干明胶质量的1‰-2%，酶解时间为30分钟-4小时；
4）调节第二酶解反应液的pH至5.5-6.5；
5）灭活第二酶解反应液中的蛋白酶；然后冷却第二酶解反应液至40℃以下，得到粗产物溶液；
6）过滤所述粗产物溶液；
7）用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤所述粗产物溶液，获得第一透过液；
8）用截留分子量为300Da的超滤膜浓缩所述第一透过液，获得浓缩液，冷冻干燥；
9）采用阳离子交换柱对步骤8）的干燥产物进行纯化，具体步骤是：取30mg胶原蛋白肽粉末溶于1mL起始缓冲液A中，注入1mL样品环，用5mL GE公司的HitrapTMSP HP预装柱进行分离，具体地分离过程为：用起始缓冲液A 平衡3个柱体积，即15ml；上样后，用起始缓冲液A柱洗2个柱体积，即10mL；用洗脱缓冲液B线性梯度洗脱20个柱体积，即100mL；用起始缓冲液平衡5个柱体积；所有试验过程均在AVANT150 上完成，检测波长为220nm，缓冲液流速为1mL/min，收集保留时间为tR=7.5min位置的穿透峰，然后用真空干燥的方式干燥纯化产物，得到含盐的胶原蛋白肽产品；其中，所述起始缓冲液A为PH=5的50mM醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液B为PH=5的50mM醋酸钠缓冲液与2M NaCl的混合溶液；
10）采用凝胶柱层析对步骤9）得到的纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肽溶液，具体步骤是：用超纯水平衡一个柱体积，流速为1mL/min，将1mL浓度为25mg/mL的含盐胶原蛋白肽注入样品环，用超纯水洗脱0.8个柱体积，流速为1mL/min，所有实验过程在AVANT150上完成，检测波长为220nm，收集保留时间tR=75min位置的峰；
11）对步骤10）得到的胶原蛋白活性肽溶液进行冷冻干燥，得粉末状胶原蛋白活性肽。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，采用冷却循环系统冷却步骤5）中的第二酶解反应液。
3.如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，用氢氧化钠、碳酸氢钠或者柠檬酸钾调节步骤3）中第一酶解液的pH值；用柠檬酸、醋酸或者磷酸调节步骤4）中第二酶解反应液的pH值。
4.如权利要求3所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，用食品级氢氧化钠调节步骤3）中第一酶解液的pH值。
5.如权利要求3所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，用食品级柠檬酸调节第二酶解反应液的pH值。
6.如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，用碳酸氢钠、磷酸或者柠檬酸调节步骤2）中明胶溶液的pH值。
7.如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，用棉饼过滤器过滤粗产物溶液。
8.如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤7）的过滤中，使粗产物溶液中胶原蛋白肽的浓度维持在5±0.5%，当透过液中胶原蛋白肽的浓度为0.1%以下时，停止过滤。
9.如权利要求1所述的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，步骤8）中，当第二透过液分子量小于300Da的胶原蛋白肽浓度低于0.1%时停止浓缩。
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