CN105663100B - 药物芬戈莫德的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种药物芬戈莫德的新用途，该用途为芬戈莫德或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备保护6‑OHDA损伤的多巴胺能神经细胞株SH‑SY5Y药物中的应用，制备预防和/或治疗神经系统变性疾病中的应用，所述的神经系统变性疾病为帕金森病。通过研究发现，芬戈莫德能延缓帕金森病的进程，效果显著，作为一种来源于天然产物的新型药物，作用机制也与临床现有抗帕金森病药物不同，主要是侧重于对多巴胺能神经元的保护作用，因此不会出现交叉耐药现象。

Description

药物芬戈莫德的用途

技术领域

本发明涉及一种药物芬戈莫德的新用途。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是中老年人常见的神经系统变性疾病，随着人们生活水平提高和人口老龄化的加剧，以PD为代表的神经系统变性疾病发病率逐年上升，己成为仅次于心血管疾病、恶性肿瘤之后的主要致死疾病，给患者和社会造成沉重的负担。PD发病机制复杂，目前尚无有效治疗手段。临床常用药物如左旋多巴只起改善症状的作用，不能延缓疾病进程，且应用3-5年后其疗效逐渐下降并引起“开-关”现象等严重的毒副作用，因此急需寻找能延缓疾病进程的有效治疗药物。

芬戈莫德(Fingolimod,FTY720)是2010年美国FDA批准的用于复发形式的治疗多发硬化的药物。分子式为：C₁₉H₃₃NO₂.HCl，分子量为343.9，化学结构式如下：

近年来文献研究发现，芬戈莫德在中枢神经系统具有广泛的药理作用，对亨廷顿病、Rett 综合征等都具有良好的作用。

研究发现，帕金森患者的TNF-α含量高于正常，TNF-α在帕金森患者发病中起破坏作用，但也有发现TNF-α在帕金森患者发病中不具有破坏性，而具有保护作用，徐秀芝等研究得出 TNF-α诱导核转录因子-kB参与帕金森的发病过程。文章Novel FTY720-BasedCompounds Stimulate Neurotrophin Expression and Phosphatase Activity inDopaminergic Cells(Medicinal Chemistry，Javier Vargas-Medrano，SeshaKrishnamachari，Ernesto Villanueva，Wesley H. Godfrey，Haiyan Lou，RameshChinnasamy，Jeffrey B.Arterburn,and Ruth G.Perez)，介绍了运用MN9D细胞株，外加损伤因素TNF-α，通过台盼蓝及DAPI染色进行活细胞计数及用 MTS法测定细胞活力简单评价了芬戈莫德对TNF-α损伤MN9D细胞的作用。该文章中所用到的损伤因素TNF-α是一种促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，TNF-α在许多病理状态下产生增多，包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病，在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现TNF-α增多。结合现有技术，该文章仅仅能够得到芬戈莫德对经TNF-α处理的MN9D细胞有保护作用，对于芬戈莫德是否对帕金森患者有作用，以及是否可延缓PD的病理进程目前尚无报道，也无从得知。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种药物芬戈莫德的新用途。

芬戈莫德或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备保护6-OHDA损伤的多巴胺能神经细胞MD9D药物中的应用。

芬戈莫德或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备预防和/或治疗神经系统变性疾病中的应用。

优选：所述神经系统变性疾病为帕金森病。

一种预防和/或治疗神经系统变性疾病的药物，其活性成分为芬戈莫德或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物。

优选：所述神经系统变性疾病为帕金森病。

一种保护6-OHDA损伤的多巴胺能神经细胞株SH-SY5Y的药物，其活性成分为芬戈莫德或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物。

芬戈莫德在制备改善阿扑吗啡诱导的行为学药物中的应用。

所述预防和/或治疗神经系统变性疾病(优选：帕金森病)的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

用芬戈莫德或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物为活性成分制备的预防和/或治疗帕金森病药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

发明人在研究现有治疗帕金森的药物只起改善症状的作用，且严重的毒副作用等问题时发现芬戈莫德对6-OHDA损伤的多巴胺能神经元细胞株有保护作用，于是发明人运用公认的 6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞和建立C57BL/6小鼠PD动物模型，通过系统详细的细胞学和动物学实验层层验证了芬戈莫德作为PD治疗药物的治疗价值。通过运用MTT法测定细胞存活率、 LDH试剂盒测定细胞LDH漏出、流式细胞术及TUNEL染色测定细胞凋亡等多个实验手段，从多个角度层层证实了芬戈莫德的保护作用。体内实验中运用经典的6-OHDA纹状体立体定位注射模型，通过观察阿扑吗啡诱导的行为学、黑质及纹状体TH免疫组化染色、THwestern blot、高效液相测定多巴胺及代谢产物含量等方法进一步评价了芬戈莫德对PD小鼠模型的保护作用，为芬戈莫德作为PD治疗药物提供了详实而充分的数据和支持。

本发明的有益效果：

本发明经过系统的实验证实芬戈莫德是一种潜在的抗神经系统退行性疾病药物。以芬戈莫德作为抗神经系统退行性疾病药物尤其是针对帕金森病具有以下两个优点：(1)治疗帕金森病的临床常用药物如左旋多巴只起改善症状的作用，不能延缓疾病进程，且应用3-5年后其疗效逐渐下降并引起“开-关”现象等严重的毒副作用，芬戈莫德是2010年或美国FDA批准的用于复发形式的治疗多发硬化的药物，多发硬化病与帕金森病之间并不是并发症的关系，所以作为一种新药使用，芬戈莫德在抗帕金森病的方面不会出现出现耐药现象(作为一种来源于天然产物的新型药物，作用机制也与临床现有抗帕金森病药物不同，主要是侧重于对多巴胺能神经元的保护作用，因此不会出现交叉耐药现象)；(2)能延缓帕金森病的进程，效果显著。(3)由于芬戈莫德是临床上已上市药物，因此作为抗帕金森药物研究中，可以大大降低临床前研究中的研究成本，节约资源、缩短研发周期。所有实验数据证明芬戈莫德有良好的抗帕金森病效果，具有潜在的临床应用前景。(4)芬戈莫德在细胞及动物实验中工作浓度均未见有毒性。

附图说明

图1为芬戈莫德对6-OHDA损伤的多巴胺能神经元细胞株SH-SY5Y细胞的保护作用示意图；

图2为芬戈莫德对6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞凋亡保护作用的示意图；

图3为芬戈莫德对6-OHDA损伤PD小鼠模型的保护作用示意图；

图4为芬戈莫德对6-OHDA PD小鼠模型纹状体多巴胺及代谢产物含量影响的示意图；

图5为芬戈莫德对6-OHDA PD小鼠模型脑内BDNF及AKT、ERK等磷酸化影响的示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实验材料：人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y购自美国ATCC；C57BL/6小鼠购自山东大学实验动物中心，均为雄性，8-10周龄；芬戈莫德购自Cayman chemical公司；6-OHDA购自Sigma公司；p-AKT、AKT、p-ERK、ERK抗体购自Cell signaling technology公司，BDNF 抗体购自Santa cruz公司，TH抗体购自Chemicon；LDH及TUNEL试剂盒购自Roche， Annexin-V-FITC购自BD。

实验方法：

1.采用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞培养细胞系。用DMEM-F12培养基，10％的牛胎血清。培养箱条件：37℃，5％CO₂。每天换一次培养基。隔天传代一次。

2.MTT法测定细胞存活率

取指数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25％胰酶消化分散成单个细胞。以7000个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后加入不同浓度的芬戈莫德(0.5μM、1μM、2μM、4μM)预处理 12h，再加入100μM的6-OHDA继续培养24h，加入MTT(5mg/ml)20μL/孔，放入培养箱内继续孵育4h后弃去培养基，每孔加入200μL的DMSO溶液，充分震荡，用酶标仪在570 nm及630nm处检测吸光度(OD值)，计算并比较分析细胞的存活率。

3.细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)测定

细胞接种于96孔板，实验设为正常对照组，6-OHDA模型组，不同剂量的芬戈莫德(0.5 μM、1μM、2μM、4μM)干预组。细胞处理方法同上，实验结束前一小时加LDH释放剂(Max对照组)，37℃孵育1h，取出96孔板，25℃300rpm，离心5min，每孔取出120μL上清，加入另一个96孔板内，每孔再加入60μL LDH工作液，25℃，避光孵育30min，用酶标仪在490nm及600nm处检测吸光度(OD值)，计算并比较分析细胞内LDH的释放量。

4.Annexin-V FITC凋亡试剂盒测定细胞凋亡

细胞以2*105个/孔密度接种于六孔板。细胞贴壁后加芬戈莫德预处理12h，之后加入100 μM的6-OHDA继续培养24后将各组细胞用0.25％胰酶消化，取30-50万细胞PBS洗两次，然后使用Annexin-V FITC凋亡试剂盒进行染色，具体步骤按照试剂盒说明书操作。

5.TUNEL

取24孔板，先放入细胞爬片，之后按5万细胞/孔接种SH-SY5Y细胞。贴壁后加入不同剂量的芬戈莫德，12h加6-OHDA继续培养24h。实验结束后取爬片进行如下处理：用丙酮+甲醇(1：1)固定，3～5min，PBS洗，3％H₂O₂室温封闭，0.1％triton x-100打孔，之后用TUNELreaction mixture孵育1h，PBS洗后加converted POD，室温避光30min后加DAB substrate，苏木素复染，封片，显微镜镜下观察细胞凋亡情况。

6.6-OHDA PD动物模型制备

小鼠腹腔注射芬戈莫德0.5mg/kg，连续给药7天。于末次给药后将小鼠麻醉，俯卧位固定在立体定位仪上，从前囟算起，按下面坐标(mm)：点1：AV+1.0,ML+/-2.1,DV-2.9,点2：AP+0.3,ML+/-2.3,DV-2.9向纹状体定位注射6-OHDA制备6-OHDA偏侧损伤PD动物模型。分别于造模后7天、14天、21天注射阿扑吗啡诱导，观察行为学改变。于第21天将小鼠处死，取脑组织进行TH染色及多巴胺及代谢产物含量检测。

7.Western blot检测蛋白表达水平

(1)细胞及组织蛋白提取：RIPA裂解液提取细胞及组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

(2)Western blot:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至硝酸纤维素薄膜，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃过夜，洗3次，每次10分钟，加二抗室温孵育1小时，洗3次，每次10 分钟，化学发光检测蛋白条带。

8.HPLC法测定多巴胺及代谢产物含量

称取少量组织块，加入0.5mol/L甲酸，冰上裂解30min后，4℃，10000g离心10min，取上清，用三蒸水稀释10倍，用0.22μm的滤器过滤备用。液相条件如下：色谱柱Agilentporpshell 120SB-C182.7μm 4.6*100mm，流速0.4ml/min，流动相A：B＝水(含0.05％甲酸)：甲醇，梯度条件：0-4min 5％B；4-10min B升至80％；10-13min B为80％；13.01-22min B 为5％；化合物DA、DOPAC以及HVA的出峰时间分别为4.25min,10.9min,11.6min。根据标准曲线计算多巴胺及代谢产物含量。

实验结果：

1.芬戈莫德可减轻6-OHDA所致SH-SY5Y细胞的存活率降低及LDH释放，如图1所示，SH-SY5Y细胞加不同剂量芬戈莫德预处理12小时，然后加100μM 6-OHDA继续孵育24小时。采用下列方法检测芬戈莫德对6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞的保护作用：(A)MTT法测定细胞存活率；(B)LDH试剂盒测定细胞培养上清液中LDH量。数据均以均数±标准误表示， n＝6。与正常对照组相比，^##p<0.01；与6-OHDA损伤组相比，*p<0.05；**p<0.01。

2.如图2所示，芬戈莫德可减轻6-OHDA所致SH-SY5Y细胞凋亡。SH-SY5Y细胞以2μM和4μM芬戈莫德预处理12小时后加入6-OHDA继续孵育24小时。采用Annexin-V/PI双染及TUNEL染色法测定细胞凋亡情况。(A)采用流式细胞仪Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡，统计结果见图(B)。(C)进一步采用TUNEL染色法测定细胞凋亡情况。数据均以均数±标准误表示，n＝3，与正常对照组相比，^##p<0.01；与6-OHDA损伤组相比，*p<0.05。

3.如图3所示，芬戈莫德可减轻6-OHDA PD小鼠模型黑质纹状体多巴胺能神经元变性，改善阿扑吗啡诱导的行为学。造模21天后，小鼠灌流固定，取脑进行冰冻切片，选取黑质(A) 和纹状体(B)部位片子进行TH染色；同时取纹状体进行Western blot检测TH蛋白表达水平(C)。n＝3。(D)造模后7天、14天、21天给小鼠皮下注射阿扑吗啡，观察各组小鼠行为学改变，n＝6。数据均以均数±标准误表示。与正常对照组相比，^#p<0.05，^##p<0.01；与6-OHDA模型组相比，*p<0.05；**p<0.01。

4.芬戈莫德可增加6-OHDA PD小鼠模型纹状体中多巴胺及代谢产物的含量，如图4所示。动物造模后21天，取纹状体，HPLC法测定(A)DA，(B)DOPAC及(C)HVA含量。数据均以均数±标准误表示，n＝6。与正常对照组相比，^##p<0.01；与6-OHDA模型组相比， **p<0.01。

5.芬戈莫德可促进6-OHDAPD小鼠模型脑组织p-AKT，p-ERK及p-CREB的表达，增加BDNF水平，如图5所示。6-OHDA造模后1天，取小鼠纹状体进行western blot,检测(A) AKT及ERK磷酸化水平，(B)CREB磷酸化水平，及(C)BDNF蛋白表达水平。数据均以均数±标准误表示，n＝3。与正常对照组相比，^#p<0.05，^##p<0.01；与6-OHDA模型组相比， *p<0.05，**p<0.01。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (1)

1.芬戈莫德或其药学上可接受的盐在制备保护6-OHDA损伤的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y药物中的应用。