CN111620932A - 一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 - Google Patents
一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111620932A CN111620932A CN202010622530.5A CN202010622530A CN111620932A CN 111620932 A CN111620932 A CN 111620932A CN 202010622530 A CN202010622530 A CN 202010622530A CN 111620932 A CN111620932 A CN 111620932A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- polypeptide
- cell
- tumor
- promoting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title abstract description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 abstract description 7
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 6
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 6
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 6
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 5
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N YCTIYBUTCKNOTI-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 4
- QHHVSXGWLYEAGX-GUBZILKMSA-N Asp-His-Gln Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QHHVSXGWLYEAGX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- QZONCCHVHCOBSK-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QZONCCHVHCOBSK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- JMCOXFSCTGKLLB-FKBYEOEOSA-N Val-Phe-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N JMCOXFSCTGKLLB-FKBYEOEOSA-N 0.000 description 4
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- DOQXHOUYYSPISL-SZMVWBNQSA-N Met-Trp-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N DOQXHOUYYSPISL-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- RCYUBVHMVUHEBM-RCWTZXSCSA-N Pro-Pro-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RCYUBVHMVUHEBM-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- UZVKFARGHHMQGX-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC UZVKFARGHHMQGX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SFECXGVELZFBFJ-VEVYYDQMSA-N Pro-Asp-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SFECXGVELZFBFJ-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N Pro-Gly-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFXCXDQNRXTSBD-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012247 phenotypical assay Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多肽及在促进NK细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用,该多肽的氨基酸序列为KGNPPTDHQVFWM(XX)MLGEAAYD;其中,XX代表W或G。本发明提供的多肽既可以促进NK细胞体外增殖,又可以提高NK细胞的杀伤力,因而可以用于促进NK细胞体外增殖并增强其杀瘤活性,并用于制备可以促进NK细胞体外增殖并增强其杀瘤活性的细胞培养基。
Description
技术领域
本发明涉及多肽和肿瘤免疫细胞领域,具体涉及一种多肽及在促进NK细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。
背景技术
正常情况下,免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞,但为了生存和生长,肿瘤细胞能够采用不同策略,使人体的免疫系统受到抑制,不能正常的杀伤肿瘤细胞,从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。肿瘤细胞的上述特征被称为免疫逃逸,为了更好地理解肿瘤免疫的多环节、多步骤的复杂性,陈和提出了肿瘤-免疫循环的概念。肿瘤-免疫循环分为以下七个环节:1、肿瘤抗原释放;2、肿瘤抗原呈递;3、启动和激活效应性T细胞;4、T细胞向肿瘤组织迁移;5、肿瘤组织T细胞浸润;6、T细胞识别肿瘤细胞;7、清除肿瘤细胞。这些环节任何地方出现异常均可以导致抗肿瘤-免疫循环失效,出现免疫逃逸。不同肿瘤可以通过不同环节的异常抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤从而产生免疫耐受,甚至促进肿瘤的发生、发展。
肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环,恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应,从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗和小分子抑制剂等。近几年,肿瘤免疫治疗的好消息不断,目前已在多种肿瘤如黑色素瘤,非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性,多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国FDA批准临床应用。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性,在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。
细胞免疫治疗是一种输入免疫细胞的肿瘤免疫疗法,其中以NK、CIK免疫细胞研究较多。NK细胞是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生,能够识别靶细胞、杀伤介质。
细胞免疫治疗对NK等免疫细胞的输入量具有较高要求,因此,需要在输入前在体外获得足够数量额NK细胞。所以,如何在体外促进NK细胞增殖并提高其对肿瘤细胞的杀伤力成为了细胞免疫治疗领域的重要研究方向。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的缺陷和不足,提供一种多肽及在促进NK细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。
实现上述目的的技术方案如下:
一种多肽,氨基酸序列如下:
KGNPPTDHQVFWM(XX)MLGEAAYD;
其中,XX代表W或G。
优选地,其为N和C末端未被化学修饰的多肽。
优选地,其为N和C末端被化学修饰的多肽。
更优选地,N末端被乙酰化修饰,C末端被酰胺化修饰,形式如下:
Ac-KGNPPTDHQVFWM(XX)MLGEAAYD-NH2;
其中,XX代表W或G。
上述多肽用于促进NK细胞体外增殖的用途。
上述多肽用于增强NK细胞杀伤力的用途。
上述多肽用于制备NK细胞体外培养基的用途,该培养基可以促进NK细胞体外增殖并增强其杀伤性。
有益效果:
本发明提供的多肽既可以促进NK细胞体外增殖,又可以提高NK细胞的杀伤力,因而可以用于促进NK细胞体外增殖并增强其杀瘤活性,并用于制备可以促进NK细胞体外增殖并增强其杀瘤活性的细胞培养基。
附图说明
图1为Western Blot测试结果;与对照组相比,不同浓度的多肽组颗粒酶B、穿孔素的含量均显著升高,且浓度越高升高越明显。
具体实施方式
一、试验材料
待测试多肽委托外包机构使用固相合成法合成,采用芴甲氧羰基(Fmoc)N端保护策略,按照树脂固相合成法依次连接相应氨基酸,期间依次脱去Fmoc-保护基团,然后切肽,获得粗品,再经柱色谱分离纯化,即得。纯度不低于98%。HPLC和MS进行结构确证。
待测试多肽Sequence NO.1~Sequence NO.4序列如下,N末端和C末端未经化学修饰:
KGNPPTDHQVFWMWMLGEAAYD(Sequence NO.1);
KGNPPTDHQVFWMGMLGEAAYD(Sequence NO.2);
KGNPDTDHQVFWMWMLGEAAYD(Sequence NO.3);
KGNPGTDHQVFWMWMLGEAAYD(Sequence NO.4)。
人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。
重组人白细胞介素2(rhIL-2)购自碧云天生物。
NK细胞培养基购自德国CellGenix公司。
MTT、DMSO购自Sigma公司。
颗粒酶B、穿孔素一抗购自美国Invitrogen公司。
二、试验方法
1、外周血NK细胞培养和鉴定
抽取健康人外周血20mL用肝素抗凝,加入20mL PBS缓冲液稀释,缓慢加入淋巴细胞分离液,4℃条件下650g离心20min,收集白色细胞层,生理盐水洗涤,将洗涤后的细胞加入含有500U/mL IL-2的NK细胞培养基中,调节密度为2.5×106/L,于37℃、5%CO2培养,每2~3d添加含有500U/mL IL-2的NK细胞培养基并调节细胞密度为2.5×106/L。培养12d后,用PerCP-cy5.5-CD3和FITC-CD56抗体标记NK细胞进行流式细胞仪进行表型检测。
2、MTT法测定NK细胞增殖活力
取培养12d的NK细胞,制成细胞悬液,以每孔200μL、5000个细胞的密度接种于96孔板中,先在37℃、5%CO2条件培养24h,再将培养基更换为含有4、8μM待测试多肽的NK细胞培养基,以及不加多肽的对照组。各设置6个复孔。在37℃、5%CO2条件继续培养48h取出,每孔加MTT溶液(5mg/mL)20μL,培养4h后弃上清,每孔加150μL DMSO,轻轻振荡使结晶物充分溶解,于570nm处测定各孔吸光度值(OD),以对照组细胞增殖率为100%计,按以下公式计算不同多肽组细胞增殖率:
增殖率(%)=OD多肽组/OD对照组×100%。
3、Western Blot法测定NK细胞杀伤力
取培养12d的NK细胞,制成2×105/mL浓度的细胞悬液,以每孔2mL接种于6孔板中,先在37℃、5%CO2条件培养24h,再将培养基更换为含有4、8μM待测试多肽的NK细胞培养基,以及不加多肽的对照组。在37℃、5%CO2条件继续培养48h取出,收集细胞,PBS洗涤,裂解液裂解,测定蛋白浓度,各组取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭,加入颗粒酶B、穿孔素、GAPDH一抗4℃孵育过夜,洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h,显色,灰度扫描分析。
4、数据处理
采用SPSS 17.0软件进行方差分析,数据以均值±标准差表示,组间采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
三、试验结果
1、外周血NK细胞培养和鉴定
NK细胞是一种CD3-CD56+表型的细胞,其在从外周血中分离出的单个核细胞中只占5%左右。培养12d后,流式细胞仪的表型检测结果中,CD3-CD56+表型已经提高至(40.55±3.96)%,说明外周血单个核细胞经含IL-2的NK细胞培养基培养基培养后,NK细胞已诱导成功。
2、多肽对NK细胞增殖活力的影响
MTT测试结果如表1所示,与对照组相比,不同浓度的多肽组OD570值均显著升高,且浓度越高升高越明显。可见Sequence NO.1~Sequence NO.4多肽均可以有效促进NK细胞增殖。
表1各组OD值和多肽组增殖率
3、多肽对NK细胞杀伤力的影响
Western Blot测试结果如图1所示,与对照组相比,不同浓度的多肽组颗粒酶B、穿孔素的含量均显著升高,且浓度越高升高越明显。颗粒酶B和穿孔素是决定NK细胞杀伤力的两种重要物质:前者是NK细胞颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶,可以进入靶细胞,激活Caspase级联反应,从而迅速引起靶细胞DNA断裂,导致快速的细胞凋亡;后者是存在于NK细胞胞质中的细胞毒颗粒,当NK与靶细胞接触后可释放穿孔素,在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道,导致靶细胞溶解。由此可见,Sequence NO.1~Sequence NO.4多肽均可以有效提高NK细胞的杀伤力。
综上,本发明提供的多肽既可以促进NK细胞体外增殖,又可以提高NK细胞的杀伤力,因而可以用于促进NK细胞体外增殖并增强其杀瘤活性,并用于制备可以促进NK细胞体外增殖并增强其杀瘤活性的细胞培养基。
序列表
<110> 南京赛尔健生物技术有限公司
<120> 一种多肽及在促进NK细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Gly Asn Pro Pro Thr Asp His Gln Val Phe Trp Met Trp Met Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ala Tyr Asp
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Gly Asn Pro Pro Thr Asp His Gln Val Phe Trp Met Gly Met Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ala Tyr Asp
20
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Gly Asn Pro Asp Thr Asp His Gln Val Phe Trp Met Trp Met Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ala Tyr Asp
20
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Gly Asn Pro Gly Thr Asp His Gln Val Phe Trp Met Trp Met Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ala Tyr Asp
20
Claims (7)
1.一种多肽,其特征在于,氨基酸序列如下:
KGNPPTDHQVFWM(XX)MLGEAAYD;
其中,XX代表W或G。
2.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于:其为N和C末端未被化学修饰的多肽。
3.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于:其为N和C末端被化学修饰的多肽。
4.根据权利要求3所述的多肽,其特征在于,N末端被乙酰化修饰,C末端被酰胺化修饰,形式如下:
Ac-KGNPPTDHQVFWM(XX)MLGEAAYD-NH2;
其中,XX代表W或G。
5.权利要求1~4任一所述多肽用于促进NK细胞体外增殖的用途。
6.权利要求1~4任一所述多肽用于增强NK细胞杀伤力的用途。
7.权利要求1~4任一所述多肽用于制备NK细胞体外培养基的用途,该培养基可以促进NK细胞体外增殖并增强其杀伤性。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010622530.5A CN111620932A (zh) | 2020-06-30 | 2020-06-30 | 一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010622530.5A CN111620932A (zh) | 2020-06-30 | 2020-06-30 | 一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111620932A true CN111620932A (zh) | 2020-09-04 |
Family
ID=72269496
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010622530.5A Pending CN111620932A (zh) | 2020-06-30 | 2020-06-30 | 一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111620932A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114561354A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-05-31 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种提高nk细胞杀伤活性的方法 |
CN115261319A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-01 | 溯玄(上海)生物技术有限公司 | 一种多肽诱导扩增的nk细胞及用于细胞治疗的用途 |
CN115305238A (zh) * | 2022-09-19 | 2022-11-08 | 南京良纬生物科技有限公司 | 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104894072A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-09-09 | 紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司 | 一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用 |
CN106399244A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-02-15 | 南通市宝通康生物工程股份有限公司 | 一种nk细胞培养基 |
CN111303267A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-19 | 卓尔康(北京)生物科技有限公司 | 一种具有增强nk细胞杀伤活性的多肽及其应用 |
-
2020
- 2020-06-30 CN CN202010622530.5A patent/CN111620932A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104894072A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-09-09 | 紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司 | 一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用 |
CN106399244A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-02-15 | 南通市宝通康生物工程股份有限公司 | 一种nk细胞培养基 |
CN111303267A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-19 | 卓尔康(北京)生物科技有限公司 | 一种具有增强nk细胞杀伤活性的多肽及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
宋旭霞等: "蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的体外生物活性研究", 《医学研究生学报》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114561354A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-05-31 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种提高nk细胞杀伤活性的方法 |
CN114561354B (zh) * | 2022-03-30 | 2022-09-16 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种提高nk细胞杀伤活性的方法 |
CN115261319A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-01 | 溯玄(上海)生物技术有限公司 | 一种多肽诱导扩增的nk细胞及用于细胞治疗的用途 |
CN115261319B (zh) * | 2022-08-30 | 2023-08-18 | 广东齐美生命医学技术研究院 | 一种多肽诱导扩增的nk细胞及用于细胞治疗的用途 |
CN115305238A (zh) * | 2022-09-19 | 2022-11-08 | 南京良纬生物科技有限公司 | 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用 |
CN115305238B (zh) * | 2022-09-19 | 2023-11-17 | 杭州凤喆凰生物科技有限公司 | 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111620932A (zh) | 一种多肽及在促进nk细胞增殖和提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用 | |
CN111718399A (zh) | 一种多肽及用于nk细胞培养、制备nk细胞培养基的用途 | |
CN110330567B (zh) | 双特异性嵌合抗原受体t细胞,其制备方法和应用 | |
Pestka | The purification and manufacture of human interferons | |
AU2005298245B2 (en) | A thymus-specific protein | |
JPS60115528A (ja) | ヒトインタ―ロイキン―2蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 | |
CN108834417B (zh) | 具有抗炎症活性的肽及其用途 | |
CN109438570B (zh) | 肿瘤相关基因fgfr3突变短肽及其应用 | |
CA2186423C (en) | Protein which induces interferon-gamma production by immunocompetent cell | |
NO893452L (no) | Rekombinant naturlig dreper-celleaktivator. | |
CN117247431B (zh) | 一种具有dpp-iv抑制活性的苦荞肽及其应用 | |
CA2609473A1 (en) | A recombinant method for production of an erythropoiesis stimulating protein | |
CN116970058B (zh) | 针对tp53基因r249s突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 | |
JPS62500072A (ja) | 蛋白質の精製法 | |
WO2013016896A1 (zh) | 杨树菇凝集素aal-2及其编码基因、其制备方法和应用 | |
CN110128503B (zh) | 一种抗Aβ1-42蛋白聚集的合成多肽及其合成方法、应用与编码该合成多肽的基因 | |
CN115785208B (zh) | 肺癌特异性分子靶标01及其用途 | |
CN116948004B (zh) | 针对ctnnb1基因h36p突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 | |
CN115785203B (zh) | 肺癌特异性分子靶标10及其用途 | |
CN115785204B (zh) | 肺癌特异性分子靶标08及其用途 | |
AU2019375096B2 (en) | Polypeptides for the treatment of stress, immunoreaction and stroke syndromes | |
CN106544323B (zh) | 杂交瘤细胞株xa272-907、抗体及其应用 | |
AU2004316095A1 (en) | Anticancer agent containing BL angiostatin | |
JP2000505643A (ja) | レクチン様性質を有する化合物およびその生物学的応用 | |
JPH02152998A (ja) | ヒトγ−インターフェロンとその製造方法並びに用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200904 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |