CN106540253A - cGAMP及其衍生物在制备抗肿瘤疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药科技和肿瘤免疫治疗领域，具体涉及环二核苷酸（cGAMP）及衍生物在抗肿瘤以及在制备抗肿瘤疫苗中的应用。本发明研究表明，cGAMP作为疫苗佐剂可以加强肿瘤疫苗的效果，抑制多种肿瘤细胞的生长，具有明显的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤疫苗。经小鼠皮下移植瘤模型表明，cGAMP作为疫苗佐剂对结直肠癌细胞MC38、黑色素瘤细胞B16、前列腺癌细胞TRAMP-C2、肝癌细胞Hepa 1-6、肺癌细胞Lewis、乳腺癌细胞MDA-MB-231的小鼠皮下移植瘤均有显著的抑制作用，因此，可用于制备抗肿瘤疫苗佐剂并治疗肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术、肿瘤免疫治疗领域，具体涉及环二核苷酸（cGAMP）及衍生物在抗肿瘤以及在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
背景技术
肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一，表现为细胞过度增殖和分化异常。WHO专家预测，2020年全球人口肿瘤发病将达到2 000万人，死亡人数将达到1 200万人，肿瘤将成为本世纪人类第一杀手，对人类生存构成最严重的威胁。肺癌、结/直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列。据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。
肿瘤疫苗是近年研究的热点之一，其原理是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。常用的肿瘤细胞疫苗是从机体肿瘤组织中提取肿瘤细胞，经灭活处理后使瘤细胞丧失致瘤性，但仍保持其免疫原性，然后对机体进行主动免疫。理论上这类疫苗可提供肿瘤抗原，包括TSA和TAA，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答。但肿瘤细胞TSA表达低下，并缺乏一些免疫辅助因子的表达，免疫原性较低，常无法有效地诱导抗肿瘤免疫应答。因此，通常采用在疫苗中加入诱导免疫应答的细胞因子，如IL-2 、IL4和GM-CSF等，或导入细胞因子的编码基因，或导入协同共刺激分子的编码基因，借此来达到增强疫苗免疫原性的目的，其中以GM-CSF被认为最为有效。在疫苗接种的部位，局部表达的GM、CSF能够增加抗原提呈细胞APC数量，从而有效地捕获、加工和提呈抗原给T细胞。
GM-CSF，又叫巨噬细胞集落因子。巨噬细胞CSF（GM-CSF）,对髓系干细胞到成熟粒细胞的增殖与分化过程有刺激作用，可促进髓系干细胞向粒系（包括中性粒细胞、嗜酸粒细胞系）、红素、巨核细胞系、粒单细胞系和单核细胞系的共同祖细胞分化，并促进以上各系造血定向干细胞的增殖与成熟。巨噬细胞CSF，对中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞的功能有增强作用；同时，巨噬细胞CSF能激活成熟粒细胞及单核巨噬细胞的功能，提高抗感染和免疫功能。细胞因子GM-CSF，能强烈刺激巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟及趋化。GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞被放射线灭活后往体内注射,可增加局部炎性反应,大量多核细胞、巨噬细胞和DC浸润,促进肿瘤抗原呈递,能够诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。GM-CSF转导疫苗试验主要研究的疫苗为GVAX系列肿瘤疫苗,研究者对GVAX肿瘤疫苗进行了大量的Ⅰ/Ⅱ期临床试验,其中包括黑色素瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和肾癌。其中前列腺癌疫苗已经进入Ⅲ期临床试验。在13个研究小组(355例)的报告中, 2组未见临床反应,其他11组均有患者部分缓解(PR)甚至完全缓解(CR),或生存期延长。在85例黑色素瘤中,3例CR。更令人鼓舞的是,在33例Ⅲ期、Ⅳ期NSCLC中有3例达到CR。这些临床应用均证实这种方法十分安全,能有效刺激机体产生抗肿瘤免疫反应。
在天然免疫通路中，感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合18bp
dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素，活化树突状细胞和T细胞，能够激活免疫应答反应，因此cGAMP作为STING的配体，可以激活免疫系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种环二核苷酸cGAMP作为抗肿瘤疫苗佐剂及其应用。
本发明的免疫佐剂cGAMP，其特征在于可作为抗肿瘤疫苗佐剂，能够显著提高免疫应答反应、抑制肿瘤生长。
发明的环二核苷酸cGAMP，包括cGAMP及其硫（硒）代cGAMP衍生物。
发明的再一方面涉及本发明中所述的cGAMP在制备肿瘤疫苗中的用途；具体地，所述肿瘤包括但不限于结直肠癌细胞、黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌。
本发明的再一方面涉及一种预防多种疾病的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的cGAMP及衍生物，预防疾病；具体地，所述疾病包括但不限于结直肠癌细胞、黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌。
本文提及二核苷酸cGAMP，如不加特殊说明，均指2’,5’-3’,5’-cGAMP Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p] cGAMP(2’-5’)
c[G(2’,5’)pA(3’,5’)p], CAS号为1441190-66-4，分子式为C20H22N10O13P2 .2NH4。
本文提及GM-CSF，又叫人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，参见大多数文献及数据库，人GM-CSF所对应的NCBI检索GENE号为1439，鼠GM-CSF所对应的NCBI检索GENE号为12981。
具体实施方法
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例一：GS-CSF肿瘤细胞疫苗制备
鼠细胞集落因子GM-CSF基因（基因ID：12981）合成自南京金斯瑞生物技术有限公司。pLenti及包装病毒载体购自Life Technology公司。结直肠癌细胞MC38、黑色素瘤细胞B16、前列腺癌TRAMP-C2细胞、Hepa 1-6肝癌细胞、Lewis肺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞均购自美国ATCC。将GM-CSF基因克隆到pLenti载体上，并与包装质粒共转染293e细胞，收集包含包装病毒的上清，制备GM-CSF慢病毒的方法参考Life Technology慢病毒制备手册。制备的慢病毒感染分别结直肠癌细胞MC38、黑色素瘤细胞B16、前列腺癌TRAMP-C2细胞、Hepa 1-6肝癌细胞、Lewis肺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞，并加抗性筛选，细胞培养2-3天后，收集上清，通过Western Blot的方法验证，细胞均能够分泌鼠GM-CSF。通过ELISA试剂盒，验证（购自R&D公司）GM-CSF的表达量为100-500
ng/10e6细胞时，用姨酶消化细胞，并用生理盐水重悬，取10e6个肿瘤细胞，采用高计量辐照30分钟的方式灭活细胞，制备成肿瘤疫苗细胞。
实施例二：cGAMP制备
cGAMP （环化-GMP-AMP）合成酶cGAS和cGAMP按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Ping wei Li，et al., Immunity, 2013, 39(6),
1019-1031.） 腺苷(鸟苷) 5’-α硫（硒）代磷酸三磷酸按照文献方法合成 (Caton-Williams Julianne 等， Science China,
Chemistry, 2012, 55(1), 80-89; Boyle Nicholas A., Nucleosides, Nucleotides and
Nucleic Acids, 2005, 24, 1651-1664.)。按照制备cGAMP的方法，运用制备的重组cGAS酶催化，制备硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP。
实施例三：小鼠肿瘤模型建立与疫苗注射
1.荷瘤鼠模型的建立
C57BL/6雌性小鼠，6-8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。肿瘤模型鼠使用的肿瘤细胞为不表达GM-CSF的肿瘤细胞，包括：结直肠癌细胞MC38、黑色素瘤细胞B16、前列腺癌细胞TRAMP-C2、肝癌细胞Hepa 1-6、肺癌细胞Lewis、乳腺癌细胞MDA-MB-231。细胞培养与传代均参照相应细胞培养方式培养与传代，并在对数时期用于肿瘤小鼠模型的建立。在小鼠肿瘤细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1-5×10e6)/ml每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液 (细胞数目为2-10×10e5个/只)，7-9天左右肿瘤长至直径约3-4mm，致瘤成功。
致瘤成功后，将荷瘤鼠随机均分为4组，每组8只。四组分别是A组：阴性对照组（腹腔注射生理盐水组）、B组：GM-CSF肿瘤细胞疫苗组、C组：GM-CSF肿瘤细胞疫苗加100 ug cGAMP组、D组：GM-CSF肿瘤细胞疫苗加100
ug硫代 cGAMP组。将制备好GM-CSF肿瘤细胞疫苗、生理盐水以及GM-CSF肿瘤细胞疫苗加100 ug cGAMP或硫代cGAMP注射小鼠，皮下注射一次。20天后，处死小鼠并称瘤体重量，观察肿瘤疫苗的作用，抑瘤率=[1-阴性对照组平均瘤重(B、C、D组为实验组) ／A组平均瘤重)]×100％。
2．统计分析
数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。
3. 结果
小鼠皮下接种肿瘤细胞疫苗后，加入cGAMP或硫代cGAMP的肿瘤细胞疫苗可明显抑制肿瘤生长，疫苗接种20天后的瘤重均显著低于未加cGAMP或硫代cGAMP的肿瘤细胞疫苗组（P<0.05 ，P<0.01），表明cGAMP和硫代cGAMP作为肿瘤疫苗的佐剂，具有增强抗肿瘤疫苗作用。具体结果见表1-表6。
表1 cGAMP作为肿瘤细胞疫苗佐剂对鼠结直肠癌细胞MC38抑制效果
（n=8，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.324±0.237 （g） -
GM-CSF肿瘤细胞疫苗组 1.179±0.274 （g） 49.3
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加cGAMP组 0.576±0.248 （g）** 75.2
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加硫代
cGAMP 0.496±0.211 （g）** 78.7
注：*P<0.05
vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组；**P<0.01 vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组。
表2 cGAMP作为肿瘤细胞疫苗佐剂对鼠黑色素瘤细胞B16抑制效果
（n=8，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.473±0.347 （g） -
GM-CSF肿瘤细胞疫苗组 1.418±0.184 （g） 42.7
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加cGAMP组 0.642±0.294 （g）** 74.0
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加硫代
cGAMP 0.478±0.249 （g）** 80.6
注：*P<0.05
vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组；**P<0.01 vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组。
表3 cGAMP作为肿瘤细胞疫苗佐剂对鼠前列腺癌细胞TRAMP-C2抑制效果
（n=8，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 1.874±0.173 （g） -
GM-CSF肿瘤细胞疫苗组 0.796±0.217 （g） 57.5
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加cGAMP组 0.542±0.193 （g）** 71.1
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加硫代
cGAMP 0.417±0.176 （g）** 77.7
注：*P<0.05
vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组；**P<0.01 vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组。
表4 cGAMP作为肿瘤细胞疫苗佐剂对鼠肝癌细胞Hepa 1-6抑制效果
（n=8，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 1.988±0.255 （g） -
GM-CSF肿瘤细胞疫苗组 0.981±0.181 （g） 50.6
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加cGAMP组 0.679±0.243 （g）* 65.8
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加硫代
cGAMP 0.541±0.246 （g）** 72.8
注：*P<0.05
vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组；**P<0.01 vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组。
表5 cGAMP作为肿瘤细胞疫苗佐剂对鼠肺癌细胞Lewis抑制效果
（n=8，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.473±0.283 （g） -
GM-CSF肿瘤细胞疫苗组 0.841±0.342 （g） 66.0
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加cGAMP组 0.517±0.149 （g）** 79.1
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加硫代
cGAMP 0.425±0.279 （g）** 82.8
注：*P<0.05
vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组；**P<0.01 vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组。
表6 cGAMP作为肿瘤细胞疫苗佐剂对鼠乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制效果
（n=8，mean±SD）
组别 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.279±0.317 （g） -
GM-CSF肿瘤细胞疫苗组 0.964±0.363 （g） 55.7
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加cGAMP组 0.748±0.298 （g）* 67.2
GM-CSF肿瘤细胞疫苗加硫代
cGAMP 0.713±0.241 （g）* 68.7
注：*P<0.05
vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组；**P<0.01 vs GM-CSF肿瘤细胞疫苗组。
Claims (4)
1.cGAMP及衍生物在治疗肿瘤中的应用。
2.cGAMP及衍生物在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
3. 根据权利要求2所述的cGAMP在制备抗肿瘤疫苗中的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌细胞、黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌。
4. 使用cGAMP及其衍生物作为免疫佐剂制备抗肿瘤疫苗。
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