CN101991763B - 一种中药组合物在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药药物制剂的用途，具体涉及一种由羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、生石膏、人工牛黄、甘草组成的中药组合物在制备抗流感病毒药物中的应用，具体为该药物在制备抗H5N1亚型禽流感病毒药物中的应用，以及在制备抗H1N1甲型流感病毒药物中的应用。

Description

一种中药组合物在制备抗流感病毒药物中的应用

技术领域：

本发明涉及一种中药药物制剂的用途，具体涉及一种中药组合物在制备抗流感病毒药物中的应用。

技术背景：

流感是一种传染性强，传播速度快的疾病。流感所引起的并发症和死亡非常严重。据世卫组织(WHO)发布的公告，全球每年流感病例为6亿～12亿例，死亡50万～100万人，可见流感对人类的健康危害极大。

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒(avian influenzavirus，AIV)引起的鸟类、禽类烈性传染病，由两种不同的糖蛋白构成，一种为血凝素(hemagglutinin，H或Hp)，另一种为神经氨酸(neuraminidase，N或Np)，H有1～15个亚型，N有1～9个亚型，H与N组合的不同形成了不同类型的病毒。其中H5N1型在2004年亚洲流行的禽流感被鉴定为主要高致病流感病毒。

目前市场上的抗流感的药物主要以西药为主，但西药通常有不同程度的毒副作用，在临床应用上受到一定限制。而中医药临床防治流感具有独特效果，毒副作用小，药源丰富，价格低廉，通过调节整体免疫功能抑制病毒复制，阻止病毒致细胞病变，改善临床症状快等，在治疗流感方面显示出了独特的优势。

本发明涉及的中药组合物原药材组成为：羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、生石膏、人工牛黄和甘草。功能主治为：清热解毒、祛咳止痰。用于小儿急性支气管炎符合痰热咳嗽者，表现为发热、咳嗽、咳吐黄痰、咳吐不爽、舌质红、苔黄腻等。涉及本中药组合物的组成、制备方法与剂型以及质量控制方法等内容在中国发明专利02129192.6，200410000911.0中有较为详细的描述。该药物已获得国家食品药品监督管理局批准上市销售，药品的通用名称为金振口服液，药品批准文号为国药准字Z10970018。

发明人在临床实践中意外地发现，本中药组合物具有非常好抗流感病毒作用，发明人对该药进行了药效学研究，证明其疗效确切。

发明内容：

本发明提供了一种由青蒿、栀子、金银花组成的中药组合物(在本发明中被命名为“金振口服液”)在制备抗流感病毒药物中的应用。

所述金振口服液主要用于制备抗H5N1亚型禽流感病毒药物以及抗H1N1甲型流感病毒药物中的应用。

为了更好地理解本发明，发明人提供以下研究资料，说明本发明的技术效果，但下述实验用于进一步说明但不限于本发明。

实验一：金振口服液对禽流感病毒抑制作用的实验研究

1.实验材料

1.1受试药物：金振口服液，由江苏康缘药业股份有限公司生产；

1.2病毒株：H5N1亚型禽流感病毒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室提供。

1.3鸡胚：10日龄SPF鸡胚，由中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

2.实验方法

2.1病毒EID₅₀的测定

将H5亚型禽流感病毒10倍系列稀释，接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度5枚鸡胚(0.1ml/胚)，测定病毒的半数感染剂量(EID₅₀)。

2.2药物对鸡胚的最大无毒剂量

将金振口服液原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64生理盐水稀释液分别接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚(0.1ml/胚)。将接种的鸡胚置37℃温箱中培养96小时。24小时以内死亡的鸡胚去掉，记录鸡胚死亡情况。

分别取10^8.25EID₅₀H5N1亚型禽流感病毒悬液与金振口服液原液、1∶5、1∶10、1∶20生理盐水稀释液按1∶9混合，在20±1℃条件下作用10分钟和30分钟后，再用灭菌生理盐水做10倍递进稀释。对照组用灭菌生理盐水代替金振口服液，同法处理；稀释液接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚(0.1ml/胚)。将接种的鸡胚置37℃温箱中培养，记录鸡胚死亡情况。24小时以内死亡的鸡胚去掉，24小时以后的鸡胚及时取出，至96小时全部取出，逐个取尿囊液做血凝(HA)试验，血凝试验阳性者判为鸡胚感染。

按照鸡胚感染的结果，按下列方程式计算试验组和对照组鸡胚感染的阳性率、样本含EID₅₀量的对数与抑制率。

样本含EID₅₀量的对数＝L-d(S-0.5)

(L为最低稀释倍数的对数；d为稀释度间对数的差；S为各稀释列阳性率之和)

3.实验结果

3.1药物对鸡胚的最大无毒剂量

金振口服液原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64生理盐水稀释液组鸡胚均无一死亡。结果见表1。

表1金振口服液对鸡胚的最大无毒剂量

3.2药物对病毒抑制作用试验

金振口服液原液、1∶5、1∶10、1∶20生理盐水稀释液与10^8.25EID₅₀H5N1亚型禽流感病毒悬液作用10分钟，病毒抑制率分别为99.82％、43.76％、0、0；与10^8.25EID₅₀H5N1亚型禽流感病毒悬液作用30分钟，病毒抑制率分别为100％、99.94％、32.39％、0。结果见表2。

表2不同浓度金振口服液对N1亚型禽流感病毒的抑制作用(n＝5)

4.结论

中草药抗流感病毒的基本原理是扶正祛邪或驱邪扶正。由于每味中药组成成分比较复杂，各组分之间相互作用，而组成中药方剂其作用机理更为复杂。目前，中药抗病毒的途径主要有2条：(1))直接抑制病毒。主要有阻断病毒繁殖过程的吸附、穿入、复制、成熟中的某一环节，从而达到抗病毒感染的目的；(2)间接抑制病毒。由于病毒感染人体后，必定寄生在人体的细胞中才能生存、繁殖，某些药物在抗病毒的同时，还能提高机体的免疫功能，通过促进机体的特异性和非特异性免疫功能而达到抑制病毒的目的，或是通过促进诱生干扰素作用等达到抗病毒的目的。

金振口服液为纯中药注射液，由青蒿、金银花等组成，具疏风散热，清热解毒之功效，主要用于呼吸道感染引的高热。本试验发现，金振口服液在体外可以抑制禽流感病毒在鸡胚上的增殖，从而保证了鸡胚的存活，具有一定抗禽流感病毒的作用。

实验二：金振口服液对流感病毒抑制作用实验研究

1.实验材料

1.1细胞与病毒

MDCK细胞(犬肾细胞)，流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(甲型流感病毒)，均由病毒生物技术国家工程研究中心北京金迪克生物技术研究所提供。

1.2药物与试剂

(1)金振口服液，江苏康缘药业股份有限公司，规格：1.84g生药/10mL/支(用蒸馏水稀释50倍用于体外试验，3.68mg/mL)；

(2)病毒唑注射液，天津药业集团新郑股份有限公司；规格：1毫升：10毫克×10支；

(3)达菲，上海罗氏制药有限公司，规格：75mg；

(4)DMEM培养基，北京清大天一生物技术有限公司；

(5)小牛血清，杭州四季青药物试剂有限公司；

(6)胰酶、四甲基偶氮唑兰(MTT)均购自Amresco公司；

(7)DMSO购自Sigma公司。

1.3受试动物

BALB/c小鼠，清洁级，体重：14～16g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证：SCXK(京)2007-0001。

1.4仪器

(1)96孔细胞培养板，Corning公司；超净工作台，北京瑞泽康生物科技有限公司；

(2)CO₂恒温培养箱，日本SANYO公司；

(3)倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；

(4)酶标仪，美国伯乐公司。

2.实验方法

2.1药物对细胞毒性实验

96孔细胞板中每孔接种约5×10⁴个MDCK细胞，于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜，弃去细胞培养液，加入金振口服液20μL(3.68mg/mL)于37℃，5％CO₂培养箱中培养5天，光学显微镜下观察细胞形态，同时设立病毒唑(40μg/mL)和无药物的阴性对照。于第5天每孔中加入10μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h，弃去培养液后加入100μL DMSO，37℃振荡10min，测定570nmA(吸光度)值。设立4孔平行，取4个吸光度平均值进行计算，观察金振口服液对细胞的毒性。试验重复三次。

2.2体外抗病毒实验

2.2.1抗病毒病变观察

在24孔板中培养的MDCK细胞上加入流感病毒(A/PR/8/34)5TCID50，在33℃5％CO₂温箱内孵育1h，Hanks液洗去病毒液，加入细胞维持液(金振口服液：3.68mg/mL，100μL；病毒唑：40μg/mL，100μL)，同时设病毒对照、细胞对照，置33℃5％CO₂培养箱内培养，连续观察5天。

2.2.2空斑形成抑制实验

在六孔板中刚长满的单层MDCK细胞，弃去生长液，用Hanks液洗涤两遍，根据流感病毒A/PR/8/34的预实验空斑滴定结果，每孔加入10^-6倍稀释的流感病毒0.5mL，于33℃，5％CO₂温箱内孵育1h，洗去病毒液，加入适量病毒唑(终浓度40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，一孔为空白对照)，金振口服液(终浓度368μg/mL，184μg/mL，92μg/mL，46μg/mL，23μg/mL，一孔为空白对照)，加入含1％琼脂糖、5μg/mL TPCK(L-苯甲磺酰苯丙氨酰氯甲酮)处理的胰酶、2.5％Herps缓冲液、pH 7.2-7.4的DMEM琼脂糖第一层覆盖液覆盖细胞，继续在33℃，5％CO₂温箱内孵育。培养72h后，加入含3.33％中性红的第二层覆盖液过夜染色，直接观察空斑。根据空斑数目计算每一浓度相对于阴性对照的抑制率，计算其IC₅₀。以病毒唑作为空斑形成抑制活性的阳性参照。

2.3体内抗病毒实验

首先做预实验测定流感病毒(A/PR/8/34)的LD₅₀。80只小鼠随机分为4组，每组20只。即(1)正常对照组：ig给予蒸馏水，(2)模型组：ig给予蒸馏水，(3)阳性组：ig给予达菲水溶液，剂量为20mg/kg，(4)金振口服液：ig给予金振口服液，剂量为3.22g生药/kg，体积均为10mL/kg。分别于攻毒前4h及攻毒后连续给药5d，每天1次。乙醚麻醉后，10LD₅₀剂量鼻腔接种流感病毒50μL。每组取10只连续观察14d，记录小鼠死亡情况(计算死亡率及平均生存时间)，另外10只分别于首次给药后4、8d将小鼠处死，无菌取肺，测定鼠肺湿重，鼠肺研磨成肺悬液后测定TCID₅₀，鼠肺经甲醛固定后做组织切片，HE染色，光镜下观察肺组织形态学变化。结果用SPSS统计学软件处理，计数资料用χ²检验，计量资料采用t检验进行组间比较，结果用X±SD表示。

3.实验结果

3.1药物对细胞毒性实验

三次试验结果显示，在本实验条件下，金振口服液20uL(3.68mg/mL)时，细胞状态和阴性对照组一致，没有细胞毒性；阳性对照药物病毒唑40μg/mL对细胞无任何毒性，选此浓度进行体外试验。

3.2体外抗病毒实验

3.2.1抗病毒病变观察

结果见表3，结果表明，金振口服液在体外具有一定抑制流感病毒致细胞病变作用。

表3金振口服液对病毒致细胞病变作用的影响

注：-无细胞病变；±延缓细胞病变；+1/4以下细胞病变；++1/4-1/2的细胞有病变；+++1/2-3/4的细胞有病变；++++3/4以上的细胞有病变。

3.2.2空斑形成抑制实验

结果见表4，结果表明，在本实验条件下，金振口服液的IC₅₀为75μg/mL，说明在体外可以抑制流感病毒生长，具有一定的抗流感病毒作用。

表4金振口服液对流感病毒的空斑形成抑制作用

3.3体内抗病毒实验

3.3.1对小鼠生存率和平均生存时间的影响

模型组在攻毒后的第5d开始死亡，到第10d存活率为0，平均生存时间为7.1d；金振口服液组在攻毒后的第6d开始死亡，到第8d存活率降到最低，存活率为50％，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.01)，平均生存时间为10.6d；阳性组及正常对照组存活率均为100％，平均生存时间大于14d，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.01)。结果见表5。

表5金振口服液对小鼠生存率和平均生存时间的影响(n＝10)

与模型组比较：^**P＜0.01。

3.3.2染毒后小鼠肺内病变情况

结果见表6，实验结果表明，与模型组比较，金振口服液组的小鼠肺湿重及肺病毒滴度均显著下降(P＜0.05)。

表6金振口服液对10LD50流感病毒染毒小鼠的保护作用

与正常对照组比较：^**P＜0.01；与模型组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

3.3.3对病毒感染小鼠肺病理变化的影响

实验结果见附图1：正常对照组肺组织切片显微图，附图2：模型组组肺组织切片图，附图3：阳性组组肺组织切片图，附图4：金振口服液组组肺组织切片图，病理组织学观察发现：模型组肺组织有大面积的肺实变，肺泡间隔明显增宽，有大量淋巴细胞浸润，可见肺泡上皮细胞增生和肺泡缩小，肺组织含气量显减少，肺泡腔有液体渗出与出血灶；金振口服液组小鼠肺组织病变较模型组减轻，肺泡间隔略有增宽，可见淋巴细胞浸润，显示出一定的保护效应。

4.结论

本试验结果表明，金振口服液在一定浓度下，没有任何细胞毒性；金振口服液在体外可以抑制流感病毒生长，具有一定的抗流感病毒作用；在小鼠攻毒保护实验中通过存活率、平均存活时间、鼠肺实变、鼠肺内病毒TCID50滴度及鼠肺病理切片等多个参数评定显示金振口服液具有一定的抗流感病毒活性。

通过以上实验可以证明，金振口服液具有抗流感病毒的作用，其中具有很强的抗H5N1亚型禽流感病毒以及抗H1N1甲型流感病毒的作用。

附图说明

附图1：正常对照组肺组织切片显微图；

附图2：模型组组肺组织切片显微图；

附图3：阳性组组肺组织切片显微图；

附图4：金振口服液组组肺组织切片显微图。

具体实施方式：

【药品名称】金振口服液

【成分】羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、生石膏、人工牛黄、甘草。

【功能主治】清热解毒，祛痰止咳。用于小儿急性支气管炎符合痰热咳嗽者，表现为发热，咳嗽，咳吐黄痰，咳吐不爽，舌质红、苔黄腻，以及H5N1亚型禽流感、甲型H1N1流感。

【用法用量】口服，6个月～1岁，一次5ml，一日3次；2岁至3岁，一次10ml，一日2次；4～7岁，一次10ml，一日3次；8～14岁，一次15ml，一日3次，疗程为5～7天；或遵医嘱。

Claims (3)

1.金振口服液在制备抗流感病毒药物中的应用，其特征在于金振口服液是由羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、生石膏、人工牛黄、甘草组成的中药组合物制备的。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述流感病毒为H5N1亚型禽流感病毒。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述流感病毒为H1N1甲型流感病毒。

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