CN106668015B

CN106668015B - 一种脂肪基酯类化合物wy124在制备抗肠道病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN106668015B
Application number: CN201611191575.1A
Authority: CN
Inventors: 魏艳红; 奚彩丽; 张谦; 李栋; 胡康洪; 尧晨光
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2036-12-21
Also published as: CN106668015A

Abstract

本发明属于抗病毒药物领域。提供了一种新型脂肪基酯类化合物WY124在制备抗肠道病毒药物中的应用。所述脂肪基酯类化合物为式WY124所示的化合物。通过化合物WY124对于EV71、CVB3抑制活性研究实验，抑制EV71、CVB3分别在宿主细胞RD、Hep‑2上产生的细胞病变效应（CPE），增强细胞存活率，降低EV71子代病毒产量，并可抑制EV71感染导致的宿主细胞凋亡，通过WY124抑制EV71的药理学研究，WY124主要抑制EV71在宿主细胞内的复制阶段。表明新型脂肪基酯类化合物WY124有制备抗肠道病毒药物的潜力，该化合物合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产，具有临床应用前景。

Description

一种脂肪基酯类化合物WY124在制备抗肠道病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及脂肪基酯类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用。

背景技术

肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(CV)、埃可病毒及新型肠道病毒(EV)共71个血清型。本属病毒感染分布广泛，临床表现复杂多样。其中肠道病毒71型(EV71)是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑炎，脊髓灰质炎样麻痹，神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974年首次报道以来，EV71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。目前对于由EV71感染的疾病治疗没有特效药物，相关的疫苗于2015年才上市，其预防效果还有待进一步调查。柯萨奇病毒感染可引起多种疾病，如手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、流行性肌炎痛、疱疹性咽峡炎等。已报道的CV共有29个血清型，根据其对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，可将其分为A和B两组，即CVA(CVA1-22,24)和CVB(CVB1-6)。以CVBs的感染最为常见，其中CVB3是CVB六个血清型中致病性最强的一型，是病毒性心肌炎最主要的致病原因。据美国疾病预防控制中心(CDC)统计数据发现，CVB(1-6型)每年可导致约500万人患肠道系统疾病，其中10％-20％是由CVB3引起的急性心肌炎。近年来CVB3引起手足口病的趋势也在上升。目前对于柯萨奇病毒感染无特效药物，临床尚无有针对性的治疗手段。因此开发特异有效的抗EV71和CVB3病毒的药物势在必行。

酯类化合物是一类重要的精细化工产品，广泛应用于药物、材料、食品、增塑剂、溶剂等化工行业。本申请人所在项目组自主合成了一种具有新型结构的脂肪基酯类化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公开了这种化合物的制备方法。未对其生物学活性进行评价。

发明内容

本发明的目的是提供脂肪基酯类化合物WY124在制备抗肠道病毒药物中的应用，所述的WY124，其结构式如下式：

本发明在细胞水平发现WY124具有强的抗EV71、CVB3病毒活性。具体表现为WY124可以强烈抑制这些病毒引起的宿主细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，降低子代病毒产量，抑制EV71感染导致的宿主RD细胞凋亡，且主要作用于EV71感染细胞后的复制阶段。

进一步地，所述的肠道病毒为肠道病毒71型或柯萨奇病毒B3型。

本发明的第二个目的是提供一种抗肠道病毒的药物，包含有效剂量的作为活性成份的化合物WY124，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

进一步地，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

由此表明化合物WY124有制备抗EV71感染的特异治疗药物的潜力，具有临床应用前景。

本发明的脂肪基酯类化合物WY124的制备，参照文献Tetrahedron Letters2015，56，6136–6141的方法，具体以过渡金属钯为催化剂，在吡啶的邻位诱导作用下，在芳环的邻位用高价碘苯作用，进行芳酰氧基化，得到最终酯化产物。

本发明具有以下优点：

1、化合物WY124合成原料价格低廉，易于购得；合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产推广。

2、WY124对于EV71、CVB3均具有高效的抑制活性，易于开发为广谱抗肠道病毒药物。

附图说明

图1是不同浓度的WY124对于EV71、CVB3作用的RD、Hep-2细胞存活率的影响。

图2是WY124对于EV71、CVB3作用的RD、Hep-2细胞CPE的抑制效应。

图3是WY124不同加药方式处理下对于EV71的抑制活性。

图4是WY124对于EV71作用的RD细胞子代病毒产量的影响。

图5是WY124对于EV71引起的RD细胞凋亡的影响。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

【实施例1】对WY124的抗肠道病毒活性进行评估

1、试验方法：

1.1 WY124对于宿主RD、Hep-2细胞的毒性

将RD、Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度的WY124的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD₄₉₂值/细胞对照组平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2 WY124对于EV71、CVB3的抑制活性

将RD、Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID₅₀的EV71、CVB3病毒液分别感染宿主细胞RD、Hep-2 1h，在病毒感染前，感染期间，感染后均加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

CPE观察完毕后，利用MTT方法检测药物对病毒的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式计算药物对EV71和CVB3的抑制率。用SPSS 11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3药物的治疗指数(SI)

SI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

2、试验结果

表1WY124细胞毒性及抗病毒活性

WY124细胞毒性及抗病毒活性测试结果如表1所示。浓度依赖的化合物WY124对于EV71、CVB3作用的RD、Hep-2细胞存活率的影响如图1所示。本发明检测到WY124对于EV71，CVB3病毒都有很强的抑制作用(IC50分别为7.95μg/mL和11.2μg/mL)，优于阳性对照化合物利巴韦林(IC50分别为85.6μg/mL和24.7μg/mL)。利巴韦林对于CVB3的抑制效果良好，但是对于EV71抑制效果较差。WY124在40μg/mL时对于EV71、CVB3的最高抑制率可以达到100％和93％。

WY124抑制病毒引起的宿主细胞CPE效应如图2所示，EV71感染的RD细胞，CVB3感染的Hep-2细胞都呈现出明显的病变效应，EV71聚缩成团，CVB3变圆凋亡，都从细胞板壁脱离，WY124(40μg/mL)处理可以很好的保护细胞，几乎完全抑制两种宿主细胞的病变效应。

【实施例2】化合物WY124抗EV71活性药理学研究

1、试验方法

1.1 WY124对于EV71的直接杀伤作用分析

10⁴TCID₅₀的EV71悬液与化合物100μg/mL WY124在4℃冰箱孵育24h，病毒悬液稀释100倍数，使其小于化合物对于病毒抑制的有效浓度，滴定于提前准备好的已贴壁长满单层的RD细胞中，通过Reed和Muench方法计算病毒悬液的TCID₅₀值。

1.2 WY124对于EV71作用方式的分析

通过三种不同的加药方式(EV71感染前，感染之间，感染之后加入测试化合物)分别测定化合物对于EV71的影响。

(1)预防作用：在EV71感染之前加入WY124作用。

RD细胞在96孔板中长满单层后，吸弃培养液，加入含不同浓度WY124孵育2h，弃掉药物培养液之后，100TCID₅₀的EV71悬液吸附1h，去掉病毒悬液，加细胞培养维持液继续培养。48h时观察细胞CPE，测定细胞存活率。

(2)抑制吸附作用:在EV71感染期间加入类似物作用。

将EV71悬液和不同浓度WY124混匀，直接滴定于已长满单层96孔板的RD细胞中，37℃，5％CO₂培养箱吸附1h后，弃去感染液，加细胞维持液继续培养。48h时测定细胞存活率。

(3)治疗作用：在EV71感染之后加入类似物作用。

RD细胞在96孔板中长满单层后，吸弃培养液，100TCID₅₀的EV71悬液吸附1h，弃去病毒液，加入含不同浓度WY124继续培养，48h时检测细胞CPE和存活率。

2、试验结果

2.1化合物WY124体外直接杀伤EV71作用

化合物WY124处理过的EV71悬液感染RD细胞，48h检测其病毒滴度。结果发现，药物处理组相比病毒对照组，病毒滴度无明显变化(数据未显示)，说明这些类似物均不具有体外直接杀伤EV71作用。

2.2化合物WY124抑制EV71的作用方式

结果显示，WY124预处理细胞对于随后的EV71感染无明显的CPE抑制效应(图3)，WY124与EV71同时孵育感染细胞这种加药方式得出相似的结果，说明WY124不能通过预先作用于细胞来抑制EV71，即对于病毒感染无预防作用，且WY124对于EV71的吸附内化无明显影响。EV71感染之后加入化合物WY124，结果显示了对于EV71强的抑制活性，几乎可以完全抑制EV71导致的细胞病变效应(图3)，由此说明WY124主要作用EV71感染后在细胞内的复制增殖过程，此种具有脂肪基结构的新型酯类化合物可以用于制备抗EV71感染后在细胞内的复制增殖过程的药物。

【实施例3】WY124对于EV71子代病毒产量的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID₅₀EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含40μg/mL WY124的细胞维持液。48h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID50方法测定EV71病毒滴度。

2、试验结果

如图4所示，40μg/mL WY124处理的RD细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度显著下降，说明了化合物对于EV71子代病毒产量强烈的抑制作用。

【实施例4】WY124对于EV71引起的RD细胞凋亡的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY124的细胞维持液。大约48h后，收集细胞，运用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。

2、试验结果

实验结果表明，WY124可以有效抑制EV71导致的细胞凋亡。在病毒对照组细胞凋亡率为95.83％(图5)，正常未处理细胞凋亡率1.76％的情况下(图5)，40μg/mL WY124处理的细胞凋亡率只有9.13％(图5)。可见WY124可以有效保护EV71导致的细胞凋亡。

综上所述，一种具有新型结构的脂肪基酯类化合物WY124具有强的抑制肠道病毒EV71和CVB3的活性，可以完全抑制病毒感染引起的宿主细胞CPE，保护细胞免受病毒感染引发的凋亡，增强细胞存活率，主要作用于EV71在RD细胞中的复制增殖过程，有潜力制备一种临床上有效对抗肠道病毒感染的药物。

Claims

1.脂肪基酯类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用，其特征在于，所述脂肪基酯类化合物为WY124，其结构式如下式：

所述的肠道病毒为肠道病毒71型或柯萨奇病毒B3型。

2.一种抗肠道病毒的药物，其特征在于，包含有效剂量的作为活性成份的化合物WY124，或它们的盐，和药学上可以接受的载体，所述的肠道病毒为肠道病毒71型或柯萨奇病毒B3型。

3.根据权利要求2所述的抗肠道病毒的药物，其特征在于，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂。