CN115282143A

CN115282143A - α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物

Info

Publication number: CN115282143A
Application number: CN202210958789.6A
Authority: CN
Inventors: 段宝玉; 秦紫瑶; 钱鑫柯
Original assignee: Shanghai University of Medicine and Health Sciences
Current assignee: Shanghai University of Medicine and Health Sciences
Priority date: 2022-08-10
Filing date: 2022-08-10
Publication date: 2022-11-04
Also published as: NL2033007B1; WO2024031928A1

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及α‑倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物。实施例结果表明，α‑倒捻子素能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制黑色素瘤生长，α‑倒捻子素能够用于黑色素瘤的治疗。

Description

α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物。

背景技术

黑色素瘤(Melanoma)来源于表皮黑色素细胞，可发生在任何含有这些细胞的组织中，是一类恶化程度高、发病隐匿，侵袭性强的肿瘤。

目前，针对黑色素瘤的治疗方法包括手术治疗、放疗、化学治疗、靶向治疗和免疫治疗等。有研究发现，黑色素瘤具有放射抗拒性，是一种抗放射癌，且放射治疗对人体的正常细胞也会造成伤害。达卡巴嗪和替莫唑胺是抗黑素瘤化学疗法中的常用药物，但其对黑色素瘤治疗的有效率较低，预后性较差。BRAF是黑色素瘤中最常见的致癌基因，应运而生的BRAF抑制剂，如索拉菲尼、威罗菲尼、达拉菲尼等药物，可诱导黑色素瘤转移并迅速消退，但是，BRAF单一疗法的益处只是暂时的，6～7个月后，大多数患者表现出了耐药性。免疫疗法可改善黑色素瘤患者的免疫反应，但存在严重的毒副作用，使得其在临床上的应用仍然受到限制。因此，迫切需要开发低毒性的新型药物来治疗黑色素瘤患者。

α-倒捻子素(α-Mangostin)是一种从天然植物山竹果皮中分离出来的黄酮化合物，对多种癌细胞(如人乳腺癌、结直肠癌、肝癌、白血病和小细胞肺癌)发挥细胞毒性作用，是一种很有前途的抗癌候选物质，但是并未有关于黑色素瘤的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物，丰富α-倒捻子素的用途，有效治疗黑色素瘤。

本发明提供了α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

优选的，所述α-倒捻子素的纯度为＞99.99％。

优选的，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤细胞的增殖能力。

优选的，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤细胞的迁移能力。

优选的，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤细胞的侵袭能力。

优选的，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤生长。

优选的，所述黑色素瘤细胞包括黑色素瘤A375细胞。

优选的，所述α-倒捻子素作为唯一活性成分。

本发明还提供了一种治疗黑色素瘤的药物，所述药物的活性成分包括α-倒捻子素。

优选的，所述药物中α-倒捻子素的有效浓度为5～20μM。

本发明是关于α-倒捻子素治疗黑色素瘤药物的首次报道，在具体实施过程中，采用MTT法检测α-倒捻子素处理黑色素瘤A375细胞对肿瘤细胞增值的影响；采用Transwell法检测α-倒捻子素处理黑色素瘤A375细胞对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响；利用裸鼠皮下植瘤实验检测α-倒捻子素对裸鼠皮下种植黑色素瘤的生长影响，结果表明，α-倒捻子素能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制黑色素瘤生长，α-倒捻子素能够有用于黑色素瘤的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同处理组对黑色素瘤A375细胞增值能力检测结果；

图2～3为不同处理组对黑色素瘤A375细胞迁移能力检测结果；

图4～5为不同处理组对黑色素瘤A375细胞侵袭能力检测结果；

图6为部分脱颈椎处死后的裸鼠；

图7为不同处理组裸鼠体重变化情况；

图8～9为不同处理组裸鼠脱颈椎处死后肿瘤大小；

图10～11为不同处理组免疫组化实验检测结果。

具体实施方式

本发明提供了α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物。

在本发明中，所述α-倒捻子素的纯度优选为＞99.99％。本发明对所述α-倒捻子素的来源没有严格要求，常规购买即可。本发明具体实施过程中使用的α-倒捻子素购买自上海同田生物技术股份有限公司，产品类别：标准品，规格：E-0344。

本发明所述α-倒捻子素通过抑制黑色素瘤细胞的增殖能力，抑制黑色素瘤细胞的迁移能力，抑制黑色素瘤细胞的侵袭能力，抑制黑色素瘤生长，治疗黑色素瘤。

在本发明中，所述α-倒捻子素作为唯一活性成分，治疗黑色素瘤；所述黑色素瘤细胞优选包括黑色素瘤A375细胞。本发明所述黑色素瘤A375细胞取自中国科学院。

在本发明中，所述药物的活性成分为α-倒捻子素。本发明所述药物中α-倒捻子素的有效浓度优选为5～20μM，进一步优选为10～20μM，更优选为20μM。本发明所述药物优选还包括药学上可接受的载体。本发明对所述载体的类型没有严格要求，根据药物的剂型需要常规选择即可。本发明以α-倒捻子素为活性成分制备的药物，使用较低的浓度即可治疗黑色素瘤。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用及药物进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

体外实验

1.细胞培养：取生长状态良好的黑色素瘤A375细胞(中国科学院)，在细胞培养箱中，5％浓度CO_2,，37℃培养条件下，在含10％血清的普通DMEM培养基中培养，先培养48后，消化、悬浮，再进行下述实验：

2.A375细胞的增殖能力检测

采用MTT细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒(Beyotime，上海)检测α-Mangostin对A375细胞增殖的影响，具体如下：

2.1将步骤1培养的黑色素瘤A375细胞，按照2×10³个细胞/孔的接种密度接种至96孔细胞培养板中，平均分为对照组、低浓度处理组、中浓度处理组和高浓度处理组，分别向对照组、低浓度处理组、中浓度处理组和高浓度处理组中添加α-倒捻子素，37℃恒温箱孵育，其中对照组、低浓度处理组、中浓度处理组和高浓度处理组中α-倒捻子素的浓度依次为0μM/L、5μM/L、10μM/L和20μM/L，保持各处理组总培养基体积一致；

2.2分别在步骤2.1孵育24、48、72、96和120h后，向培养孔中添加MTT溶液(5mg/mL)，然后在37℃培养细胞4小时，产生清晰可见的紫色晶体(formazan)，向每个培养孔中添加100μL的Formazan溶剂，溶解紫色晶体，利用分光光度计在570nm波长处测量光密度值，结果如表1和图1。

表1不同处理组孵育不同时间α-倒捻子素后波长检测结果

根据表1和图1可以看出，高浓度处理组(20μM/Lα-Mangostin)处理黑色素瘤A375细胞后，相比对照组(control，即0μM/Lα-Mangostin)、低浓度处理组(5μM/Lα-Mangostin)和中浓度处理(10μM/Lα-Mangostin)，抑制黑色素瘤A375细胞增值能力更明显。

3.A375细胞的迁移能力检测

本实施例使用的Transwell板购买自康宁公司(美国，24孔，8.0μm孔膜)，经步骤2对照组和高浓度处理组处理48h后，A375细胞用1％FBS DMEM培养基重悬，使细胞悬浮液中细胞密度达到2×10⁵个细胞/mL。将200μL细胞悬浮液添加到Transwell板上室，同时在每个下室中放置600μL含有10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％二氧化碳浓度细胞培养箱，孵育约12小时后，细胞从膜的上侧迁移到膜的下侧。用棉签轻轻去除残留在膜上表面的未迁移的A375细胞。将迁移到膜底表面的A375细胞用4％多聚甲醛(PFA；Servicebio，中国武汉)固定15分钟，并在室温避光条件下用Hoechst溶液染色15分钟。随后，将带有已染色A375细胞的Tranwell上室转移到带有PBS的Transwell板的新孔中，并在荧光显微镜下观察(OlympusIX53，中国北京)，结果见图2。采集图2中6个随机选择的区域(10×)，通过Image J软件计算6个区域的平均细胞数，并以对照组数据为单位1，计算高浓度处理组的相对值，具体以对照组的倍数计，进行3次重复(即共采集18个区域)，结果如表2和图3。

表2对照组与高浓度处理组细胞数相对关系

根据表2和图2～3可以看出，20μM/Lα-倒捻子素有效抑制了黑色素瘤A375细胞的迁移能力，抑制率约为64.88％、58.53％、62.91％，平均为62.10％。

4.A375细胞的侵袭能力检测：

本实施例使用的Transwell板购买自康宁公司(美国，24孔，8.0μm孔膜)，经步骤2对照组和高浓度处理组处理48h后，A375细胞用1％_FBS DMEM培养基重悬，使细胞悬浮液中细胞密度达到2×10⁵个细胞/mL。将50μL基质凝胶Matrigel(Becton Dickinson，America)均匀涂抹在每个Transwell上腔中，并在37℃下培养一段时间(约3小时)，将密度为8×10⁴的150μLA375细胞悬浮液添加到Matrigel涂层上室的每个上室中，同时在每个下腔中放置600μL含有10％FBS的DMEM培养基，37℃、5％二氧化碳浓度细胞培养箱，孵育约24小时后，细胞从膜的上侧入侵到膜的下侧。用棉签轻轻去除残留在膜上表面未入侵的A375细胞。将入侵到膜底表面的A375细胞用4％多聚甲醛(PFA；Servicebio，中国武汉)固定15分钟，并在室温避光条件下用Hoechst溶液染色15分钟。随后，将带有已染色A375细胞的Tranwell上室转移到带有PBS的Transwell板的新孔中，并在荧光显微镜下观察(Olympus IX53，中国北京)，结果见图4。图4中6个随机选择的区域(10×)，通过Image J软件计算6个区域的平均细胞数，并以对照组数据为单位1，计算高浓度处理组的相对值，具体以对照组的倍数计，进行3次重复(即共采集18个区域)，结果如表3。

表3对照组与高浓度处理组细胞数相对关系

根据表3和图4～5可以看出，20μM/Lα-倒捻子素有效抑制了黑色素瘤A375细胞的侵袭能力，抑制率约为42.10％、69.62％、68.91％，平均为60.21％。

实施例2

体内实验

1.模型构建

1.1以下步骤在国际动物福利标准和上海健康医学院动物伦理委员会的监督下进行，选择20只6周龄，体重20～25克的，通过了检疫的雌性NU/NU裸鼠(购自浙江维通利华动物实验技术有限公司)，在标准化的动物设施中饲养管理。

1.2肿瘤异种移植试验：首先收集A375细胞，将DMEM与基质凝胶Matrigel按照3:1的体积比混合，悬浮A375细胞，获得细胞悬浮液，使细胞悬浮液中细胞密度达到2×10⁵个细胞/mL；

将步骤1.1雌性NU/NU裸鼠平均分为2组，具体为对照组(control)和高浓度处理组(20μM/Lα-Mangostin)，每组10只裸鼠，分别对各组裸鼠进行如下处理：按照200μL细胞悬浮液/只的注射量，将细胞悬液皮下注射至裸鼠右腋窝(每组10只)。注射后5天，有肿瘤长出，说明造模成功。

2.实验步骤

2.1步骤1注射后5天，即造模成功后，于注射的第6天开始，按照表4给药方式给药，同时，每天检测裸鼠的体重，遵循上海健康医学院伦理委员会指导准则(410482198512239314)，体重检测结果如表5和图7。

表4给药方式

表5不同处理组裸鼠体重变化情况

根据表5和图7可以看出，20μM/Lα-倒捻子素有效降低了模型小鼠的体重。

2.2给药后，每天使用游标卡尺测定肿瘤的长度(L，mm)和宽度(W，mm)。肿瘤体积(V，mm³)按公式计算：V＝L×W²×0.5。当检测到一个肿瘤体积为2×10³mm³时，将所有裸鼠杀死，处死裸鼠后，解剖两组裸鼠，移除原发肿瘤并拍照，观察各处理组裸鼠肿瘤大小，结果如表6和图8～9。

表6各处理组裸鼠肿瘤大小(mm³)

根据表6和图9可以看出，高浓度处理组肿瘤大小明显比对照组肿瘤小，20μM/Lα-倒捻子素在体内明显抑制黑色素瘤A375细胞裸鼠皮下植瘤生长。

2.3免疫组化实验：

参考文献(Beninati S,Oliverio S,Cordella M,Rossi S,Senatore C,LiguoriI,et al.Inhibition ofcell proliferation,migration and invasion ofB16-F10melanoma cells byα-mangostin.Biochem Biophys Res Commun.2014；450(4):1512-1517.)用检测增值蛋白标志分子Ki-67来反映肿瘤的增值能力，具体步骤包括：切除肿瘤块，用10％福尔马林4℃固定12小时。肿瘤切片处理后，在室温下与兔抗Ki67(GB111141；稀释，1:500；Servicebio，中国武汉)孵育1小时，然后与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG(GB23303；稀释，1:200；Servicebio，中国武汉)孵育10分钟，该IgG用作室温下的二级抗体。在显微镜下(放大20倍)随机采集6张染色的视野。计算平均阳性细胞数，重复3次，具体如表7和图10～11，其中图10中胞浆或细胞核内有棕色颗粒的细胞为Ki67阳性细胞，表7和图10～11为显微镜20倍视野测量结果。

表7对照组与高浓度处理组阳性细胞数(个)

根据表7和图10～11可以看出，高浓度处理组中Ki-67信号比对照组组弱，α-Mangostin在体内明显抑制裸鼠皮下黑色素瘤A375细胞增值。

根据上述实施例可以看出，α-倒捻子素能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制黑色素瘤生长，α-倒捻子素能够用于黑色素瘤的治疗。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.α-倒捻子素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述α-倒捻子素的纯度为＞99.99％。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤细胞的增殖能力。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤细胞的迁移能力。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤细胞的侵袭能力。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中α-倒捻子素抑制黑色素瘤生长。

7.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，所述黑色素瘤细胞包括黑色素瘤A375细胞。

8.根据权利要求3～6任一项所述的应用，其特征在于，所述α-倒捻子素作为唯一活性成分。

9.一种治疗黑色素瘤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括α-倒捻子素。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物中α-倒捻子素的有效浓度为5～20μM。