CN108409866A - 一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒感染及相关疾病的多表位组合肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒感染及相关疾病的多表位组合肽，所述多表位组合肽由结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)羧基端多肽结合区、铰链区及HPV E6、E7 T细胞抗原表位肽组成，所述多表位组合肽通过HSP刺激表位肽‑铰链区‑HPV CTL表位的排列方式呈线性排列。本发明多表位组合肽可以作为疫苗在皮内、皮下、病灶或粘膜组织注射诱导特异性T淋巴细胞介导的免疫反应，在组织和局部引发有效的抗病毒效应，治疗和预防HPV感染及相关疾病。本发明多表位组合肽具有使用剂量低、无需添加人工赋形剂的优点。

Description

一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒感染及相关疾病的多表位 组合肽
技术领域
本发明涉及一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒(HPV)感染及其引起的相关疾病的多表位组合肽。具体地，本发明涉及一种用于交叉诱导人T细胞增殖及HPV特异性T淋巴细胞应答的多表位组合肽；包含所述多表位组合肽的疫苗组合物；以及所述组合物在制备和治疗HPV相关疾病药物中的应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)及相关宫颈癌在女性恶性肿瘤发病率中高居第二位，仅次于乳腺癌。根据宫颈癌病因学研究表明，99％的宫颈癌患者体内均有高危型HPV DNA的表达。全世界平均每年约有35万以上的患者死于宫颈癌，并且其数量呈上升趋势。在全球范围内，平均每一分钟新增一例宫颈癌患者，平均每两分钟便有一位患者死于宫颈癌。在我国，平均每年约有13万新患宫颈癌的女性，占世界宫颈癌新发病例总数的28％。
2006年6月美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准4价疫苗(Gardasil，主要针对HPV 6、11、16、18)上市，随后2价疫苗(Cervarix，主要针对高危型HPV 16、18)以及9价疫苗(Gardasil 9，主要针对HPV 6、11、16、18、31、33、45、52、58)也相继上市。但是预防性HPV疫苗仅起到预防的作用，对已经感染了HPV的患者尤其是长期持续感染HPV的患者而言，单纯的注射预防性HPV疫苗治疗效果甚微。更重要地，术后复发的宫颈疾病患者多为HPV整合感染所致，针对L1为靶抗原的预防性HPV疫苗对整合后的HPV感染治疗效果有待提高。因此，针对HPV预防和治疗双重效果的疫苗亟待研发。
根据已有数据显示，目前发现有200种不同类型的HPV。在多种类型的HPV中，高危型HPV包括但不局限于HPV16、18、31、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82的感染与宫颈癌以及宫颈癌前病变的发生密切相关。并且在高危型HPV亚型中，HPV16、HPV18是最常见的致癌类型，在我国的流行病学研究中显示，宫颈癌患者中HPV16以及HPV18的阳性率高达50％以上。
HPV是无包膜的双链闭环小型DNA病毒，其基因组编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白和L1、L2两个晚期蛋白。其中E1、E2蛋白参与调控HPV DNA的复制和转录。E2蛋白还可以抑制编码E6和E7蛋白基因的表达。已证明，HPV E6和E7蛋白是高危型HPV的主要致癌蛋白，而高危型HPV DNA与宿主细胞整合时可造成E1和E2区的基因缺失，从而引起E6和E7持续高水平表达，E6蛋白、E7蛋白分别作用p53蛋白和pRb蛋白，使p53蛋白和pRb蛋白丧失抑癌功能，破坏正常的细胞周期调控，促使细胞恶性增殖及永生化。并且这两种癌蛋白的表达是维持肿瘤细胞处于转化状态所必须的，只表达于HPV感染的组织中，所以E6和E7蛋白是HPV治疗的理想靶抗原，并且也是主要的特异性靶抗原。
热休克蛋白(HSP)是一类天然的、自身具有免疫佐剂作用的载体蛋白，可以和多种蛋白质、肽分子接合，发挥多种生理功能。所述生理功能包括但不局限于帮助氨基酸链折叠并装配成正确的三维结构、清除因受损而无法折叠的氨基酸链、护送蛋白分子定位并转运寻找目标分子。并且，HSP可活化抗原提呈细胞(APC)，而HSP70作为HSP家族中最为重要的一族，在所有生物细胞中都有表达、进化上高度保守，可和巨噬细胞上的受体结合，从而有效激活免疫反应。
目前，针对HPV E6\E7抗原细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的表位设计多肽疫苗成为治疗宫颈癌的重要方向。然而，单一普通T细胞表位肽虽然在一定程度上能激发抗HPV免疫应答，但效果欠佳，原因在于：单一的HPV16/18E6、E7T细胞表位肽与MHC-I分子的亲和力不够高，易被多种肽酶降解、半衰期短，使其在体内激发T细胞应答的效果不理想。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒(HPV)感染及其引起的相关疾病的多表位组合肽。
本发明的另一个目的在于提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含本发明所述的多表位组合肽。
本发明的另一个目的在于提供一种本发明所述组合物在制备预防和治疗HPV相关疾病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒相关疾病的多表位组合肽，其特征在于，所述多表位组合肽由结合杆菌热休克蛋白70羧基端多肽结合区、铰链区及HPV E6或E7T细胞抗原表位肽组成，所述多表位组合肽通过HSP刺激表位肽-铰链区-HPV CTL表位的排列方式呈线性排列。
作为改进的技术方案，所述结合杆菌热休克蛋白70羧基端多肽结合区为刺激表位407区～424区。
作为改进的技术方案，所述铰链区是亲水性的柔性肽接头，序列为Ala-Ala-Ala。
作为改进的技术方案，所述HPV E6或E7T细胞抗原表位肽为HPV 16E6、HPV 16E7、HPV 18E6或HPV 18E7细胞抗原表位肽。
作为改进的技术方案，所述多表位组合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:14所示的任意一种。
作为改进的技术方案，所述多表位组合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明还提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求1～6任一项所述的多表位组合肽。
作为改进的技术方案，所述疫苗组合物包含佐剂。
作为改进的技术方案，所述佐剂包括无机佐剂、有机佐剂、细菌佐剂、核酸佐剂以及细胞因子佐剂。
本发明还提供一种如上述的疫苗组合物在制备预防和治疗HPV相关疾病药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
HPS70刺激表位407-424(QPSVQIQVYQGEREIAAH)区位于HSP多肽结合环L3、L4和L4、L5基部，具有7个重要的氨基酸残基，分别为Q407、P408、S409、V410、Q411、E420以及H424。所述刺激表位407-424(QPSVQIQVYQGEREIAAH)比HSP70羧基端或HSP70具有更强的免疫佐剂作用，加强了HSP70与CD40的结合，增强了CD40-HSP70途径中P38MAP激酶磷酸化，进一步促进特异性免疫应答。CD40可在CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞表达，CD40信号是T细胞增殖成熟、分化以及功能调节的关键途径。所述CD40信号激发可增强单核细胞的生存能力，促进T细胞的杀伤活性，并可减少针对自身的免疫反应。本发明进一步优化利用HSP70 407-424(QPSVQIQVYQGEREIAAH)刺激表位分子伴侣作用，使其在HPV相关疾病生物治疗中展示了良好的应用前景，为HPV相关疾病治疗疫苗提供了较好的设计。
在HPV相关疾病中起中心作用的是T细胞免疫反应，而T细胞抗原识别位点约有8个氨基酸，在所述多表位组合肽的设计中，在多肽分子中引入短而柔软性强的“铰链区”连接顺序，设计“HSP+AAA+HPV CTL表位”抗原线性排列的方式可显著提高天然HPV16/18 E6、E7T细胞抗原表位肽的免疫原性。在HPV16/18 E6、E7 T细胞抗原表位肽的N端氨基酸上顺序连接HSP70刺激表位407-424区、铰链区-AAA-。其中所述HSP70刺激表位407-424区导致HPV16/18 E6、E7 T细胞表位肽段易被细胞吞噬及在胞内被提呈，其分子结构可辅助多肽CTL表位识别，借助多肽转运蛋白质至内质网腔内提交给MHC-I类分子，形成HPV16/18 E6、E7 T细胞抗原表位肽-MHC复合物，并再转运至细胞表面，被提呈给CD8+T细胞的T细胞受体(TCR)识别，从而激发更强的免疫反应。在上述过程中，HSP刺激表位407-424可有助于保持MHC-I与HPV16/18 E6、E7 T细胞抗原表位肽结合。
所述多表位组合肽不易被肽酶水解，其本身既具有免疫佐剂的作用，同时又含有免疫表位，HSP70 407-424区(QPSVQIQVYQGEREIAAH)可以协同HPV16/18 E6、E7 T细胞抗原表位肽共同作用，诱导活化多个CTL应答。所述多表位组合肽的免疫剂量低，纳摩水平的组合肽就足以交叉诱导T细胞增殖，诱导抗原呈递细胞(antigen processing cells，APCs)加工处理形成短肽，与MHC-I分子形成MHC I/肽(peptide)复合物并呈现于APCs细胞，产生CTL活化的关键信号。因此，使用本发明多表位组合肽可省略常规蛋白免疫需要添加的人工赋形剂。
附图说明
图1是注射多肽疫苗实验组与对照组小鼠预防模型瘤重图；
图2是预防组模型中注射多肽疫苗实验组与对照组CTL杀伤率结果图；
图3是注射多肽疫苗实验组小鼠与对照组小鼠治疗模型瘤重图；
图4是治疗组模型中注射多肽疫苗实验组与对照组CTL杀伤率结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
首先，本发明提供一种用于治疗和预防由感染人乳头瘤病毒(HPV)引起的相关疾病的多表位组合肽。所述多表位组合肽包括结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)羧基端多肽结合区、铰链区，及HPV E6或E7 T细胞抗原表位肽，所述多表位组合肽通过HSP刺激表位肽-铰链区-HPV CTL表位的排列方式呈线性排列。本发明提供的多表位组合肽通过铰链呈线性排列，在多肽分子中引入短而柔软性强的“铰链区”连接顺序，设计“HSP表位肽-肽接头-HPVCTL表位”的线性排列方式可显著提高天然HPV16/18 E6、E7 T细胞抗原表位肽的免疫原性。
在一个实施方案中所述HPV E6、E7 T细胞抗原表位肽为HPV 16E6、HPV 16E7、HPV18E6或HPV 18E7细胞抗原表位肽。
具体地，通过以下方式预测所述HPV E6、E7 T细胞抗原表位：通过NCBI网站获得HPV16/18E6、E7抗原的蛋白质序列(网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)。采用针对抗原加工相关转运子(Transporter associated with antigenprocessing,TAP)，结合生物信息学分析HPV16/18E6E7蛋白的MHC抗原结合表位，预测HLA-A1、A2、A3、A11和A24限制性抗原决定簇，筛选出一致性高、特异性以及亲和力强、免疫原性以及抗原性好的HPV16/18 E6、E7的肽片段作为T细胞表位候选片段。共预测14个HPV16/18E6E7抗原表位，分别为HPV16E6aa.11-19、HPV16E7aa.7-15、HPV16E7aa.11-19、HPV16E7aa.49-57、HPV16E7aa.61-69、HPV16E7aa.66-74、HPV16E7aa.82-90、HPV16E7aa.86-93、HPV18E6aa.12-41、HPV18E6aa.84-110、HPV18E7aa.6-26、HPV18E7aa.43-72、HPV18E7aa.75-102以及HPV18E7aa.86-94。
本发明多表位组合肽的具体结构为在HPV16/18 E6、E7 T细胞抗原表位肽的N端氨基酸顺序连接HSP70刺激表位407-424区、铰链区-A-A-A-。所述多表位组合肽的序列如SEQID NO:1至SEQ ID NO:14所示。其中，SEQ ID NO:1包含HPV16E6aa.11-19表位、SEQ ID NO:2包含HPV16E7aa.7-15表位、SEQ ID NO:3包含HPV16E7aa.11-19表位、SEQ ID NO:4包含HPV16E7aa.49-57表位、SEQ ID NO:5包含HPV16E7aa.61-69表位、SEQ ID NO:6包含HPV16E7aa.66-74表位、SEQ ID NO:7包含HPV16E7aa.82-90表位、SEQ ID NO:8包含HPV16E7aa.86-93表位、SEQ ID NO:9包含HPV18E6aa.12-41表位、SEQ ID NO:10包含HPV18E6aa.84-110表位、SEQ ID NO:11包含HPV18E7aa.6-26表位、SEQ ID NO:12包含HPV18E7aa.43-72表位、SEQ ID NO:13包括HPV18E7aa.75-102表位、SEQ ID NO:14包含HPV18E7aa.86-94表位。
本发明所述的多表位组合肽可用于体内和体外交叉诱导T细胞增殖成熟及HPV特异性T细胞应答。所述多表位组合肽可以作为抗原配合白介素2(IL-2)、干扰素ɑ(IFN-ɑ)、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)等细胞因子在体外诱导单个核细胞(PBMC)增殖并获得HPV特异性的CTL细胞。其中所述HPV特异性的CTL细胞可以在体外抑制、杀伤HPV16/18阳性细胞的生长。
本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含本发明所述的任一种多表位组合肽。
优选的本发明的疫苗组合物可以配合佐剂使用或单独使用。用于疫苗组合物的佐剂可以是但不局限于无机佐剂、有机佐剂、细菌佐剂、核酸佐剂以及细胞因子佐剂。具体地，细菌佐剂可以是但不局限于卡介苗(BCG)、核酸佐剂可以是但不局限于寡聚脱氧核糖核酸(CpG)、细胞因子佐剂可以是但不局限于IL-2、IFN-ɑ、IFN-γ、GM-CSF。在皮内、皮下、病灶或粘膜组织注射，诱导HPV抗原特异性CTL细胞介导的免疫反应。在实践中，本领域技术人员已知的用于疫苗制备的所有物质均可适用于本发明的疫苗组合物。
本发明所述疫苗组合物可作为一种抗原，在体外间接处理和孵育人自体细胞或供体细胞，再次或多次施用于患者皮内、皮下、病灶或粘膜组织以达到刺激和增强抗病毒免疫的效果，治疗HPV感染及引起的相关疾病。具体地，所述自体或供体细胞包括但不局限于淋巴细胞、树突状细胞、脐带血细胞。
本文中所用术语“HPV相关疾病”是指HPV感染所致宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、息肉、疣等病变。
实施例1：多表位组合肽诱导活化HPV特异DC-CIK免疫
实验组：使用Fmoc固相合成法人工合成的多表位组合肽片段HSP70 407-424-AAA-HPV16 E7 11-19。将所述HSP70407-424-AAA-HPV16 E7 11-19用PBS溶解，浓度定为1mg/ml，过滤后备用。
对照组：使用Fmoc固相合成法人工合成的HPV16E7T细胞抗原表位肽HPV 16E7 11-19。将所述HPV16 E7 11-19用PBS溶解，浓度定为1mg/ml，过滤后备用。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，纯度在90％以上，收获率可达80-90％，活细胞百分率在95％以上。
(1)DC-CIK细胞的制备
将所述PBMC用0.9％的生理盐水洗涤两次后，用无血清的X-VIVO15培养基调节细胞浓度至2×106个/ml。
将上述已经洗涤并调节浓度的PBMC接种于培养瓶，并将所述培养瓶置于37℃、5％的CO2培养箱孵育2小时后，收集贴壁细胞以及悬浮细胞。
(2)HPV特异DC细胞的制备
将所述贴壁细胞置于培养瓶中，加入添加rhGM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(500U/ml)的X-VIVO15培养液10ml。然后将培养瓶置于37℃、5％的CO2培养箱中诱导，并于第3天补加添加rhGM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(500U/ml)的X-VIVO15培养液10ml。于第5天分别于实验组加入5μ1终浓度为1mg/ml的HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽、对照组加入5μ1终浓度为1mg/ml的HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽，空白组不加抗原肽。第6天加入终浓度为500U/ml的TNF-ɑ诱导DC成熟。最后于第7天收获成熟的HPV特异DC细胞。
(3)CIK细胞的制备
将悬浮细胞重悬于无血清的X-VIVO15的培养液中，调整细胞浓度为2×106个/ml，添加终浓度为1000U/ml的IFN-γ，然后将培养瓶置于37℃、5％的CO2培养箱中孵育。于第2天添加终浓度为100U/ml的IL-1ɑ、终浓度为1000U/ml的IL-2、终浓度为50ng/ml的CD3单抗，培养至第5天时补加含有终浓度为1000U/ml的IL-2的无血清X-VIVO15的培养液。于第7天收获CIK细胞。
(4)HPV特异DC细胞与CIK细胞共培养
将上述已收获的HPV特异DC细胞加入到CIK细胞悬液中，其中CIK细胞与DC细胞按数量比10-60:1的比例混合培养，并每隔3天补加含有终浓度为1000U/ml的IL-2的无血清X-VIVO15的培养液，共培养5-10天后得到HPV特异DC-CIK细胞。
(5)DC-CIK细胞表型的测定
①用PH7.4的PBS调整细胞浓度至1×106个/ml，加入流式细胞检测管中，200μl/管。其中，所述细胞为根据所添加的免疫物的不同分为实验组、对照组以及空白组。实验组所添加的免疫物是HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽、对照组所添加的免疫物是HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽、空白组不加任何抗原肽。所述实验组、对照组以及空白组细胞做5次重复。
②于上述实验组、对照组、空白组细胞中分别加入不同的荧光标记的抗体，其中所述荧光标记的抗体为：CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD3/CD4-FITC/PE、CD3/CD8-FITC/PE、CD3/CD56-FITC/PE。
③将上述已经加入荧光标记的抗体的细胞置于暗处，4℃标记20min。
④用PH7.4的PBS洗涤2次，1500rpm离心5min。
⑤然后用流式细胞仪进行检测、数据分析，其中取5次试验结果的平均值。试验组、对照组以及空白组DC-CIK细胞免疫表型的结果参见表1。
表1实验组、对照组、空白组DC-CIK细胞免疫表型
与未添加抗原肽的空白组DC-CIK和添加HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的对照组DC-CIK相比，添加HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽的实验组DC-CIKCD3+细胞、CD3+CD56+细胞、CD3+CD8+细胞、CD3+CD4+细胞占细胞总数的比例均有所上升，其中实验组DC-CIK CD3+细胞、CD3+CD4+细胞占总细胞比例与空白组DC-CIK以及对照组DC-CIK相比其差异不具有统计学意义，即P<0.05；实验组DC-CIK CD3+CD56+细胞、CD3+CD8+细胞占细胞总数的比例与空白组DC-CIK以及对照组DC-CIK相比其差异具有统计学意义，即P<0.05(表1)。
(6)细胞因子IFN-γ的测定
应用ELISA方法检测细胞因子IFN-γ原理：将标准品、待测样本加入到预先包被IFN-γ抗体的透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中IFN-γ浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中IFN-γ含量。
实验组：HSP70 407-424-AAA-HPV16 E7 11-19诱导的DC-CIK细胞上清液；
对照组：HPV16 E7 11-19诱导的DC-CIK细胞上清液；
空白组：DC-CIK细胞上清液；
结果如下：实验组HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19诱导的DC-CIK细胞上清液的IFN-γ水平为893.2±57.7ng/L；对照组HPV16E7 11-19诱导的DC-CIK细胞上清液的IFN-γ水平为567.3±73.4ng/L、空白组DC-CIK细胞上清液的IFN-γ水平为224.6±23.7ng/L,实验组、对照组以及空白组IFN-γ水平差异有统计学意义，即P<0.01。
(7)HPV特异DC-CIK细胞杀伤率检测
本次试验使用的靶细胞为SIHA。SIHA细胞是感染HPV16型的宫颈癌细胞。
具体地，HSP70 407-424-AAA-HPV16E711-19多表位组合肽诱导的DC-CIK为实验组、HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽诱导的DC-CIK为对照组、未添加抗原肽诱导的DC-CIK为空白组。所述实验组、对照组以及空白组的细胞作为效应细胞。每组设3个复孔，使用含有10％FCS的RPMI-1640培养基补充至200μL。每孔加入1×104个靶细胞50μL，然后按照效靶比10:1、20:1、40:1加入不同数量和体积的效应细胞。实验组、对照组以及空白组DC-CIK细胞杀伤率如表2所示。
表2实验组、对照组、空白组DC-CIK细胞杀伤率
试验结果显示，HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽诱导的实验组DC-CIK细胞在效靶比为10:1、20:1、40:1的平均杀伤率均高于未添加抗原肽的空白组DC-CIK细胞和HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽诱导的对照组DC-CIK细胞，其差异具有统计学意义，即P<0.05(表2)。
体外T淋巴细胞增殖杀伤试验结果表明，通过HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽诱导的DC-CIK细胞比通过HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽诱导的DC-CIK细胞有强的HPV特异的细胞免疫反应和杀伤性。因此，本发明显示了所述HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽可诱导强的HPV特异的细胞免疫反应。
实施例2鼠荷瘤模型动物试验
本发明所使用6-8周龄、雌性、C57BL/6的小鼠，将所述C57BL/6小鼠随机分为3组，分别为空白组、对照组以及试验组。每组35只小鼠(15只小鼠用于预防模型、15只小鼠用于治疗模型，另外5只小鼠进行移植瘤再攻击试验)，其中用于预防模型或是治疗模型中的15只小鼠，5只进行肿瘤形态学检测、5只进行生存率检测、5只进行免疫学检测。具体地，试验组注射的免疫物为HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽疫苗；对照组注射的免疫物为HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽疫苗；空白组注射无菌PBS作为空白对照，用于进行预防以及治疗感染HPV16的小鼠子宫颈癌细胞移植瘤试验。
(1)移植瘤试验
预防模型：C57BL/6小鼠在进行移植瘤接种前，在第0天和第6、13、20天实验组小鼠分别皮内注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽(5mg/kg)、对照组HPV16E711-19 T细胞抗原表位肽(5mg/kg)、空白组注射无菌PBS 100μL。在末次免疫后第1天进行皮下接种移植瘤。取TC-1-HPV16细胞，计数，调整细胞浓度至2×106个/ml。并在C57BL/6小鼠右侧腹股沟皮下接种100μL TC-1-HPV16细胞悬液(2×105/只)。接种后每隔2天观察一次移植瘤生长情况。最后在接种移植瘤第17天处死小鼠，手术剥取肿瘤组织并称重，取小鼠脾细胞进行CTL杀伤试验的检测(表3)。
(2)HPV特异的CTL活性的测定
按照上述获得实验组、对照组以及空白组小鼠的脾脏单个淋巴细胞，将计数后的脾细胞置于6孔板中，用含有IL-2、阳性刺激物(PMA)、HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽/HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽以及10％胎牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO2培养箱培养5天，分别作为试验组和对照组的效应细胞。靶细胞为TC-1-HPV16细胞。
表3预防模型的具体信息
注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽疫苗的实验组小鼠瘤重显著小于注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的对照组小鼠瘤重以及注射无菌PBS的空白组小鼠瘤重(图1),图1显示了在预防组模型中治疗组、对照组以及空白组C57BL/6小鼠瘤重。其中，治疗组小鼠皮内注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽，对照组小鼠皮内注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽，空白组小鼠皮内注射等体积的PBS。
注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽疫苗的实验组的平均CTL杀伤率显著高于注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的对照组以及注射无菌PBS的空白组的CTL杀伤率(图2)。图2显示了在预防组模型中治疗组、对照组以及空白组C57BL/6小鼠CTL杀伤率。其中，治疗组小鼠皮内注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽，对照组小鼠皮内注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽，空白组小鼠皮内注射等体积的PBS。
治疗模型：取TC-1-HPV16细胞，计数，调整细胞浓度至2×106个/ml。于第1天在小鼠右侧腹股沟皮下接种100μL TC-1-HPV16细胞悬液，即每只2×105个，接种后每隔2天观察一次移植瘤的生长情况。在皮下移植瘤攻击1天后开始进行免疫。在第2天和第7，14，20天试验组注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽、对照组注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽、空白组注射无菌PBS。其中空白组注射无菌的PBS 100μL，对照组小鼠注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽(5mg/kg)、实验组小鼠注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E711-19多表位组合肽(5mg/kg)。最后在接种移植瘤第30天处死小鼠，手术剥取肿瘤组织并称重、取小鼠脾细胞进行CTL杀伤试验的检测(表4)。
(3)HPV特异的CTL活性的测定
按照上述获得实验组、对照组以及空白组小鼠的脾脏单个淋巴细胞，将计数后的脾细胞置于6孔板中，分别用含有阳性刺激物PMA、HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽、HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的10％胎牛血清(IL-2)的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO2培养箱培养5天，分别作为实验组和对照组的效应细胞。靶细胞为TC-1-HPV16E7细胞。
表4治疗模型的具体信息
注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽疫苗的实验组小鼠平均瘤重和注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的对照组小鼠平均瘤重显著地小于注射无菌PBS的空白组小鼠瘤重。其中，注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽疫苗的试验组小鼠的平均瘤重与注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的对照组小鼠的平均瘤重相近，两者的差异不具有统计学意义，即P>0.05(图3)。图3显示了在治疗组模型中治疗组、对照组以及空白组C57BL/6小鼠肿瘤。其中，治疗组小鼠皮内注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽，对照组小鼠皮内注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽，空白组小鼠皮内注射等体积的PBS。
注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的多表位组合肽疫苗的实验组其CTL杀伤率显著性地高于注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的对照组以及注射无菌PBS的空白组的CTL杀伤率(图4)。图4显示了在治疗组模型中治疗组、对照组以及空白组C57BL/6小鼠CTL杀伤率。其中，治疗组小鼠皮内注射HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽，对照组小鼠皮内注射HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽，空白组小鼠皮内注射等体积的PBS。
体内鼠荷瘤模型动物试验结果表明，接种多表位组合肽HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的C57BL/6小鼠瘤重小于接种HPV16E7 11-19 T细胞抗原表位肽的C57BL/6小鼠瘤重，并且接种多表位组合肽HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19的C57BL/6小鼠杀伤TC-1-HPV16 E7肿瘤细胞的能力显著高于接种HPV16E7 11-19T细胞抗原表位肽的C57BL/6小鼠。对预防模型和治疗模型的小鼠肿瘤生长情况以及对细胞免疫杀伤检测结果显示，不论是预防模型还是治疗模型，其试验组小鼠皮下的移植瘤成瘤潜伏期时间长于对照组。与对照组和空白组小鼠相比较，试验组小鼠肿瘤生长速度减慢、生存期延长，肿瘤平均瘤重减小，抑瘤率增大。这说明HSP70-HPV16/18E6/E7多表位组合肽疫苗可以有效预防和治疗肿瘤细胞TC-1-HPV16的生长。综上结果显示，HSP70 407-424-AAA-HPV16E7 11-19多表位组合肽可诱导强的HPV特异的细胞免疫反应及肿瘤杀伤活性。

Claims (10)

1.一种用于治疗和预防人乳头瘤病毒相关疾病的多表位组合肽，其特征在于，所述多表位组合肽由结合杆菌热休克蛋白70羧基端多肽结合区、铰链区及HPV E6或E7T细胞抗原表位肽组成，所述多表位组合肽通过HSP刺激表位肽-铰链区-HPV CTL表位的排列方式呈线性排列。
2.根据权利要求1所述的多表位组合肽，其特征在于，所述结合杆菌热休克蛋白70羧基端多肽结合区为刺激表位407区～424区。
3.根据权利要求1所述的多表位组合肽，其特征在于，所述铰链区是亲水性的柔性肽接头，序列为Ala-Ala-Ala。
4.根据权利要求1所述的多表位组合肽，其特征在于，所述HPV E6或E7T细胞抗原表位肽为HPV 16E6、HPV 16E7、HPV 18E6或HPV 18E7细胞抗原表位肽。
5.根据权利要求1所述的多表位组合肽，其特征在于，所述多表位组合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:14所示的任意一种。
6.根据权利要求1所述的多表位组合肽，其特征在于，所述多表位组合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
7.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求1～6任一项所述的多表位组合肽。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含佐剂。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂包括无机佐剂、有机佐剂、细菌佐剂、核酸佐剂以及细胞因子佐剂。
10.如权利要求7所述的疫苗组合物在制备预防和治疗HPV相关疾病药物中的应用。
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