CN102416014B

CN102416014B - 一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型h1n1流感病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102416014B
Application number: CN2011102694422A
Authority: CN
Inventors: 张国斌; 邴飞虹; 田连起; 李朋伟; 张宾; 李寒冰; 吴宿慧; 栗俞程
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2011-09-13
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2031-09-13
Also published as: CN102416014A

Abstract

本发明涉及生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，可有效解决制备防治甲型H1N1流感病毒药物制剂，用于防治甲型H1N1流感的问题，其解决的技术方案是，由1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素混合在一起组成，二者的重量比是1-5︰1-5，可有效用于制备治疗和预防甲型H1N1流感的药物，实现组合物在制备防治甲型H1N1流感药物中的应用，本发明组合物简单，原料丰富，易生产，有效用于制备治疗和预防甲型H1N1流感的药物，以满足防治甲型H1N1流感的用药问题，是防治甲型H1N1流感药物上的创新。

Description

一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用。

背景技术

甲型H1N1流感病毒[Influenza A (H1N1) virus]是人类最常感染的流感病毒之一，易变异、传染性强、传播快、发病率和死亡率高。从19世纪以来已出现过数次全球性的大流行，最近一次即2009年爆发于墨西哥的H1N1疫潮。

目前，抗甲型H1N1流感病毒的药物主要推荐磷酸奥司他韦，商品名达菲。达菲属于神经氨酸酶抑制剂，是通过抑制神经氨酸酶的活性，起到抑制病毒在人体内尤其是呼吸系统扩散的作用，从而阻断病毒感染循环过程。达菲能够减少通过打喷嚏散播出来的病毒，但不能完全加以制止；此外，该类药物毒副作用强，易导致耐药毒株出现，限制了其临床应用。因此，寻找新的高效低毒的抗流感病毒药物依然任重道远。

1-甲酯基-β-咔啉(1-carbomethoxy-β-carboline)属于β-咔啉类衍生物，β-咔啉类化合物是一类广泛分布于自然界的生物碱，近年研究表明其具有抗肿瘤活性。1-脱氧甘露糖野尻霉素(1-deoxymannojirimycin)是一种由1-脱氧野尻霉素衍生而来的多羟基生物碱，1-脱氧野尻霉素及其衍生物作为糖苷酶抑制剂，具有降血糖、抗肝炎病毒、抑制肿瘤转移等作用，且细胞毒性小。目前，两类化合物在医学领域的用途逐渐受到重视，具有潜在的新药开发前景，然而尚未见应用于甲型H1N1流感病毒的相关报道。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，可有效解决制备防治甲型H1N1流感病毒药物制剂，用于防治甲型H1N1流感的问题。

本发明解决的技术方案是，由1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素混合在一起组成，二者的重量比是1-5︰1-5，可有效用于制备治疗和预防甲型H1N1流感的药物，实现组合物在制备防治甲型H1N1流感药物中的应用。

本发明组合物简单，原料丰富，易生产，有效用于制备治疗和预防甲型H1N1流感的药物，以满足防治甲型H1N1流感的用药问题，是防治甲型H1N1流感药物上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为1︰5，有效用于制备防治甲型H1N1流感的药物。

实施例2

本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为5︰1，有效用于制备防治甲型H1N1流感的药物。

实施例3

本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为2︰4，有效用于制备防治甲型H1N1流感的药物。

实施例4

本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为4︰2，有效用于制备防治甲型H1N1流感的药物。

实施例5

本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为3︰3，有效用于制备防治甲型H1N1流感的药物。

本发明所述的1-甲酯基-β-咔啉、1-脱氧甘露糖野尻霉素，可以利用多种常规提取分离手段从桑叶或鸭跖草等植物中获得，或者通过合成及半合成手段获得，也可商购获得。

本发明组合物具有杀灭甲型H1N1流感病毒的显著作用，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下：

1.本发明生物碱类成分组合物体外抗甲型H1N1流感病毒实验

1.1 实验材料

1.1.1 细胞：狗肾传代细胞(MDCK)。

1.1.2 病毒株：A/PR/8/34(H1N1)病毒株，由武汉大学医学院病毒研究所提供。

1.1.3 药物：本发明药物，1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素均购自Sigma公司，按重量比1:2混合。阳性对照药，磷酸奥司他韦胶囊(达菲)，购自上海罗氏制药有限公司，批号B1212。均以MEM细胞培养液配成溶液，经0.22μm滤膜除菌后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT法测定药物的细胞毒性

单层MDCK细胞培养于96孔培养板，以MEM细胞培养液梯度稀释本发明药物，按每孔0.1ml接种于培养板，每浓度重复8孔，同时设正常对照组和达菲阳性对照组。培养48h后，倒置显微镜下观察细胞病变程度(CPE)，MTT染色，测定细胞存活量，Reed-Muench法计算半数中毒浓度(TD50)。

1.2.2 体外抗甲型H1N1流感病毒作用

单层MDCK细胞培养于96孔培养板，采用三种方式加药：①药物后处理，先吸附0.1ml病毒液(100TCID50)，2h后弃病毒上清，根据细胞毒性实验结果，在无毒浓度范围内，加入梯度稀释的药物0.1ml。②药物共处理，药物与病毒混合作用2h后接种。③药物预处理，先加药物，2h后弃去，再吸附病毒，最后换成药物。三种给药方式均设正常对照组、达菲阳性对照组及病毒对照组，每浓度重复8孔。继续培养，每日观察CPE，约在病毒对照组细胞CPE达到4+时用MTT法染色，酶标仪测570nm处OD值。根据Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)，进而得到药物的治疗指数(TI)＝TD50/IC50。

1.3 实验结果

1.3.1 体外抗甲型H1N1流感病毒作用

研究表明，本发明药物对甲型H1N1流感病毒直接抑制作用不甚明显，有显著的预防和治疗作用，结果见表1。

表1. 本发明药物不同给药方式抗甲型H1N1流感病毒作用

给药方式	IC50(μg/mL)	TD50(μg/mL)	TI
				预处理	120	1380	11.50
共处理	240	1380	5.75
				后处理	110	1380	12.55

1.4 结论

上述实验结果说明，本发明药物具有良好的抗流感病毒活性，对甲型H1N1流感病毒有显著的预防和治疗作用。

2.本发明生物碱类成分组合物体内抗甲型H1N1流感病毒实验

2.1 实验材料

2.1.1 病毒株：A/PR/8/34(H1N1)病毒株，由武汉大学医学院病毒研究所提供。

2.1.2 药物：本发明药物，1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素均购自Sigma公司，按重量比1:2混合。阳性对照药，磷酸奥司他韦胶囊(达菲)，购自上海罗氏制药有限公司，批号B1212。

2.1.3 动物：昆明种小鼠，雌性，体重(20 ± 2)g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK(鄂)2003-0005。

2.2 实验方法

2.2.1 对小鼠最大无毒浓度的测定

将本发明药物倍比稀释为6个剂量组，每组6只小鼠，另设一正常对照组给予等体积生理盐水，灌胃每天2次，连续2天，给药后观察5天，每天记录每组小鼠的中毒情况，进而确定小鼠的灌胃给药剂量。

2.2.2 对流感病毒致小鼠死亡的保护作用

将小鼠随机分为6组，每组10只：①病毒对照组；②给药低剂量组(12.5mg/kg)；③给药中剂量组(25mg/kg)；④给药高剂量组(50mg/kg)；⑤阳性对照组(60mg/kg)；⑥正常对照组。采用致死剂量100ID50的流感病毒滴鼻感染小鼠(正常对照组以等量生理盐水滴鼻)，2h后各组灌胃给药，病毒对照组和正常对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续7天。给药后跟踪观察14天，每天观察并记录动物的反应、出现死亡的时间和死亡数。

2.2.3 对流感病毒感染小鼠肺部病变和病毒增殖的影响

将小鼠随机分为6组，每组10只：①病毒对照组；②给药低剂量组(12.5mg/kg)；③给药中剂量组(25mg/kg)；④给药高剂量组(50mg/kg)；⑤阳性对照组(60mg/kg)；⑥正常对照组。以15ID50流感病毒滴鼻感染小鼠(正常对照组以等量生理盐水滴鼻)，于感染前1天开始灌胃给药，感染后继续给药，病毒对照组和正常对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续7天。末次给药后各组动物称体重，取双侧肺称重，计算肺指数：肺指数＝肺重/体重 × 100；各组取部分肺组织，加入生理盐水研磨，制成肺悬液，3000rpm离心10分钟，取上清按有限稀释法测定病毒滴度；另取部分肺组织，置福尔马林中固定，石蜡包埋，作5μm切片，常规HE染色，显微镜下观察肺组织病理结构变化。采用SPSS软件对结果进行统计分析。

2.3 实验结果

2.3.1 对流感病毒致小鼠死亡的保护作用

研究表明，本发明药物高、中剂量组可使流感病毒感染小鼠的死亡率明显降低，存活时间明显延长，与病毒对照组比较有显著差异，见表2。

表2. 本发明药物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用

组别	剂量 (mg/kg)	死亡数/总数	存活时间 (d)
				给药高剂量组	50	3/10*	12.9 ± 2.4**
给药中剂量组	25	3/10*	12.4 ± 3.1*
				给药低剂量组	12.5	5/10	10.6 ± 2.5
阳性对照组	60	2/10*	17.0 ± 2.9**
				正常对照组	-	0/10**	> 21.0**
病毒对照组	-	8/10	9.5 ± 2.7

注：与病毒对照组比较，*P < 0.05, **P < 0.01

2.3.2 对流感病毒感染小鼠肺指数和病毒滴度的影响

研究表明，本发明药物各剂量组对流感病毒感染小鼠引起的肺炎均有不同程度的抑制作用，肺指数或肺部病毒滴度降低，与病毒对照组比较有显著差异，见表3。

表3. 本发明药物对流感病毒感染小鼠肺指数和病毒滴度的影响 (±S, n=10)

组别	剂量 (mg/kg)	肺指数	病毒滴度
				给药高剂量组	50	0.59 ± 0.16**	4.83 ± 0.92**
给药中剂量组	25	0.65 ± 0.10**	4.72 ± 1.19**
				给药低剂量组	12.5	0.64 ± 0.11**	5.17 ± 0.98*
阳性对照组	60	0.46 ± 0.09**	4.62 ± 0.70**
				正常对照组	-	0.40 ± 0.08**	-
病毒对照组	-	0.92 ± 0.14	6.38 ± 1.25

注：与病毒对照组比较，*P < 0.05, **P < 0.01

2.3.3 对流感病毒感染小鼠肺组织病理变化的影响

正常对照组动物肺组织正常；病毒对照组，肺组织间质性肺炎病变明显，肺泡壁增厚，有大量单个核细胞浸润，肺间质及肺泡壁毛细血管充血，细支气管黏膜上皮细胞脱落，肺泡腔内浆液性渗出；给药各剂量组，与病毒对照组相比肺泡间隔较薄，肺泡壁和细支气管壁单个核细胞浸润数量减少，腔内渗出轻微，各剂量组病变有不同程度的改善；阳性对照组，肺泡病变明显减轻，接近正常。

2.4 结论

上述实验结果说明，本发明药物对甲型H1N1流感病毒有一定的抑制作用，可作为有效成分制备预防或治疗由甲型H1N1流感病毒引起的流行性感冒的药物制剂。实现生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，经济和社会效益显著，是防治甲型H1N1流感药物上的一大创新。

Claims

1.一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，所述的生物碱类成分组合物为1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素混合在一起组成，二者的重量比是2:4。