CN115261319B - 一种多肽诱导扩增的nk细胞及用于细胞治疗的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽诱导扩增的NK细胞及用于细胞治疗的用途。本发明请求保护一种多肽用于体外诱导扩增NK细胞的用途，或用于制备诱导扩增NK细胞的培养基的用途，该多肽的氨基酸序列为FVAMQRHAGND。同时请求保护一种多肽体外诱导扩增的NK细胞用于制备治疗肿瘤的药物的用途，该多肽的氨基酸序列为FVAMQRHAGND；所述肿瘤为肺癌。本发明提供的氨基酸序列为FVAMQRHAGND的多肽不仅可以促进NK细胞体外扩增，还可以提高其在体内对肿瘤细胞的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种多肽诱导扩增的NK细胞及用于细胞治疗的用途。
背景技术
肿瘤免疫治疗是一种新兴的治疗方式，近年来取得了巨大的进展。自然杀伤细胞(natural killer cells,NK cells)无需抗原预先刺激即可直接杀伤肿瘤细胞的特性使其成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一。NK细胞是与T细胞、B细胞并列的第三类淋巴细胞，是机体固有免疫系统中的重要成员，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节中发挥着重要的作用。但是，NK细胞在肿瘤部位浸润少、活性低、免疫监视功能低等缺点极大限制了其杀伤作用。因此，寻找有效的激活途径，提升NK细胞的杀伤能力是至关重要的。
多肽通常是指由10～100个氨基酸分子脱水缩合之后形成的化合物，也有说法是把由2～10个氨基酸组成的肽叫做寡肽；10～50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质，也就是说，蛋白质有时候也被称为多肽。多肽分布广泛，对人有重要的作用，近年来，对多肽的研究也日益呈现上升趋势。在医药领域，很多多肽类药物疗效良好，比较常见的主要有：促红细胞生成素(EPO)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-2(IL-2)等，这类药物在临床上主要用于刺激造血、抗肿瘤等。与此同时，在免疫功能、前体信号、信息传导、细胞分泌、疾病发生以及治疗等方面也有很大的应用价值。
提升NK细胞的杀伤能力的多肽药物的开发是细胞治疗的一个重要研究点。
发明内容
为克服现有技术不足，本发明提供一种多肽诱导扩增的NK细胞及用于细胞治疗的用途。
技术方案如下：
一种多肽用于体外诱导扩增NK细胞的用途，或用于制备诱导扩增NK细胞的培养基的用途，该多肽的氨基酸序列为FVAMQRHAGND。
一种多肽体外诱导扩增的NK细胞用于制备治疗肿瘤的药物的用途，该多肽的氨基酸序列为FVAMQRHAGND；所述肿瘤为肺癌。
技术效果如下：
本发明提供的氨基酸序列为FVAMQRHAGND的多肽不仅可以促进NK细胞体外扩增，还可以提高其在体内对肿瘤细胞的抑制作用。
附图说明
图1中A为裸鼠处死后移植瘤剥离前拍照对比，B为剥离移植瘤拍照对比，C为移植瘤重量对比(**P<0.05)。从该图可以看出，与对照组相比，常规组移植瘤生长明显被抑制，这符合NK细胞的功能效应；与常规组相比，多肽组移植瘤生长被抑制更明显，说明十一肽诱导扩增的NK细胞对肿瘤细胞具有更强的抑制作用，功效更强。
具体实施方式
一、材料和试剂
人外周血单个核细胞(货号：CP-H158)、人外周血单个核细胞完全培养基(货号：CM-H158)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
人源NK细胞完全培养基(货号：CM-H168)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
多肽的氨基酸序列为FVAMQRHAGND(Sequence NO.1，命名为十一肽)，委托合肥国肽生物科技有限公司采用常规固相合成法合成，N末端和C末端均未经化学修饰，纯度99.2％。
BALB/c-Nude(裸鼠)购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，6～8周龄，品系类型为Spontaneous Mutation，品系编号为D000521。
二、方法
1、人外周血单个核细胞复苏
收到人外周血单个核细胞后按照说明书使用配套复苏培养基进行复苏，具体步骤如下：
步骤1：取出T25细胞培养瓶，用75％酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态；
步骤2：半贴壁半悬浮细胞处理
(1)收集T25细胞培养瓶中的培养基至50mL离心管中，用吸管吸取PBS，吹洗细胞培养瓶1-2次，收集清洗液；经1200-1500rpm离心3min，弃上清，收集细胞沉淀①；
(2)添加0.25％胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5mL完全培养基终止消化；
(3)用吸管轻轻吹打混匀，收集细胞悬液至离心管中；经1200-1500rpm离心3min，弃上清，收集细胞沉淀②；
(4)吸取5mL新鲜完全培养基，重悬细胞沉淀①、细胞沉淀②，把①、②混匀；
(5)用吸管轻轻吹打混匀、分散细胞，按实验需求接种于实验器皿内，然后补充适量新鲜的完全培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；
(6)待细胞状态稳定后，用于实验；可以每2-3天换液一次新鲜的完全培养基。
2、NK细胞诱导扩增
取生长状态良好的人外周血单个核细胞，消化，用人源NK细胞完全培养基重悬，悬液中细胞浓度为1×106个/mL，24h后，按如下分组继续培养：
多肽组：在培养基中添加终浓度为50、100μg/mL的十一肽，每2～3d补加含有对应浓度十一肽的人源NK细胞完全培养基，维持细胞浓度为1×106个/mL；
常规组：培养基中不添加十一肽，其他同多肽组。
3、扩增倍数和CD3-CD56+细胞比例测定
继续培养5、10d后，用细胞计数法统计培养液中细胞总数，其与初始细胞总数的比值为培养期间的扩增倍数。NK细胞表型为CD3-CD56+，通过测定CD3-CD56+即可获知NK细胞纯度。具体测定方法按照流式操作手册进行。
4、对肿瘤细胞杀伤力测定
取对数生长期的肺癌A549细胞用生理盐水制成细胞浓度为1×107个/mL的悬液，按0.1mL/只的接种量接种于裸鼠右腋窝皮下。待移植瘤生长至80～100mm3时，随机分为3组，每组5只，进行不同的处理，具体如下：
常规组：按0.1mL/只的接种量尾静脉注射上述常规组继续培养10d的NK细胞的生理盐水悬液，含NK细胞1×106个；
多肽组：与常规组相比，NK细胞采用的是100μg/mL多肽组继续培养10d的NK细胞，其他相同；
对照组：只注射等剂量的生理盐水。
首次尾静脉注射后，每隔2d再次注射，共注射5次，并与最后1次注射24h后处死、拍照，剥离移植瘤，称重。
5、统计分析
统计分析采用SPSS 17.0软件，结果用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
三、结果
1、扩增倍数和CD3-CD56+细胞比例
结果如表1所示，与常规组相比，多肽组无论是细胞扩增倍数还是CD3-CD56+细胞比例都显著提高，且多肽浓度越高，提高越明显，说明十一肽对NK细胞的扩增促进作用明显。
表1各组细胞扩增倍数和CD3-CD56+细胞比例
2、对肿瘤细胞杀伤力
图1中A为裸鼠处死后移植瘤剥离前拍照对比，B为剥离移植瘤拍照对比，C为移植瘤重量对比。从图1结果可以看出，与对照组相比，常规组移植瘤生长明显被抑制，这符合NK细胞的功能效应；与常规组相比，多肽组移植瘤生长被抑制更明显，说明十一肽诱导扩增的NK细胞对肿瘤细胞具有更强的抑制作用，功效更强。
通过上述试验，可以发现，本发明提供的序列为FVAMQRHAGND的多肽不仅可以促进NK细胞体外扩增，还可以提高其在体内对肿瘤细胞的抑制作用。
Claims (1)
1.一种多肽用于体外诱导扩增NK细胞的用途，或用于制备诱导扩增NK细胞的培养基的用途，该多肽的氨基酸序列如Sequence NO.1所示。
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