CN102836151A - Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Brevilin A的新用途——Brevilin A作为JAK-STATs信号特异性抑制剂的应用。通过细胞模型筛选实验和蛋白分子检测证明，Brevilin A具有良好的JAK-STATs信号抑制活性，并且能有效抑制相关基因的表达，从而可以有效抑制JAK-STATs信号依赖的细胞的生长，因此，以BrevilinA为活性成分，可用于制备基于JAKs为靶点或JAK-STATs信号为目标的药物，治疗JAK-STATs信号活化相关的疾病：以Brevilin A为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的靶向药物，如各种口服制剂和注射剂等。

Description

Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用

技术领域

本发明属于医药应用领域，涉及一种 Brevilin A 的医药新用途，尤其涉及Brevilin A 作为 JAK-STATs 信号靶向抑制剂的应用。

背景技术

 细胞中JAK-STATs信号对细胞信号的传导及各项生理活动至关重要，该家族信号的异常会导致众多疾病的发生，包括癌症和免疫相关疾病。JAKs（Janus Kinase）家族包括JAK1,JAK2,JAK3和Tyk2四个成员。而JAKs下游的STATs（Signal transducer and activator of transcription）家族包含7个成员（STAT1-STAT6，其中STAT5A 和STAT5B有两个独立的基因编码）。在许多人类实体瘤及血液相关疾病中，通常STATs活性表现为异常，最常见的为STAT3过度活（Bowman et al., 2000; Garcia and Jove, 1998; Yu et al., 2009）。

    在众多STAT3异常活化的肿瘤细胞中，抑制STAT3信号能有效抑制细胞生长、诱导细胞凋亡和减少肿瘤细胞的转移（Iwamaru et al., 2007; Rahaman et al., 2002）。如在神经胶质瘤（Iwamaru et al., 2007; Rahaman et al., 2002）、乳腺癌（Garcia et al., 2001）、结肠癌）、前列腺癌），黑色素瘤（Niu et al., 2002; Niu et al., 1999）等细胞中，通过STAT3抑制蛋白表达、小干扰 RNA或特异性抑制剂来抑制STAT3抑制剂，能显著下调STAT3下游相关基因，如CyclinD1、Bcl-xl、c-Myc、Survivin等，从而调节肿瘤细胞周期减缓细胞增殖，增加凋亡（Weerasinghe et al., 2007; Zhang et al., 2012）。作为 STATs 家族上游最重要的激酶，由于突变或其他原因引起的JAKs活性过高,持续激活下游蛋白（主要如STATs家族），与上述肿瘤疾病相关外，通常会与血液疾病、自身免疫疾病相关（Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Kralovics et al., 2005; Levine et al., 2005; Mullighan et al., 2009）。综上所述在这些相关的疾病中，抑制JAK-STATs 信号将有效抑制和缓解该信号异常活化带来的疾病。

Brevilin A是一种天然产物，可从鹅不食草、短叶老鹤草等天然植物中提取，其结构为：

 中国专利申请201110423357.7公开了一种以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型及其构建和应用，在筛选相关抑制剂的过程中，发现 Brevilin A 能有效抑制所选用筛药模型中的荧光素酶活性，经过进一步验证发现，Brevilin A 对 JAK-STATs 信号特别是 JAKs 家族激酶活性及下游STAT3有稳定的抑制效果，且在细胞水平具有高效低毒的抑制效果，能对STAT3信号依赖的细胞具有较好的抑制作用。由于Brevilin A本身是天然中草药的成分，其副作用在可控范围之内，故作为JAK-STATs信号抑制剂有很大潜力开发成药物，治疗由于JAK-STATs持续活化造成的相关疾病。

发明内容

本发明的目的是提供一种 Brevilin A 的新用途——Brevilin A作为JAK-STATs 信号抑制剂的应用。

下面以STAT3为例，通过细胞实验来说明Brevilin A对JAK-STATs信号的抑制作用。

仪器：PerkinElmer Victor3 荧光/化学发光分析仪， Biorad 蛋白质电泳及转印系统，Biorad荧光定量PCR分析仪。

试剂：萤火虫荧光素酶测定试剂盒以及RNA反转录试剂盒购自Promega公司；IL-6购自Peprotech公司；Brevilin A购自BioBioPha 公司；DMEM（高糖）及胎牛血清购自Hyclone（Thermo公司）；各种抗体购自Cell Signaling Technology公司；总RNA提取试剂盒购自天根公司；MTT购自上海生工。

1、不同浓度 BrevlinA 对 STAT3 活性的抑制实验

使用以STAT3为靶点的药物筛选细胞模型（药物筛选细胞模型的结构参见中国专利201110423357.7）验证BrevlinA对STAT3活性的抑制，分别用浓度为20 μM、17.5 μM、15 μM、12.5 μM、10 μM、7.5 μM、5 μM、2.5 μM 以及1 μM的Brevilin A处理药物筛选模型细胞株A549R，24小时后测定荧光；同时以MTT实验测定相应浓度下Brevilin A对该细胞的生长抑制作用。

以10,000 个/孔将细胞铺于96孔板，12h 后，将Brevilin A按上述浓度用完全培养基稀释，吸掉原来的培养基，加入含有Brevilin A的培养基，每个浓度n=10。Brevilin A母液用DMSO溶解，所用浓度培养基中DMSO含量不超过0.2%，并以不含Brevilin A的DMSO作为对照。24 h 后，5孔测定荧光素酶活性，5孔用MTT实验测定。测定荧光素酶活性时，每孔加入 50 μl稳定性荧光素酶底物，室温避光孵育10 min后，用荧光或化学发光分析仪测定荧光值。MTT试验中，加入 20μl  5 mg/ml MTT母液，37孵育2h后测定吸光值。（三次重复试验；***, p<0.001）。

图1为不同浓度Brevilin A对STAT3活性的抑制率。图1的结果表明，24 h内，Brevilin A对STAT3信号的抑制呈浓度依赖效应。

图2 为Western-Blot检测使用Brevilin A处理A549R细胞对STAT3信号的抑制。图2表明，与荧光信号对应浓度的Brevilin A处理A549R细胞 24小时后，STAT3活性被显著抑制，以Tyr705-STAT3磷酸化“pTyr705-STAT3”表示。

2、BrevlinA对STAT3持续活化细胞的抑制

文献报道，在STAT3持续活化细胞中，抑制 STAT3 将明显抑制这一类细胞的增殖及生长，人乳腺癌细胞 MDA-MB-468 及人前列腺癌细胞 DU145 就是典型的STAT3持续活化细胞，抑制 STAT3 将有效抑制这两种细胞的增殖，故用来验证 BrevlinA 的效果。

DU145和 MDA-MB-468 细胞于10 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换新鲜完全培养基，加入 Brevilin A 处理 2 h（10 μM），同时以加入等量 DMSO 作为对照，提取总蛋白，进行 Western-Blot 分析。结果见图3。

图3的结果表明，使用10 μM的 Brevilin A 处理DU145细胞 2 h，能有效抑制DU145 和MDA-MB-468的STAT3活性，同时对其他信号如AKT信号途径（以Ser473-AKT，及下游Ser9-GSK-3β的磷酸化“pSer473-AKT”、“pSer9-GSK-3β”表示）无显著影响。

使用Brevilin A长时间处理DU145和MDA-MB-468细胞，以人正常上皮细胞hTERT-BJ作为对照：将相同数目hTERT-BJ、DU145和MDA-MB-468细胞接种于96孔板至汇合度25%，换含有10 μM的Brevilin A的完全培养基处理细胞，以含有DMSO的完全培养基作为对照，分别处理24 h、48 h、72 h，加入20μl 5 mg/ml MTT母液，37孵育2h后测定吸光值（n=5，三次重复试验）。

      图4为Brevilin A对hTERT-BJ、DU145和MDA-MB-468细胞的抑制效果。图4的结果显示，Brevilin A对STAT3信号依赖的DU145和MDA-MB-468有更强的生长抑制作用。

 3、Brevlin A对由细胞因子介导的STAT3信号活化的抑制

使用IL-6刺激不同细胞后检测Brevilin A的抑制作用。HEK293T、Hela和HepG2于10 cm 细胞于培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，加入Brevilin A预处理30 min（10 μM），同时以加入等量DMSO作为对照，IL-6（250 ng/ml）处理2 h后提取总蛋白。

图5为Western-blot 检测Brevilin A对细胞因子IL-6介导的STAT3活性的抑制。图5的结果表明，Brevilin A能有效抑制IL-6激活的STAT3活化。

同样的方法，使用Brevilin A预处理Hela细胞后，使用IFNα（5000 U/ml0或IFNγ（1500 U/ml） 2 h后提取总蛋白。

图6为Western-blot 检测Brevilin A对细胞因子IFNα或IFNγ介导的STAT3活性的抑制。图6显示，Brevilin A能有效抑制IFNα或 IFNγ 介导的STAT3活化。

进一步实验表明Brevilin A也能有效抑制EGF、OSM、LIF、GM-CSF介导的STAT3信号活化。

4、Brevilin A对STAT3所调控下游基因的转录抑制

HEK293T、Hela和 HepG2于10 cm 细胞培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，加入Brevilin A预处理30 min（HEK293T，10 μM；Hela 和HepG2，15 μM ），同时以加入等量 DMSO 作为对照，IL-6（250 ng/ml）处理4 h后提取总RNA，反转录后，做半定量分析。

图7为半定量 PCR 分析 Brevilin A 对细胞因子IL-6介导的STAT3下游基因socs3的转录抑制。图7的结果表明，使用 Brevilin A 预处理细胞后，IL-6诱导的 STAT3 下游基因socs3 mRNA水平明显低于未用 Brevilin A 预处理的细胞，证明Brevilin A可以抑制由STAT3调控的下游基因的转录。

5、Brevilin A 在细胞中抑制STAT3上游JAKs家族激酶结构域JH1的活性

进一步研究表明Brevilin A涉及到对STAT3上游活性的抑制，从而抑制了STAT3活性。在HEK293T细胞中使用慢病毒载体稳定过表达JAKs家族激酶结构域JH1，分别为pLV-JAK1-JH1、 pLV-JAK2-JH1、 pLV-JAK3-JH1和pLV-Tyk2-JH1，均带上His标签，同时pLV空载体作为对照。

图8为 Western-Blot 检测 Brevilin A 对JAKs家族酪氨酸激酶活性的抑制。图8的结果表明，使用Brevilin A处理细胞，能有效抑制JAKs-JH1的酪氨酸激酶对底物蛋白的酪氨酸的催化活性。表达JAK1-JH1, JAK2-JH1, JAK3-JH1和Tyk2-JH1（“anti-His”表示）的 HEK293T 细胞于培养皿中生长至汇合度为70%~80%，更换无血清培养基过夜，加入Brevilin A（15 μM）处理4 h后提取总蛋白。使用抗酪氨酸磷酸化抗体检测胞内底物蛋白的总体磷酸化水平的变化（“anti-pTyr”表示），发现Brevilin A能有效抑制JAKs-JH1酪氨酸激酶域的对底物蛋白的催化能力。

大量实验证明，Brevilin A 对JAKs家族蛋白抑制后可以抑制除了STAT3以外的其余STATs成员，包括STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6。

实验证明，Brevilin A对具有持续活化JAK-STATs信号依赖的细胞均有显著的作用，包括前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞。

通过细胞模型筛选实验和蛋白分子检测证明，Brevilin A具有良好的 JAK-STATs 信号抑制活性，并且能有效抑制相关基因的表达，从而可以有效抑制 JAK-STATs 信号依赖的细胞的生长，因此，以Brevilin A为活性成分，可用于制备基于JAKs为靶点或JAK-STATs信号为目标的药物，在实际应用中可以Brevilin A为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的JAK-STATs信号靶向药物。

附图说明

图1为不同浓度 Brevilin A 对 STAT3 活性的抑制率；

图2为 Western-Blot 检测 Brevilin A 对A549R细胞中STAT3信号的抑制；

图3为 Western-Blot 检测 Brevilin A对 DU145和 MDA-MB-468 的信号影响；

图4为Brevilin A 对STAT3信号依赖的 DU145 和 MDA-MB-468 细胞的抑制效果图；

图5为 Western-blot 检测 Brevilin A对细胞因子IL-6介导的STAT3活性的抑制；

图6为 Western-blot 检测 Brevilin A 对细胞因子 IFNα或IFNγ介导的STAT3活性的抑制；

图7为半定量PCR分析Brevilin A对细胞因子IL-6介导的STAT3下游基因socs3的转录抑制；

图8为 Western-Blot 检测 Brevilin A 对JAKs家族酪氨酸激酶活性的抑制。

具体实施方式

下面具体实施例对本发明Brevilin A作为活性成分，在制备JAK-STATs信号靶向药物中的应用做进一步说明。

实施例1、Brevilin A片剂的制备

      配方： Brevilin A（纯度大于95%）                        20.0g

             填充剂                                      180.0g

             崩解剂                                       10.0g

             黏合剂                                        6.0g

             润滑剂                                        3.0g

             共计                                        200.0g

      工艺：按制备片剂的常规工艺制成片剂1000片，每片含Brevilin A 20mg。

实施例2：Brevilin A胶囊的制备

      配方：Brevilin A（纯度大于95%）                          50.0g

            填充剂                                         85.0g

            黏合剂                                          5.0g

            润滑剂                                         10.0g

            共计                                          200.0g

        工艺：按制备胶囊剂的常规工艺制成1000粒，每粒胶囊含Brevilin A 50mg。

实施例3、Brevilin A注射液的制备

         配方：Brevilin A（纯度大于95%）                       100.0g

               枸橼酸                                          1.0g

               枸橼酸钠                                        0.5g

               氯化钠                                         18.0g

               注射用水                                       2000ml

        工艺：按制备注射剂的常规工艺操作，共制成2ml的注射剂1000支，每支Brevilin A 100mg。

上述各实施例中的填充剂、崩解剂、 黏合剂、润滑剂等辅料均为药剂学上最常规的辅料。 

Claims (9)

1.Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用。

2.如权利要求1所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：所述JAK-STATs信号中的JAK 为JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2中的至少一种。

3.如权利要求1所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：所述JAK-STATs信号中的STATs为STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6中的至少一种。

4.如权利要求1、2或3所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：用于抑制细胞内的JAK-STATs信号活性。

5.如权利要求4所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：用于抑制由于细胞因子激活引起的JAK-STATs信号活性。

6.如权利要求5所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：所述由于细胞因子激活引起的JAK-STATs信号活性为IL-6、EGF、OSM、LIF、GM-CSF、IFNα或 IFNγ介导的JAK-STATs活化信号。

7.如权利要求4所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：用于抑制具有持续活化JAK-STATs信号的细胞。

8.如权利要求7所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：所述具有持续活化JAK-STATs信号的细胞为前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞或白血病细胞。

9.如权利要求1所述Brevilin A作为JAK-STATs信号靶向抑制剂的应用，其特征在于：以Brevilin A为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料，制备成各种剂型的JAK-STATs信号靶向药物。

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