CN105287539B - 延胡索甲素的新应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，公开了延胡索甲素在制备抑制呼吸道病毒药物和/或制备预防和治疗呼吸道疾病药物中的应用，从而为临床上病毒性呼吸道疾病的治疗提供一种安全高效毒副作用小的天然小分子化合物。延胡索甲素在无毒性范围内能够有效地抑制呼吸道病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防病毒性呼吸道疾病的药物，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及延胡索甲素的新应用。
背景技术
呼吸道病毒是一大类主要以呼吸道为侵入门户，首先在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖引起呼吸道以及全身感染，造成呼吸道及其他器官损害的病毒的总称。病毒性呼吸道感染，又名病毒性感冒，多数有流行性发生，病种很多，临床表现较为多样，主要分病毒性上呼吸道感染和病毒性下呼吸道感染，前者表现为急性鼻炎、咽炎和喉炎，后者表现为急性气管炎、支气管炎和肺炎。以冬春季发病较多。临床上的急性呼吸感染中有90～95％是由病毒引起的，主要的致病病毒包括流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、风疹病、冠状病毒等。流感病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正粘液病毒科，人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为甲、乙、丙型三类。在核蛋白抗原性的基础上，流感病毒还根据血凝素和神经氨酸酶的抗原性分为不同的亚型，目前在人群中流行的甲型流感病毒为甲3型(H3N2)和亚甲型(H1N1)。呼吸道合胞病毒是在婴幼儿中引起致死性急性呼吸道感染的最重要的病原因子，典型的是细支气管炎和肺炎，但在较大儿童和成人主要引起上呼吸道感染。柯萨奇病毒是一种肠病毒，分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。腺病毒属于腺病毒科，能引起急性发热性咽炎、咽结膜热、急性呼吸道感染、肺炎、眼部感染和胃肠道感染。近年来，随着全球物种活动范围的加大，各种病毒的变异性增强，特别是人与禽等其他种属间的流感病毒相互作用，产生具有高致病性的新变种病毒，人感染高致病性禽流感病例的发生、新发病毒的人群间高传染性及感染者的高死亡率，曾一度引起了全球范围对流感的恐慌，严重影响了人类的日常生活和经济稳定发展。
目前，治疗病毒性呼吸道感染的已上市药物种类依然有限，根据作用机制大致分为两类，一类为M2离子通道阻断剂，主要为20世纪60年代发现的金刚烷胺和金刚乙胺，此类药主要对甲型流感病毒有预防和治疗作用，研究表明此类药物具有神经毒性等毒副作用，而且容易产生耐药性和传染性的耐药株，因此M2离子通道阻断剂的临床使用并不广泛；另一类是神经氨酸酶抑制剂，代表性药物为20世纪90年代发现的扎那米韦和奥司他韦，此类药物对大多数的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年来关于奥司他韦的耐药株也不断有报道。因此，开发更多基于新靶点和新结构类型的呼吸道病毒防治药物具有重要的意义。
延胡索甲素，异名为延胡索碱或紫堇碱，英文名为Corydaline或corydaline，分子式为C22H27NO4，为季胺类生物碱，是罂粟科紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)块茎中的主要有效成分之一。现代药理学表明延胡索甲素不仅有镇痛、兴奋子宫、抗心律失常等作用，还可用于制备为戒毒药物。目前，尚未有延胡索甲素在抗呼吸道病毒及治疗呼吸道病毒感染引起疾病的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供延胡索甲素在制备抑制呼吸道病毒药物和/或制备预防和治疗呼吸道疾病药物中的应用。
延胡索甲素结构式如下：
其中，作为优选，所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和/或柯萨奇病毒。
作为优选，所述呼吸道疾病为由甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒和/或柯萨奇病毒引起的上/下呼吸道急/慢性炎症。
更优选地，所述甲型流感病毒为甲型流感病毒H3N2和/或甲型流感病毒H1N1。
更优选地，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B3型。
更优选地，所述腺病毒为腺病毒7型。
作为优选，所述呼吸道疾病包括流感、肺炎、哮喘、咳嗽、支气管炎、结膜炎、鼻炎、鼻窦炎和扁桃体炎。
作为优选，所述药物为片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、分散剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
本领域中，MDCK细胞感染是目前研究H1N1和H3N2等流感病毒的典型细胞模型。本发明以不同浓度的延胡索甲素测试对MDCK细胞的安全性，结果显示延胡索甲素对MDCK细胞的TC50(半数有毒浓度)为337.13μM，最大无毒浓度为67.67μM。同时，延胡索甲素对流感病毒H3N2的IC50(半数抑制浓度)为10.42μM，选择指数(SI)高达32.36；对流感病毒H1N1的IC50为18.18μM，选择指数(SI)为18.55。IC50浓度远低于最大无毒浓度，表明延胡索甲素能够有效抑制H1N1和H3N2的复制，可用于治疗H1N1和H3N2病毒引起的呼吸道疾病，且安全无毒。
Hep-2细胞感染是目前研究呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3型和腺病毒7等病毒的常用细胞模型。本发明以不同浓度的延胡索甲素测试对Hep-2细胞的安全性，结果显示延胡索甲素对Hep-2细胞的TC50(半数有毒浓度)为462.66μM，最大无毒浓度为135.34μM。同时，延胡索甲素对呼吸道合胞病毒IC50为16.68μM，选择指数(SI)为27.73；对柯萨奇病毒B3型IC50为21.52μM，选择指数(SI)为21.50；对腺病毒7型IC50为17.48μM，选择指数(SI)为26.47。IC50浓度远低于最大无毒浓度，表明延胡索甲素能够有效抑制呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3型和腺病毒7的复制，用于治疗呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3型和腺病毒7病毒引起的呼吸道疾病，且安全无毒。
由以上技术方案可知，本发明提供了延胡索甲素在制备抑制呼吸道病毒药物和/或制备预防和治疗呼吸道疾病药物中的应用，从而为临床上病毒性呼吸道疾病的治疗提供一种安全高效毒副作用小的天然小分子化合物。延胡索甲素在无毒性范围内能够有效地抑制呼吸道病毒的复制，可进一步开发为治疗或预防病毒性呼吸道疾病的药物，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1所示为延胡索甲素对MDCK细胞毒性检测柱形图；
图2所示为延胡索甲素抗流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)检测柱形图；
图3所示为延胡索甲素抗流感病毒A/PR/8/34(H1N1)检测柱形图；
图4所示为延胡索甲素对Hep-2细胞毒性检测柱形图；
图5所示为延胡索甲素抗呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)检测柱形图；
图6所示为延胡索甲素抗柯萨奇病毒B3型(CVB3，Nancy株)检测柱形图；
图7所示为延胡索甲素抗病毒7型(Ad7)检测柱形图。
具体实施方式
本发明公开了延胡索甲素的新应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
抗病毒药物的体外细胞筛选方法主要包括空斑减数法、MTT(噻唑蓝)比色分析法及CPE(细胞病变)观察法等。空斑减数法可以敏感精确地测定病毒的感染程度，检查结果直观可靠，但是其对操作技术要求较高，操作较繁琐，可推广性受限。CPE观察法检测药物毒性是以前用最为常用的，通过在显微镜下逐日观察细胞形态变化，但此法定量不准确，主观性强，难以判断结果，而且统计困难。MTT分析法是使用MTT对细胞进行染色，通过检测其光密度(OD值)的改变可判断细胞的活性，从而实现药物抗病毒活性的定量分析，该法操作简便，在国内外实验室中广泛应用。本发明具体实施方式中将MTT法与CPE法进行结合，通过在光镜下观察细胞的CPE，决定进行MTT测定的最适时间，从而保证结果的准确性。
以下就本发明所提供的延胡索甲素的新应用做进一步说明。
实施例1：延胡索甲素对MDCK细胞的细胞毒性实验
MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；药物：延胡索甲素购于中国药品生物制品检定所。仪器为酶标仪，molecular devices spectraMax M2e；天平，MettlerToledo AL104。
细胞培养：37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。细胞生长液为DMEM培养基，加10％小牛血清、100U/mL的青霉素和链霉素。细胞维持液除新生小牛血清为2％外，其余同细胞生长液。
延胡索甲素的细胞毒性检测：MDCK(狗肾)细胞按7000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，体积为100μL，细胞贴壁后，分别加入浓度为4.23μM、8.46μM、16.92μM、33.84μM、67.67μM、135.34μM、270.68μM、541.36μM的延胡索甲素溶液(采用细胞维持液配制，DMEM+2％小牛血清)，每个浓度重复2个孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48小时后，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mL的MTT溶液100μL，继续培养2h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMSO 150μL，振荡10min，待结晶完全溶解，用酶标仪检测550nm处的OD值，计算细胞存活率。用统计学软件SPSS 20.0的Probit回归法，计算药物TC50。
结果如图1所示，延胡索甲素在67.67μM以下的浓度范围内对MDCK细胞完全没有细胞毒性。基于此结果，本发明实施案例中延胡索甲素细胞水平抗病毒实验(流感病毒)的给药剂量范围为0.53～67.67μM，完全处在安全无毒性浓度范围。
实施例2：延胡索甲素抗甲型流感病毒H3N2和H1N1活性评价实验
MDCK细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；病毒株：流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)，在鸡胚尿囊腔内培养传代，-80℃保存；药物：延胡索甲素购于中国药品生物制品检定所。仪器为酶标仪，molecular devices spectraMax M2e；天平，Mettler Toledo AL104。
实验方法：
将MDCK细胞按2×104细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，体积为100μL，置37℃细胞培养箱中培养24h后，细胞长成单层，将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，每孔加入100μL的100TCID50流感病毒液感染细胞，吸附2小时，弃病毒液，加入200μL含有不同稀释浓度药物(以67.67μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释8个梯度浓度，每个浓度设2个复孔)的细胞维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察各组CPE，在病毒对照组细胞病变达4+时，且细胞对照无病变时，确定为MTT比色的最适时间点(约38小时)，进行MTT比色分析，用酶标仪在550nm处读取OD值。
依下式计算各检测孔中药物对病毒的抑制率：抑制率(％)＝(试验组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)。用统计学软件SPSS 20.0的Probit回归法，计算药物抗病毒的IC50。
结果如图2和图3所示，延胡索甲素明显抑制了流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的复制，且成剂量依赖型，其IC50分别为10.42μM和18.18μM。
实施例3：延胡索甲素对Hep-2细胞的细胞毒性实验
Hep-2细胞(人咽喉癌上皮细胞)购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；
Hep-2细胞培养：37℃，5％CO2加湿培养箱中培养。细胞生长液为DMEM培养基，加10％小牛血清、100U/mL的青霉素和链霉素。
延胡索甲素对Hep-2细胞的毒性检测：Hep-2细胞按5000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，体积为100μL，细胞贴壁后，分别加浓度为4.23μM、8.46μM、16.92μM、33.84μM、67.67μM、135.34μM、270.68μM、541.36μM的延胡索甲素溶液(采用细胞维持液配制，DMEM+2％小牛血清)，每个浓度重复2个孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48小时后，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mL的MTT溶液100μL，继续培养2h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液DMSO 150μL，振荡10min，待结晶完全溶解，酶标仪测550nm处的OD值，计算细胞存活率。用统计学软件SPSS20.0的Probit回归法，计算药物对Hep-2细胞的TC50。
结果如图4所示，延胡索甲素在135.34μM以下的浓度范围内对Hep-2完全没有细胞毒性。
实施例4：延胡索甲素抗甲型呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒活性评价实验
病毒株：呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)、柯萨奇病毒B 3型(CVB3，Nancy株)和腺病毒7型(Ad7)。
Hep-2细胞按1.5×104细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，体积为100μL，置37℃细胞培养箱中培养24h后，细胞长成单层，将孔板中培养基弃去，PBS液洗两遍，每孔加入100μL的100TCID50流感病毒液(RSV、CVB3、Ad7)感染细胞，吸附2小时，弃病毒液，加入200μL含有不同稀释浓度样品(以67.67μM为起始浓度，连续2倍梯度稀释8个梯度浓度，每个浓度设2个复孔)的细胞维持液，同时设细胞对照孔和病毒对照孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察各组CPE，在病毒对照组细胞病变达4+时，且细胞对照无病变时，确定为MTT比色的最适时间点(约38小时)，进行MTT比色分析，用酶标仪在550nm处读取OD值。
依下式计算各检测孔中药物对病毒的抑制率：抑制率(％)＝(试验组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)。用统计学软件SPSS 20.0的Probit回归法，计算药物抑制各病毒的IC50。
结果如图5-7所示，延胡索甲素明显抑制了呼吸道合胞病毒(RSV，Long株)、柯萨奇病毒B3型(CVB3，Nancy株)和腺病毒7型(Ad7)的复制，且成剂量依赖型，其IC50分别为16.68μM、21.52μM和17.48μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.延胡索甲素在制备抑制呼吸道病毒药物和/或制备预防和治疗呼吸道疾病药物中的应用；
所述呼吸道病毒为甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和/或柯萨奇病毒；
所述呼吸道疾病为由甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和/或柯萨奇病毒引起的上/下呼吸道急/慢性炎症。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述甲型流感病毒为甲型流感病毒H3N2和/或甲型流感病毒H1N1。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B3型。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述腺病毒为腺病毒7型。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述呼吸道疾病包括流感、肺炎、哮喘、咳嗽、支气管炎、结膜炎、鼻炎、鼻窦炎和扁桃体炎。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、分散剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
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