CN100435786C - 金丝桃素在制备抗rna病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金丝桃素的新用途。本发明发明人的实验证实,金丝桃素对RNA病毒,特别是禽流感病毒,口蹄疫病毒和犬瘟热病毒具有较好的抑制和灭活效果,可以该化合物为活性成分,制备成抗RNA病毒药物。该抗病毒药物可用于临床防治和治疗禽流感、犬瘟热、口蹄疫等由RNA病毒引发的疾病,对禽业、犬业及畜牧养殖业等意义重大。此外,我国草药资源丰富,该药物具有工业化生产的可行性。综上所述,金丝桃素将在医学和生物制药领域,尤其是抗RNA病毒药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的新用途,特别是涉及金丝桃素在制备抗RNA病毒药物中的应用。
背景技术
金丝桃素(hypericin 4,4,5,5,7,7-六羟基-2,2-二甲基-中位-萘并二蒽酮),是贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)中最具生物活性的物质,具有抗抑郁、抗菌消炎和光敏活性等。
相对于DNA病毒,RNA病毒具有高变异性的特点,常见的RNA病毒包括肝炎病毒、流感病毒、犬瘟热病毒、口蹄疫病毒等。
近年来,高致病性禽流感在世界范围内大规模爆发,引起世界卫生组织及全球的高度重视。为防止疫情进一步蔓延,世界各国都在加紧禽流感病毒疫苗和抗流感病毒药物的研究。
犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的大的一种高度接触性、致死性传染病。该病一年四季均可发生,给各地的养犬业造成严重危害。
口蹄疫是牛、羊、猪等的一种急性、热性传染病,人也可感染,是一种人兽共患病。该病发病率较高,且传播迅速,给全球的畜牧养殖业造成较大损失。因此,迫切需要一种效果显著的抗口蹄疫病毒药物。
发明内容
本发明的目的是提供金丝桃素在制备抗RNA病毒药物中的应用。
本发明发明人的实验证实,金丝桃素对RNA病毒,特别是禽流感病毒(包括H5N1、H9N2亚型禽流感病毒等),口蹄疫病毒和犬瘟热病毒具有较好的抑制和灭活效果,可以该化合物为活性成分,制备成抗RNA病毒药物。
需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明所用的金丝桃素可以从自然界中的贯叶连翘中提取,也可以用化学方法进行合成。
上述药物的用量一般为:治疗剂量为5-10mg金丝桃素/kg体重,每天给药一次,疗程为3至5天;预防剂量为0.05-0.1mg金丝桃素/kg体重,将金丝桃素拌入饲料中饲喂。
实验表明,金丝桃素对RNA病毒,特别是禽流感病毒(包括H5N1、H9N2亚型禽流感病毒等),口蹄疫病毒和犬瘟热病毒具有较好的抑制和灭活效果,可以其为活性成分,制备成抗RNA病毒药物。该抗病毒药物可用于临床防治和治疗禽流感、犬瘟热、口蹄疫等由RNA病毒引发的疾病,对禽业、犬业及畜牧养殖业等意义重大。此外,我国草药资源丰富,该药物具有工业化生产的可行性。综上所述,金丝桃素将在医学和生物制药领域,尤其是抗RNA病毒药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、金丝桃素对禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的体外抗病毒试验
现对金丝桃素进行禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的体外抗病毒试验,该试验采用的禽流感H5N1、H9N2亚型病毒毒株分别为A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)和A/Chicken/ShanDong/6/96(H9N2)(由依托于中国农科院哈尔滨兽医研究所的农业部动物流感工程重点实验室提供),具体试验过程如下:
一、预备试验
1、测定病毒EID50
将禽流感H5N1、H9N2亚型病毒进行10倍系列稀释,接种10日龄SPF(specificpathogen free,无特定病原)鸡胚(由中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供),0.1mL/胚,测定病毒的半数感染剂量(EID50)。经测定,禽流感H5N1亚型病毒的EID50为107.63,禽流感H9N2亚型病毒的EID50为108.17。
2、测定金丝桃素对鸡胚的最大无毒剂量
将金丝桃素自1.7mg/mL起进行系列稀释,分别接种10日龄SPF鸡胚,0.1mL/胚,置37℃温箱中培养96h。将24h内死亡的鸡胚去掉,记录鸡胚死亡情况。结果金丝桃素对鸡胚的最大无毒剂量为0.34mg/mL。
二、测定金丝桃素对禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的杀灭率
采用Klein-Defors悬浮方法对禽流感H5N1和H9N2两种强、弱病毒进行杀灭试验,分别取107.63EID50禽流感H5N1亚型病毒悬液、108.17EID50禽流感H9N2亚型病毒悬液与不同浓度(0.34、0.068、0.0136、0.0027、0.0005mg/mL)的金丝桃素制剂按1∶9混合,在20±1℃条件下作用10min和30min后,每种混合液再用灭菌生理盐水做10倍递进稀释,接种10日龄SPF鸡胚(尿囊腔接种),0.1mL/胚,置于37℃温箱培养,去掉24h以内死亡的鸡胚,并及时取出24h以后的死胚,至96h全部取出,逐个取尿囊液做血凝(HA)试验,HA试验阳性(+)者判为鸡胚感染。根据鸡胚感染结果,并按下述公式计算鸡胚感染阳性率、样本含EID50与病毒杀灭率:以下列方程式计算试验组和对照组鸡胚感染的阳性率、样本含EID50量与病毒杀灭率。
鸡胚感染的阳性率=HA(+)鸡胚数/接种鸡胚数;
样本EID50的对数=L-d×(S-0.5)(L为最低稀释倍数的对数;d为稀释度间对数的差;S为各稀释系列阳性率之和);
病毒杀灭率=(对照样本EID50-试验样本EID50)/对照样本EID50×100%。
结果浓度为0.34、0.068、0.0136、0.0027、0.0005mg/mL的金丝桃素生药制剂与107.63EID50H5N1亚型禽流感病毒作用10min,病毒杀灭率分别为99.99%、99.99%、90%、0、0;作用30min,病毒杀灭率分别为100%、99.99%、94.37%、32.39%、0。上述不同浓度的金丝桃素制剂与108.17EID50H9亚型禽流感病毒作用10min,病毒杀灭率分别为99.99%、99.99%、93.23%、0、0;作用30min,其病毒杀灭率分别为100%、99.99%、94.37%、32.39%、0。上述试验结果表明金丝桃素在0.34mg/mL浓度(生药)时与禽流感病毒作用30min,对病毒的杀灭率可达到100%,具有较好的杀病毒作用;金丝桃素在0.068-0.34mg/mL浓度(生药)范围内与禽流感病毒作用10min,对病毒的杀灭率可达到99.99%以上,具有良好的杀病毒作用。
实施例2、金丝桃素对禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的体内抗病毒试验
实验动物:
28日龄非免疫石歧杂黄鸡(购自广东省农业科学院畜牧研究所鸡场),15日龄和25日龄各抽血1次检测禽流感抗体,抗体阴性者用于实验。
现对金丝桃素进行禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的体内抗病毒试验,该试验采用的禽流感H5N1、H9N2亚型病毒毒株分别为A/Duck/GuangDong/173/2004(H5N1)和A/Chicken/guangXi/KMI1999(H9N2)(由华南农业大学禽病研究室提供),具体试验过程如下:
一、金丝桃素制剂对人工感染H5N1亚型禽流感病毒的鸡的体内抗病毒试验
将非免疫28日龄石歧杂黄鸡随机分为下列5组:金丝桃素高剂量组(给药剂量为0.0216g/kg)、金丝桃素中剂量组(给药剂量为0.0108g/kg)、金丝桃素低剂量组(给药剂量为0.0054g/kg)、感染不给药组(攻毒不给药)以及健康对照组(不攻毒不给药)。其中,用药组于攻毒12h后,按上述不同剂量灌服给药。实验期间,每天观察鸡的临床表现,并对各试验组每天用棉拭子随机采数只鸡的咽喉及泄殖腔粘液,将蘸取粘液的棉拭子立即放入Hanks(按《动物病毒学》(第二版)中的方法配制,所用试剂均为分析纯)中,振荡,使粘液分散,再离心,取上清抽提总RNA,用RT-PCR方法检测病毒感染情况。对试验过程中死亡的鸡及试验结束后存活的鸡采集心、肝、肺、脾和肾脏器器官,研磨后离心,取上清抽提总RNA,用RT-PCR方法检测各组鸡的病毒感染情况。
攻毒后1-14d各组鸡的病毒感染情况检测结果如表1所示,在整个试验过程中,金丝桃素高剂量和中剂量组无鸡只死亡,扑杀后进行尸体剖检,未见任何异常;试验结束后存活鸡只的病毒感染情况检测结果均为阴性。金丝桃素低剂量组仅在攻毒后第2d死亡3只,而感染对照组鸡只在接种禽流感病毒后10d内大量死亡,生前表现出典型的禽流感临床症状。试验结果表明,在高、中剂量下,金丝桃素对H5N1亚型禽流感病毒有很好的抑制作用,在用药后的鸡只体内检测不到禽流感病毒,而低剂量的金丝桃素对H5N1亚型禽流感病毒也有较好的抑制作用。
表1攻毒后1-14d采集各实验组鸡咽喉及泄殖腔拭子的病毒感染情况
注:“+”表示病毒分离阳性,“-”表示病毒分离阴性。
二、金丝桃素制剂对人工感染H9N2亚型禽流感病毒的鸡的体内抗病毒试验
用与步骤一相同的方法进行金丝桃素制剂对人工感染H9N2亚型禽流感病毒的鸡的体内抗病毒试验。
结果攻毒后1-14d,所有实验鸡只均未出现死亡,扑杀后进行尸体剖检,各组鸡的病毒感染情况检测结果如表2所示。试验结果表明,在高、中剂量下,金丝桃素对H5N1亚型禽流感病毒有很好的抑制作用,在用药后的鸡只体内检测不到禽流感病毒,而低剂量的金丝桃素对H9N2亚型禽流感病毒也有较好的抑制作用。
表2攻毒后1-14d采集各实验组鸡咽喉及泄殖腔拭子的病毒感染情况
注:“+”表示病毒分离阳性,“-”表示病毒分离阴性。
实施例3、临床扩大实验
在越南禽流感高发地区的河西省(Ha Tay)、河南省(Ha Nam)、太原省(ThaiNguyen)、清化省(Thanh Hoa)、太平省(Thai Binh)、宁平省(Ning Binh)、南定省(Nam Dinh)及海防市(Hai Phong)进行临床扩大实验,以验证金丝桃素对禽流感具有防治作用,实验分两部分:1)检测金丝桃素对禽流感的防治效果;2)检测金丝桃素对禽流感的预防效果及对鸡产蛋率的影响。具体方法为:对鸡饲喂添加金丝桃素的饲料,250g金丝桃素/T饲料,其余饲养条件与常规饲养方法相同,15天后,检测实验鸡只的血清中是否产生禽流感病毒H5N1亚型抗体,结果所有实验鸡只的血清中均未检测到禽流感病毒H5N1亚型抗体,表明所有鸡只均未感染禽流感H5N1亚型病毒。同时,统计实验鸡只的产蛋率,结果每吨饲料添加250g金丝桃素对鸡产蛋率和损耗率没有任何影响,并且无一只鸡感染禽流感病毒(禽流感病毒检测结果为阴性)。经观察和统计,实验地区的养鸡场和农户用上述添加有金丝桃素的饲料饲喂15天,期间没有发生鸡只病死及禽流感感染,而实验期间其它各地陆续有鸡只感染禽流感病毒的报道,证明金丝桃素能有效地预防禽流感发生。
实施例4、金丝桃素对患犬瘟热病犬的抗病毒试验
选择自然患犬瘟热的病犬20例,将金丝桃素配成浓度为100mg/L的注射液,对病犬进行皮下注射,连续注射3日,每日1次。结果病犬痊愈,无一例死亡,表明金丝桃素对犬瘟热病毒有显著的抑制作用,在临床上对犬瘟热具有较好的治疗效果。
实施例5、金丝桃素对口蹄疫病毒的抗病毒试验
病毒株和宿主细胞:
O型口蹄疫OS/99病毒株:经BHK-21细胞增殖传代,由兰州生物制药厂提供;
BHK-21细胞:经常规传代培养,购自中国兽医药品监察所。
实验动物:
半岁的健康小牛犊,未接受任何免疫,体内未检出口蹄疫抗体。
配制药液:
将金丝桃素溶于二甲基亚砜(DMSO),配制成浓度为100mg/mL的原液。
一、金丝桃素对口蹄疫病毒的体外抗病毒试验
1、金丝桃素对BHK-21细胞的毒性试验
通过细胞形态学观察,确定不同浓度金丝桃素对BHK-21细胞的毒性作用。用Mosmann等(Mosmann T.Rapid colorimet ric assay for cellular growth andsurvival application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J ImmunolMethods,1983,65(1-2):55-63.)建立的MTT比色分析法判定各孔中存活细胞的增殖代谢情况及细胞毒性反应,将不能使细胞产生CPE的药物最大浓度视为最大无毒剂量。结果金丝桃素在<10mg/mL的浓度范围内,对BHK-21细胞无毒性作用。
2、金丝桃素对口蹄疫病毒的体外抗病毒试验
将TCID50为1×107/mL的FMDV接入铺满单层BHK-21细胞的96孔板,37℃吸附1h,然后弃去培养液(购自Gibco公司),加入含不同浓度(浓度依次为0.01、0.02、0.03、0.05mg/mL)金丝桃素的培养液,同时设FMDV病毒对照孔(即为阳性对照)和BHK-21细胞对照孔(即为阴性对照),充O2,光照,37℃培养,待病毒对照孔病变达++++(75~100%的细胞有病变,甚至脱落),细胞对照正常时测定结果。按相同方法,重复三次试验。结果金丝桃素能有效抑制FMDV所致的CPE(致细胞病变作用);在较低浓度(0.01~0.02mg/mL)下其抗FMDV作用呈浓度依赖性,随着药物浓度的升高,其抗病毒活性呈上升趋势;当其最佳抗病毒作用浓度达到最大值(0.05mg/mL)时,药物的抗病毒作用呈现阈值现象,此后,随着药物浓度的升高,抗病毒作用无明显变化。
3、金丝桃素对口蹄疫病毒的体外抗病毒试验效果的电镜观察
将TCID50为1×107/mL的FMDV接入铺满单层BHK-21细胞的96孔板,37℃吸附1h,然后弃去培养液,加入含浓度为3mg/mL金丝桃素的培养液,同时设FMDV病毒对照孔,充O2,光照,37℃培养3h。培养结束后,弃掉培养液,用胰酶消化细胞,然后将细胞收集于离心管中,4℃、1000rpm离心10分钟,收集细胞团,用固定液固定,并按常规电镜样品制备程序脱水、包埋、切片、染色,然后在透射电镜下观察并拍照。结果感染了FMDV的BHK-21细胞接种金丝桃素后,与病毒对照组相比,细胞中的病毒粒子密度大大降低,在细胞质中可以看到球形包块,里面充满未成熟的病毒颗粒,表明金丝桃素对FMDV的复制装配过程有一定的限制作用。
上述试验结果表明金丝桃素在体外对FMDV增殖具有良好的抑制作用,可用于制备抗口蹄疫病毒药物。
4、检测光活化的金丝桃素对FMDV在宿主细胞中增殖的影响
用H3-UR(H3尿密啶核苷)掺入法检测光活化的金丝桃素对FMDV在宿主细胞中增殖的影响,具体方法为:将TCID50为5×106/mL的FMDV接入铺满单层BHK-21细胞的96孔板,37℃吸附1h,然后弃去培养液,加入含不同浓度(浓度依次为0.01、0.03、0.05mg/mL)金丝桃素的培养液,同时设FMDV病毒对照孔和BHK-21细胞对照孔,充O2,光照,并于结束培养3h前加入H3-UR。培养结束后,弃掉培养液,用胰酶消化细胞,然后将细胞收集于离心管中,1000rpm离心10分钟,收集细胞团,洗涤细胞3次,加入细胞裂解液(购自Gibco公司),裂解细胞,再加入等量闪烁液(购自Gibco公司)。测每分钟脉冲数(cpm),表示H3-UR的渗入量。结果金丝桃素药物组BHK-21细胞中的H3-UR掺入量与病毒对照组相比明显减少,且金丝桃素在较低的浓度(0.01mg/mL)下对FMDV的抑制作用呈浓度依赖型,当达到一定浓度(0.03mg/mL)时,随着药物浓度的增加,对FMDV增殖的抑制作用逐渐减弱。
二、金丝桃素对口蹄疫病毒的体内抗病毒试验
将FMDV接种于实验小牛的舌皮内。将3头小牛(27#,36#,43#)染毒后12h,以0.0145g/kg的金丝桃素灌服,同时1头设为阳性对照组(染病不给药组)。结果给药组(27#,36#,43#)其中27#牛舌面在攻毒后第三天(约70h)出现长半径4cm,短半径约2cm的椭圆形轻微溃疡,两侧无症状;36#攻毒部位无明显症状。43#的两侧攻毒部位,其中一侧出现轻微溃疡,但蹄部并未发现明显水疱或溃疡。阳性对照组(39#)在攻毒后约24h后观测,舌面已经有水疱部分溃烂,48h后舌面大面积溃烂,整张舌皮脱落,并且蹄部有三蹄明显的出现水疱,再经过3-4天恢复。表明金丝桃素在体内对FMDV增殖也具有良好的抑制作用,可用于制备抗口蹄疫病毒药物。
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