CN110627897B - 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 - Google Patents
一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110627897B CN110627897B CN201910966784.6A CN201910966784A CN110627897B CN 110627897 B CN110627897 B CN 110627897B CN 201910966784 A CN201910966784 A CN 201910966784A CN 110627897 B CN110627897 B CN 110627897B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- active peptide
- active
- amino acid
- acid sequence
- osteoblast proliferation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 18
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Arg Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N Gly-Pro-Ala-Gly-Pro Natural products C1CCC(C(O)=O)N1C(=O)CNC(=O)C(C)NC(=O)C1CCCN1C(=O)CN CAVKXZMMDNOZJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 description 2
- 101710126238 Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- -1 elixirs Substances 0.000 description 2
- 108010025801 glycyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- HJARVELKOSZUEW-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HJARVELKOSZUEW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OCPPBNKYGYSLOE-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN OCPPBNKYGYSLOE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010039984 Senile osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003262 anti-osteoporosis Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000008263 liquid aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用。本发明所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:5所示。本发明提供的活性肽可以促进成骨细胞增殖,从而预防或治疗骨质疏松。这些活性肽还可以开发成药物、食品或保健品。
Description
技术领域
本发明涉及活性肽技术领域。更具体地,涉及一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用。
背景技术
老年性骨质疏松症(OP)是一种慢性的、进行性发展的以骨量和骨微结构下降为特征,并易于发生骨折的疾病。随着年龄的增加,罹患骨质疏松的概率将大大增加。根据WHO统计的数据,美国、欧洲和日本大约有7500万OP患者。国内情况也不容乐观,全国大规模流行病学调查发现,在60岁以上人群患病率显著提高。但是目前市面上的治疗骨质疏松的药物多数副作用大,而且效果一般。
生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。活性肽的结构可以从较小的二肽到较大分子的多肽。而且生物活性肽来源非常广泛,包括动物、植物、微生物等。生物活性肽制备方法包括酸法、碱法和酶法,其中以酶法制备生物活性肽较为普遍,目前,市面上很多骨胶原蛋白来源的活性肽多为骨胶原蛋白的酶解产物,而没有单一纯化后的活性肽产品,产品成分不明确,在后期药物和保健品开发过程会遇到各种问题。因此如何获得高效、安全的抗骨质疏松活性的多肽非常必要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供牛骨胶原蛋白来源的活性肽。
本发明的第二个目的在于提供上述活性肽在促进成骨细胞增殖,预防和/治疗骨质疏松方面的应用。
为达到上述目的,本发明采用下述技术方案:
根据本发明的第一个目的,本发明提供一种活性肽,所述活性肽的氨基酸序列包括如下序列中的一种或多种:
GPAGPAGPR,如SEQ ID NO:1所示;
GPAGPSGPAGK,如SEQ ID NO:2所示;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化,如SEQ ID NO:3所示;
GPAGPQGPR,如SEQ ID NO:4所示;
GPPGSPGPR,如SEQ ID NO:5所示。
可选的,所述活性肽还可以是与上述任一活性肽的氨基酸序列具有80%及以上同源性的活性肽,该活性肽和上述活性肽的功能相同或相似。例如,所述活性肽的氨基酸序列可以是与上述任一活性肽的氨基酸序列具有85%,90%,95%或97%同源性的序列。
本发明还提供了编码上述活性肽的多核苷酸。
在已知活性肽的氨基酸序列的情况下,本领域技术人员可以根据对于活性肽表达的需要,基于密码子的简并性原则和不同物种对于密码子的使用偏好性,设计具有不同核苷酸序列的活性肽的编码基因。
在本发明中,示例性的,上述活性肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6-SEQ IDNO:10所示。
本发明的活性肽可以从牛骨胶原蛋白酶解产物中经过分离纯化获得,也可以通过本领域已知的其他方法制备得到,例如固相合成的方法、生物工程的方法等等。
根据本发明的第二个目的,本发明提供所述活性肽在制备促进成骨细胞增殖的药物、食品或保健品中的应用。进而提供所述活性肽在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物、食品或保健品中的应用。
本发明进一步涉及一种药物、一种食品或一种保健品,其中含有本发明的活性肽,例如GPAGPAGPR,GPAGPSGPAGK,GPMGPSGPR(其中,M被氧化),GPAGPQGPR,GPPGSPGPR中的一种或多种。
本发明的药物和保健品可以制成本领域常见的各种形式,包括但不限于,适于口服的散剂、片剂(包括各种包衣片剂、缓释或控释片剂)、锭剂、胶囊剂(包括软胶囊和硬胶囊)、颗粒剂、丸剂、可分散粉末、水性或油性混悬剂、水性或油性溶液剂、乳剂、酏剂、糖浆剂等等,适于局部使用的霜剂、软膏剂、凝胶、水性或油性溶液剂、水性或油性混悬剂等等;适于吸入使用的粉末或液体气雾剂;适于经胃肠外给药的静脉内、皮下或肌内注射用无菌水性或油性的注射剂或冻干粉针剂、栓剂等等。
本发明的药物和保健品中可以进一步含有常规的各种辅料和/或其他活性成分。合适的辅料包括但不限于赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、水溶性聚合物、无机盐、溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、起泡剂和调味剂等等。
本发明的有益效果如下:
本发明采用MTT法,以促成骨细胞增殖为活性筛选指标,将牛骨胶原蛋白酶解产物依次进行反相硅胶柱层析、离子交换柱层析、凝胶柱层析以及高效液相色谱,最终纯化得到5种具有较强活性的活性肽,并进行了氨基酸序列的鉴定及活性验证。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出超滤组分CP1的快速反相硅胶柱层析色谱图。
图2示出超滤组分CP1经过ODS-AQ快速反相硅胶柱层析得到的6个组分的MTT细胞增殖活性测试结果。
图3示出快速反相硅胶柱层析组分CP1-5离子交换柱层析色谱图。
图4示出快速反相硅胶柱层析组分CP1-5经过离子交换柱层析得到的2个组分的MTT细胞增殖活性测试结果。
图5示出离子交换柱层析组分CP1-5-1凝胶柱层析色谱图。
图6示出离子交换柱层析组分CP1-5-1经过凝胶柱层析纯化得到的2个组分的MTT细胞增殖活性测试结果。
图7示出凝胶柱层析组分CP1-5-1-A第一步高效液相柱层析色谱图。
图8示出凝胶柱层析组分CP1-5-1-A经过第一步高效液相柱层析纯化得到的4个组分的MTT细胞增殖活性测试结果。
图9示出第一步高效液相柱层析组分CP1-5-1-A-2第二步高效液相色谱图。
图10示出第一步高效液相柱层析组分CP1-5-1-A-2经过第二步高效液相柱层析纯化得到的2个组分的MTT细胞增殖活性测试结果。
图11示出采用MTT法验证本发明5种活性肽的细胞增殖活性测试结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1活性肽制备
依据中国专利申请CN 105586379 A“一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法”公开的内容,获得超滤组分CP1,即完成该专利申请中所公开的制备方法的步骤(1)-(8)。
反相硅胶柱层析:将超滤组分CP1样品溶解于1mL超纯水中,配制成10mg/ml溶液。离心并用0.22μm的一次性滤膜进行过滤。使用ODS-AQ反相硅胶柱(50μm,2.5mm×100mm)对生物活性肽进行分离纯化,上样量为1mL。洗脱液为:超纯水(A液)和色谱乙醇(B液)。流速为:5mL/min。洗脱步级梯度为:0-10min,100%A;10-30min,96%A;30-50min,90%A;50-70min,87%A;70-75min,83%A;75-85min,78%A;85-97min,0%A。检测波长为215nm,共分离得到6个组分(CP1-1-CP1-6)并进行冷冻干燥放-80℃低温冰箱保存待用,结果如图1所示。对6个组分进行MTT细胞增殖活性测试,结果如图2所示。CP1-5可以显著的促进成骨细胞增殖,遂选择该组分进行进一步纯化。
离子交换柱层析:将反相柱层析得到的活性最强的CP1-5组分5mg溶解于100μL超纯水中,离心并用0.22μm的一次性滤膜进行过滤。使用离子交换柱对活性肽进行分离纯化。上样量为100μL。洗脱液为:超纯水(A液)和1M氯化钠溶液(B液)。流速为:1mL/min。洗脱梯度为:0-100%B液(0-1M),60min。检测波长为215nm,共分离得到2个组分(CP1-5-1和CP1-5-2)并进行冷冻干燥放-80℃低温冰箱保存待用,结果如图3所示。对2个组分进行MTT细胞增殖活性测试,结果如图4所示。CP1-5-1可以显著的促进成骨细胞增殖,遂选择该组分进行进一步纯化。
凝胶柱层析:将离子交换柱层析得到的活性最强的CP1-5-1组分3mg溶解于100μL超纯水中,离心并用0.22μm的一次性滤膜进行过滤,使用Sephadex G-15凝胶柱对活性肽进行分离纯化。上样量为100μL。洗脱液为:超纯水。流速为:0.8mL/min。色谱条件为:100%超纯水洗脱50min。检测波长为215nm,共分离得到2个组分(CP1-5-1-A和CP1-5-1-B)并进行冷冻干燥放-80℃低温冰箱保存待用,结果如图5所示。对2个组分进行MTT细胞增殖活性测试,结果如图6所示。CP1-5-1-A可以显著的促进成骨细胞增殖,遂选择该组分进行进一步纯化。
第一步高效液相色谱:将凝胶柱层析得到的活性最强的CP1-5-1-A组分1mg溶解于100μL超纯水中,离心并用0.22μm的一次性滤膜进行过滤,使用ODS-A反相色谱柱(20μm,2.5mm×100mm)对活性肽进行分离纯化。上样量为20μL。洗脱液为:A液为超纯水,B液为色谱乙醇。流速为:1mL/min。洗脱线性梯度为:0-100%色谱乙醇,2h。检测波长为215nm,共分离得到4个组分(CP1-5-1-A-1到CP1-5-1-A-4)并进行冷冻干燥放-80℃低温冰箱保存待用,结果如图7所示。对4个组分进行MTT细胞增殖活性测试,结果如图8所示。CP1-5-1-A-2可以显著的促进成骨细胞增殖,遂选择该组分进行进一步纯化。
第二步高效液相色谱:将第一步高效液相色谱得到的活性最强的CP1-5-1-A-2组分1mg溶解于100μL超纯水中,离心并用0.22μm的一次性滤膜进行过滤,使用ODS-A反相色谱柱(20μm,2.5mm×150mm)对活性肽进行分离纯化。上样量为20μL。洗脱液为:A液为超纯水,B液为色谱乙腈。流速为:1mL/min。洗脱线性梯度为:0-100%色谱乙腈,1h。检测波长为215nm,共分离得到2个组分(CP1-5-1-A-1-2-1和CP1-5-1-A-2-2)并进行冷冻干燥放-80℃低温冰箱保存待用,结果如图9所示。对2个组分进行MTT细胞增殖活性测试,结果如图10所示。CP1-5-1-A-2-2可以显著的促进成骨细胞增殖。
利用液相色谱质谱联用仪对活性最强的组分CP1-5-1-A-2-2进行氨基酸序列分析,共鉴定到5条活性肽。结果见表1。
表1从牛骨胶原蛋白酶解液中鉴定到的活性肽序列
活性肽序列 | 质荷比 | 理论分子量 | 长度(氨基酸) | 母体蛋白 |
GPAGPAGPR | 779.416 | 778.4086 | 9 | Collagen alpha-2(I)chain |
GPAGPSGPAGK | 448.2348 | 894.4559 | 11 | Collagen alpha-2(I)chain |
GPM(O)GPSGPR | 436.2075 | 870.4017 | 9 | Collagen alpha-1(I)chain |
GPAGPQGPR | 418.7222 | 835.43 | 9 | Collagen alpha-1(I)chain |
GPPGSPGPR | 821.4254 | 820.4191 | 9 | Collagen alpha-1(III)chain |
实施例2
基于实施例1鉴定得到的5种活性肽的氨基酸序列,通过固相合成方法获得实验样品,进行促进成骨细胞增殖活性验证。固相合成肽公司:吉尔生化(上海)有限公司。
结果如图11所示,在浓度0.05mg/ml时,与对照组相比,五种多肽均具有统计学差异(P<0.05),说明这五种活性多肽具有显著促进成骨细胞增殖的作用。但是在0.0125mg/ml或者0.2mg/ml却并非如此,说明0.05mg/ml是多肽发挥促进成骨细胞增值作用的最合适浓度。
细胞增殖的检测
首先以每孔750个小鼠MT3T3-E1接种于三块96孔板中,24h待细胞贴壁后,吸去培养液,加入不同浓度筛选的活性肽(浓度分别为:0.0125mg/ml,0.05mg/ml,0.2mg/ml),并设置空白对照组。每组设置三个复孔,之后放入37℃、5%CO2浓度的恒温恒湿的细胞培养箱中培养1d,尔后每孔加入20μL 5mg/ml MTT继续在培养箱中培养4h。吸取培养液,加入150μLDMSO二甲基亚砜。最后在490nm波长下,在酶标仪上进行吸光度A的测定,并计算其细胞相对生存率%=As/Ac×100。
公式中:As:活性肽样品吸光度的平均值Ac:空白对照吸光度的平均值。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 中国科学院理化技术研究所
包头东宝生物技术股份有限公司
<120> 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用
<130> JLC19I0648E
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Pro Arg
1 5
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggccccgccg gccccgccgg ccccagg 27
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggccccgccg gccccagcgg ccccgccggc aag 33
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggccccatgg gccccagcgg ccccagg 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggccccgccg gcccccaggg ccccagg 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcccccccg gcagccccgg ccccagg 27
Claims (7)
1.一种活性肽,其特征在于,所述活性肽的氨基酸序列为如下序列中的一种或多种:
GPAGPSGPAGK;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化;
GPPGSPGPR。
2.一种多核苷酸,其特征在于,编码权利要求1所述的任一活性肽。
3.一种活性肽在制备促进成骨细胞增殖的药物或食品中的应用,其特征在于,所述活性肽的氨基酸序列为:
GPAGPAGPR;
GPAGPSGPAGK;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化;
GPAGPQGPR;
或GPPGSPGPR。
4.一种活性肽在制备预防和/或治疗骨质疏松的药物或食品中的应用,其特征在于,所述活性肽的氨基酸序列为:
GPAGPAGPR;
GPAGPSGPAGK;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化;
GPAGPQGPR;
或GPPGSPGPR。
5.一种药物,其特征在于,包含如下氨基酸序列的活性肽:
GPAGPAGPR;
GPAGPSGPAGK;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化;
GPAGPQGPR;
或GPPGSPGPR。
6.一种食品,其特征在于,包含如下氨基酸序列的活性肽:
GPAGPAGPR;
GPAGPSGPAGK;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化;
GPAGPQGPR;
或GPPGSPGPR。
7.一种保健品,其特征在于,包含如下氨基酸序列的活性肽:
GPAGPAGPR;
GPAGPSGPAGK;
GPMGPSGPR,其中,M被氧化;
GPAGPQGPR;
或GPPGSPGPR。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910966784.6A CN110627897B (zh) | 2019-10-12 | 2019-10-12 | 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 |
PCT/CN2019/124971 WO2021068403A1 (zh) | 2019-10-12 | 2019-12-13 | 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910966784.6A CN110627897B (zh) | 2019-10-12 | 2019-10-12 | 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110627897A CN110627897A (zh) | 2019-12-31 |
CN110627897B true CN110627897B (zh) | 2020-11-24 |
Family
ID=68976190
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910966784.6A Active CN110627897B (zh) | 2019-10-12 | 2019-10-12 | 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110627897B (zh) |
WO (1) | WO2021068403A1 (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112812155B (zh) * | 2021-02-08 | 2023-01-06 | 南京财经大学 | 一种促进成骨细胞增殖的小肽 |
CN112940093B (zh) * | 2021-02-08 | 2022-04-29 | 南京财经大学 | 促进成骨细胞增殖的小肽 |
CN113929769B (zh) * | 2021-09-07 | 2023-11-28 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种促进成肌细胞增殖的活性肽及其应用 |
WO2023136573A1 (ko) * | 2022-01-11 | 2023-07-20 | 유니메드제약주식회사 | 돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물 |
WO2023200875A1 (en) * | 2022-04-13 | 2023-10-19 | ALASTIN Skincare, Inc. | Octapeptide for topical application |
CN117482213B (zh) * | 2023-10-13 | 2024-05-28 | 江南大学 | 一种促进成骨细胞增殖的乳源多肽fppqsvl及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105586379A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-05-18 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法 |
CN110136774A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-16 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 成骨活性多肽的构效评价方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2054442A2 (en) * | 2006-06-14 | 2009-05-06 | Cell-Matrix, Inc. | Denatured collagen peptides and uses thereof |
EP2839292A4 (en) * | 2012-04-19 | 2015-08-26 | Univ California | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING INSTABLIC ARTERIOSCLEOTIC PLAQUE |
-
2019
- 2019-10-12 CN CN201910966784.6A patent/CN110627897B/zh active Active
- 2019-12-13 WO PCT/CN2019/124971 patent/WO2021068403A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105586379A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-05-18 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法 |
CN110136774A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-08-16 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 成骨活性多肽的构效评价方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Assessing the Extent of Bone Degradation Using Glutamine Deamidation in Collagen;Julie Wilson等;《analytical chemistry》;pubmed;20121002;第84卷(第21期);第9044页表1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021068403A1 (zh) | 2021-04-15 |
CN110627897A (zh) | 2019-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110627897B (zh) | 一种促进成骨细胞增殖的活性肽及其应用 | |
CN109400678A (zh) | 一种刺参来源的抗氧化和dpp-iv抑制活性肽 | |
CN108715600B (zh) | 一种促进肠黏膜上皮细胞增殖和迁移的寡肽及其制备方法和应用 | |
CN110655556B (zh) | 一种免疫调节肽的制备及方法 | |
CN110590907B (zh) | 一种免疫调节肽的制备及分离纯化方法 | |
CN111269290B (zh) | 一种鲟鱼抗炎肽的制备方法 | |
CN103539831A (zh) | 山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 | |
CN109369783B (zh) | 一种多肽rdp1及其提纯方法与应用 | |
CN111620932A (zh) | 一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 | |
CN103539833A (zh) | 高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 | |
Yan et al. | The β-(1→ 6)-branched β-(1→ 3) glucohexaose and its analogues containing an α-(1→ 3)-linked bond have similar stimulatory effects on the mouse spleen as Lentinan | |
CN111269292B (zh) | 具有促进组织修复的家蝇多肽及其制备方法与应用 | |
CN110467667B (zh) | 一种抗肿瘤活性肽及其应用 | |
CN111763243B (zh) | 小公鱼免疫活性肽及其制备方法和用途 | |
CN112457377B (zh) | 美洲大蠊多肽及其应用 | |
CN105153294B (zh) | 一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法 | |
CN108101960B (zh) | 一种具有ace抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法 | |
CN113929769A (zh) | 一种促进成肌细胞增殖的活性肽及其应用 | |
CN112876556B (zh) | 一种促进成骨细胞矿化的牛骨胶原肽及其应用 | |
CN112480210B (zh) | 一种抗凝血活性肽及其用途 | |
CN114437180B (zh) | 一种蛋白酪氨酸磷酯酶1b抑制肽及其应用 | |
CN112430254B (zh) | 一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途 | |
CN117534732A (zh) | 一种抑制il-12与其受体结合的多肽及其应用 | |
CN117402215B (zh) | 抑制α-葡萄糖苷酶活性的玉米肽及其制备方法与应用 | |
CN115838398A (zh) | 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的棘胸蛙多肽及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |